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LECHE DE CABRA TRANSGÉNICA QUE EXPRESA LISOZIMA HUMANA PARA

RECUPERACIÓN Y TRATAMIENTO DE PATÓGENOS GASTROINTESTINALES


Resumen
La lisozima es una importante proteína inmune no específica en la leche humana, que modula la
respuesta inmune contra las infecciones bacterianas. El objetivo de este estudio fue caracterizar la
leche de una cabra transgénica que expresa una re-combinación de lisozima humana (rhLZ) en la
leche, también probar la actividad antibacteriana in vitro de la leche rhLZ contra los patógenos del
tracto gastrointestinal. Muestras de leche recolectadas de cabras Tg y no transgénicas (nTg) de la 3ª
a la 11ª semana de lactancia se sometieron a análisis fisicoquímicos, semicuantificación de rhLZ, y a
la actividad antimicrobiana de rhLZ contra Micrococcus luteus, Shiguella sonnei y Enterococcus
faecalis. Viabilidad y la migración celular se estudiaron en células epiteliales íleon (IEC-18) en
ausencia o presencia de E. faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli (EPEC) y S. sonnei.
La expresión de los genes ZO-1 e IL-6 fue evaluada en IEC-18 para evaluar el efecto de la leche rhLZ
en la función de barrera intestinal y la inflamación intestinal. Los parámetros fisicoquímicos entre la
leche de cabra transgénica y la leche de cabra no transgenica nTg fueron similares y dentro de los
valores normales para el consumo humano, con concentraciones de HLZ similares entre la leche Tg
(224 μg / mL) y humano (226 μg / mL). La leche Tg tenía actividad bactericida contra M. luteus,
ningún efecto bactericida sobre S. sonnei, y relativa a la sensibilidad discreta contra E. faecalis que
los controles. Se observaron mejores parámetros de migración en células en cultivo con nTg y Tg que
los controles. En presencia de patógenos, la leche Tg promovió parámetros migratorios mejorados
que los controles, a excepción de S. sonnei, con números de células inferiores en presencia de
muestras de nTg y E. faecalis y S. sonnei. No se observaron diferencias en los patrones de expresión
relativa de ZO-1 en células cultivadas, con expresión aumentada en IL-6 en células expuestas a leche
nTg que en los controles, siendo el grupo Tg similar a todos los grupos. En conclusión, la leche de
cabra contiene rhLZ demostró evidencia válida para su uso potencial como un nutracéutico para la
mejora de la calidad de la salud y la nutrición en los seres humanos.
INTRODUCCIÓN
La leche materna es la fuente ideal de nutrición para el desarrollo infantil, proporcionando nutrientes
y factores que promueven la salud y combaten las infecciones. Los beneficios de la leche humana se
atribuyen a la acción antimicrobiana de las proteínas de la leche como la lisozima (LZ).
Dicha enzima es parte de la inmunidad pasiva y la defensa natural contra bacterias Gram-positivas y,
con la cooperación de otros factores presentes en la leche, LZ también ha demostrado actividad contra
bacterias Gram-negativas, virus, parásitos y hongos. La lisozima es capaz de catalizar la hidrólisis
de enlaces glucosídicos entre 1 y 4 de ácido acetilmurámico y N acetilglucosamina en la capa de
peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. Su actividad antimicrobiana es el resultado de
esa división, que provoca la fuga de los componentes internos de las células y la consecuente
destrucción de bacterias. La lisozima es una proteína globular, que, además de estar presentes en la
leche humana, se puede encontrar en diferentes concentraciones en diversas especies y secreciones
como lágrimas, sudor y saliva. En la leche humana, la concentración típica es de aproximadamente
200-400 μg / ml, muchas veces mayor que el contenido de LZ presente en la leche de las cabras (0,25
μg / ml), bovinos (0,13 μg / ml) y porcinos (0,065 μg / mL). Teniendo en cuenta los beneficios de LZ,
varios grupos de investigación han desarrollado organismos genéticamente modificados para la
producción de recombinantes lisozimas humanas (rhLZ). La expresión rhLZ por parte de los
transgénicos el arroz integral ha alcanzado el 0,6% del peso del grano. Los pollos transgénicos
producen un promedio de 29.90 μg / mL en el huevo blanco. Las concentraciones de rhLZ en la leche
de los ratones transgénicos variaron de 250 a 710 μg / ml. En la leche de vacas y cerdos transgénicos,
hay aproximadamente 25.96 μg / mL y 116 mg / ml de rhLZ, respectivamente.
La leche de animales lácteos transgénicos que expresan rhLZ tiene potencial para prevenir y tratar la
diarrea infantil y algunas otras enfermedades infecciosas, también reducen la carga de la desnutrición.
La leche de cabra RhLZ puede de hecho modular las poblaciones microbianas instestinales de una
manera similar a la leche humana. En estudios previos, el análisis de microbiota fecal de cerdos
jóvenes alimentados con leche pasteurizada de las cabras transgénicas rhLZ mostraron un aumento
significativo en el número de bacterias asociadas con la salud intestinal.
Los cerdos jóvenes también han presentado mejora en la morfología del intestino y metabolitos
circulantes, ayudando a mejorar los síntomas de la diarrea. Para investigar más y explorar los
beneficios de la lisozima humana, una línea de cabras lecheras transgénicas que expresan rhLZ en su
leche fue producida en Brasil. En este estudio, apuntamos a validar la posible utilidad de la leche a
partir de dicha línea transgénica mediante la evaluación de las características fisicoquímicas de la
leche. Además, identificar y cuantificar rhLZ en la leche y su actividad enzimática in vitro en cultivos
de células epiteliales intestinales (IEC-18) y contra bacterias patógenos gastrointestinal. Esto
representa el primer paso necesario en probar las propiedades de la leche en estudios sistemáticos in
vitro e in vivo para uso futuro potencial de la leche de cabra rhLZ como producto nutracéutico en
humanos.

Materiales y métodos

 Animales transgénicos
Una línea de cabras transgénicas que expresan rhLZ en la leche fue generada por microinyección
pronuclear de embriones en una etapa con una construcción genética (23 Kb) consistía en el cDNA
de lisozima humana (540 pb) en el promotor αS1-caseína bovino y los elementos reguladores 3 ',
según a Maga et al. (2003). La leche de un fundador transgénico hembra (Tg) y a partir de dos cabras
de control no transgénicas (NTG1 y NTG2) que concuerden con la misma raza, la paridad y etapa de
lactancia se utiliza en todo este estudio.

 Colecciones de muestras de leche


Las cabras transgénicas y no transgénicas se mantuvieron en puestos separados, y proporcionó heno,
sal mineral y agua ad libitum, y la exposición diaria a la luz solar. Muestras de leche de la cabra Tg
y de las nTg1 y nTg2 las cabras fueron recolectadas una vez por semana, comenzando en la tercera
semana de lactancia, y durante las siguientes ocho semanas. Se utilizó la cabra nTg2 solo para
comparaciones en los análisis fisicoquímicos. El procedimiento de recogida se realizó manualmente
y en condiciones asépticas, con tetinas desinfectados y se seca antes de cada recogida, según lo
recomendado por protocolos estándar de bioseguridad. En cuanto a la leche de control humana (HM),
las muestras se obtuvieron de donantes no identificados, aproximadamente en el cuarto mes de
lactancia.

 Análisis fisicoquímico
En cada recolección de leche, durante el período de ocho semanas, 50 ml de la leche fresca recogida
de las cabras transgénicas y no transgénicas se sometió a análisis físicos y químicos por triplicado.
Las muestras de dos nTg se utilizaron para la equivalencia sustancial, según lo definido previamente
por la OCDE. La cantidad de grasa, lactosa, proteína y sólidos no grasos, así como el pH y el punto
de congelación se verificaron en cada muestra de leche para identificación de posibles alteraciones
en la composición de la leche entre grupos, utilizando un equipo analizador de leche. El contenido de
ácido láctico se midió valorando la leche con 0.1 N de hidróxido de sodio. y el nivel alcalino se midió
en presencia de un indicador de fenolftaleína a pH 8.0.
Para analizar el peso específico de la leche, la densidad se obtuvo siguiendo las recomendaciones de
la FAO y para determinar el análisis aproximado para la evaluación nutricional, el contenido de
cenizas, que representa el contenido mineral total, se obtuvo por incineración de las muestras a través
de un calentamiento de 24 horas en un horno a 100 ° C, seguido de 6 h en mufla a 550 ° C. Después
de cada análisis fisicoquímico semanal, las muestras de la leche restante se enfriaron y se
pasteurizaron a 64 ° C durante 35 min. Muestras se enfriaron inmediatamente a -4 ° C, se almacenaron
a -80 ° C y se descongelaron solo en análisis de tiempo de ejecución.

Identificación y cuantificación de lisozima. El contenido de rhlz en las muestras de leche se


cuantificó por western blot por triplicado. El NTG, Tg y HM se diluyeron inicialmente 1: 1 en
Laemmli buffer y desnaturalizado a 95 ° C durante 3 min, para la separación por 15% SDS-PAGE en
corrida electroforética (90 min a 100 V). la lisozima humana recombinante comercial diluida a 270
μg / mL se usó como control positivo y también para cuantificar la rhLZ en leche. Las proteínas se
transfirieron a membrana de nitrocelulosa durante 2 horas a 100 V mediante transferencia húmeda en
el dispositivo Mini Trans-Blot® Cell. Las membranas se bloquearon durante 1 h usando TBS-T con
leche en polvo descremada al 5%. Posteriormente, las membranas se enjuagaron tres veces durante
15 minutos en TBS-T, y el anticuerpo anti-lisozima humano se diluyó a 1: 2500 en la solución de
bloqueo durante 16 horas a temperatura ambiente. A continuación, incubación se realizó con el
anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina anti-conejo diluido a 1: 20.000 en TBS-T. Tres
lavados adicionales de 15 minutos se llevaron a cabo en TBS-T, con las membranas luego se cubre
con el NBT / BCIP. Después de 24 h, se determinó la semicuantificación de la expresión de rhLZ en
la leche mediante el análisis de geles digitalizados y fotografiados, donde la intensidad de cada
diámetro específico de banda western blot fue medida utilizando el software Image J 1.4 comparando
con cantidades conocidas de rhLZ comercial. Los resultados fueron convertido en valores numéricos
que se refieren a cada banda medida.

Prueba de actividad:
Para evaluar la actividad biológica de la lisozima en la leche producida por la cabra transgénica,
evaluamos su actividad antimicrobiana analizando la formación de zonas de crecimiento bacteriano
inhibidor en la placa de cultivo. Muestras de Tg, nTg, hM, S-rhLZ, y una solución identificada como
nTg + rhLZ (una preparación de la muestra nTg añadida con 270 μg / ml de rhLZ, destinado a simular
la concentración de rhLZ en la leche humana) fueron sometidos a un ensayo de actividad sobre el
césped, incubando 30 μL de cada muestra en un agujero perforado de una placa de agarosa
incorporada con 10% Micrococcus luteus. Después de la incubación placa de 48 h a 37 ° C, se
analizaron las imágenes fotográficas y la medición zona de crecimiento inhibidora se evaluó para
cada grupo. El ensayo se basa en el procedimiento usado por Maga y Murray (1995).
Ensayo bactericida
Los ATCC de las cepas utilizadas para investigar la actividad bactericida de lisozima fueron Shiguella
sonnei (ATCC 25931), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), y M. luteus (ATCC 00356). Las
bacterias de cada cepa fueron cultivadas a 37 ° C durante 24 h y después se diluyeron en solución
salina al 0,9% a una concentración de 0,5 en la escala de McFarland. Después, cada suspensión
bacteriana se diluyó 1000 veces en-Bertani caldo Luria (LB). Las muestras de leche de la Tg, NTG,
S-rhLZ y NTG + grupos rhLZ también se diluyeron 20 veces en caldo LB, restante a 37 ° C bajo 220
xg durante 60 min. A continuación, 15μL se sembraron en dos placas de medio LB-agar. Después de
24 h, las unidades formadoras de colonias (CFU) eran ob-servido, se contaron y calculado. El
experimento se realizó por triplicado
Ensayo de proliferación celular
Viabilidad celular, migración y expresión génica en presencia de Tg y los controles se determinaron
mediante el uso de células epiteliales intestinales de rata. En resumen, las células se cultivaron a 37 °
C en 5% de CO2 en DMEM que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 50 UI / ml
de penicilina y 50 g / ml estreptomicina (GIBCO). Las muestras de leche de cada grupo se diluyeron
1: 5, 1:20 y 1:40 en DMEM, con solución salina tamponada con fosfato que se utiliza como control
negativo.

Viabilidad celular
Para determinar la viabilidad celular en presencia de diferentes diluciones de leche, MTT (3- (4,5-
dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenil tetrazolio bromuro) (Sigma-Aldrich) se usó para medir la actividad
de la reductasa mitocondrial en células vivas. En breve, IEC-18 fueron sembradas en placas de 96
pocillos en una concentración total de 4 × 104 células / pocillo en 100 μL de medio de cultivo.
Después de 24 h de incubación, el medio se re-movió y se sustituye por DMEM que contenía PBS.
or DMEM que contiene PBS o cada dilución de muestra por triplicado (n = 3). Después de 24, 48 y
72 h, las células se lavaron con PBS y luego se incubaron durante 4 h en 100 μl de medio de cultivo
con 10 μL de solución de MTT (5 mg / ml). Las placas se centrifugaron a 3000 rpm durante 15
minutos, los medios que contenían MTT se eliminaron por inversión rápida, y los cristales de
formazan se diluyeron con una solución de isopropanol acidificada (HCl 0,04 N). Antes de la lectura,
las placas se agitaron durante 5 minutos y se midió la absorbancia en un lector de ELISA ajustado a
575 nm.
Migracion celular
La capacidad de la leche que contiene hLZZ para afectar la migración de IEC-18 en presencia o
ausencia de bacterias se determinó como se describió previamente. Brevemente, la migración celular
se evaluó en presencia de rhLZ en la leche. IEC-18 se transfirió a una placa de 12 pocillos a una
concentración de 2,4 x 105 células / pocillo. Después de un período de crecimiento de 24 h, las células
se incubaron con Mitomicina C durante 30 minutos, la monocapa se rascó con la ayuda de una cuchilla
estéril, de modo que las células se arrastraron desde el centro hasta el borde derecho del pozo. El
medio de cultivo que contiene Mitomicina C se descartó y se reemplazó por medio fresco con PBS o
diluciones de leche de cada grupo. Después de la incubación durante 24 h, los pocillos se lavaron dos
veces con PBS para la observación de la migración celular a través de la línea de rayado bajo un
microscopio invertido con 10 aumentos. El análisis de migración celular se basó en el número de
células migratorias, la distancia de migración y la velocidad de crecimiento, después de la evaluación
de imágenes fotográficas mediante el uso del software Image J.
Migración celular en presencia de patógenos
La capacidad de la leche de cabras transgénicas o no transgénicas para modular la migración celular
se evaluó en presencia de patógenos intestinales principales asociados con enfermedades estomacales
y diarrea Escherichia coli EPEC (ATCC 3905), Shiguella sonnei (ATCC 25931), Enterococcus
faecalis (ATCC 29212) y Staphylococcus aureus (ATCC 6535), basado en van Vuuren et al. (2015).
Las muestras de leche se diluyeron a 1:20 en DMEM, y se añadieron bacterias (2,5 × 105 CFU / mL)
a cultivos celulares. Después de 24 h de incubación, las células se lavaron con PBS y se examinaron
en busca de CFU, tal como se describió anteriormente
La expresión génetica
Como la inflamación intestinal puede estar asociada con la disrupción de la barrera intestinal, el
análisis de qRT-PCR se utilizó para evaluar la expresión de genes para la proteína de unión estrecha
ZO-1 y la citocina proinflamatoria IL-6 en IEC-18 en cultivo, utilizando β- actina como gen de
limpieza para la normalización. Brevemente, IEC-18 se sembró en placas de 12 pocillos hasta una
confluencia del 60-70%, cuando se agregaron muestras Tg, nTg, nTg + S-rhLZ y S-rhLZ en tres
réplicas biológicas para cada tratamiento, permaneciendo en cultivo durante 24 horas adicionales. Las
células se lavaron dos veces con PBS y se recogieron mediante tripsinización. Las células suspendidas
se lavaron en PBS y luego se almacenaron a -80 ° C. Las muestras se descongelaron y se extrajo el
ARN total usando el kit de purificación de columna giratoria RNeasy, siguiendo las instrucciones del
fabricante. La concentración de ARN se cuantificó y la pureza se verificó mediante absorbancia de
UV a 260 nm y 280 nm. El ADNc se sintetizó mediante PCR de transcripción inversa, utilizando 1
μg de ARN total tratado con ADNasa, oligo (dT) como cebadores y enzima Super Script III
(Invitrogen). RT-qPCR reacciones se realizaron en 20 μL que contiene 10 μL Power SYBR® Green
PCR Master Mix 2 × (Applied Biosystem, Foster City, CA, EE. UU.), 1 μL de cDNA con 600 nM de
cebadores específicos diseñados para evaluar ZO-1 e IL -6 expresión de transcripción, y 6.6 μL de
agua ultrapura. Los cebadores fueron sintetizados por Invitrogen (São Paulo, Brasil), con secuencias
de nucleótidos que se muestran en la Tabla A.1. La amplificación consistió en 5 minutos a 94 ° C,
seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a la temperatura de hibridación (60 ° C)
y 30 segundos a 72 ° C seguidos de 40 ciclos de incrementos de 0,5 ° C (10 s cada uno) para la curva
de fusión, comenzando a 75 ° C. La fluorescencia se midió durante la etapa de recocido de cada ciclo.
Todas las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando el termociclador StepOne Plus
Análisis Estadístico
Datos obtenidos de la evaluación bactericida, viabilidad celular y migración, número de células,
velocidad de migración y distancia para muestras y los patógenos se compararon con las pruebas de
χ2 o de Fisher. La normalidad de los datos cuantitativos se analizaron mediante la prueba de
Kolmogorov-Smirnov y, cuando sea necesario, los valores se normalizaron por transformación
logarítmica en una base 10 y analizado por ANOVA con comparaciones pareadas mediante la prueba
de Tukey (GLM-Minitab, State College, PA, EE. UU.). Un simple la prueba de correlación (Pearson)
se utilizó para evaluar las relaciones entre variables. Las figuras gráficas fueron producidas por el
software GraphPad Prism® (Versión 5.01). Datos de expresión génica, representativos de tres
independientes réplicas biológicas para cada tratamiento, fueron sometidas a análisis de varianza,
usando Minitab® Statistical Software (Minitab Inc., State College, PA, EE. UU.), Con los medios
comparados por la prueba de Tukey. Los nivel de significancia fue del 5%.
Resultados
Los análisis fisicoquímicos mostraron que los valores medios de los parámetros lácteos para leche de
cabra son similares a los de leche de cabra nTg durante las ocho semanas consecutivas de recolección,
con todos los parámetros dentro de los valores requeridos para consumo humano, de acuerdo con los
estándares mínimos de calidad de MAPA (Ministério da Agricultura Pecuária, Brasil, 2000). Sin
embargo, a pesar de los valores de rango normal, la leche del fundador de la cabra transgénica tenía
significativamente menor contenido de grasa y proteína que la leche de ambas cabras de control no
transgénicas.
Identificación y cuantificación de lisozima: La rhLZ se identificó mediante transferencia de Western
en muestras de leche de Tg, hM y S-rhLZ. Después de comparar cada intensidad de banda específica
para cada muestra con el grupo S-rhLZ (270 μg / ml de rhLZ comercial), los valores medios de
concentración para la lisozima humana en la leche Tg fueron de 224 μg / ml. Tal valor medio de LZ
fue similar al encontrado en el control hM.
Prueba de actividad in vitro
La zona de inhibición del crecimiento de M. luteus se observó después de la exposición a muestras
Tg, S-rhLZ, nTg + rhLZ y hM, lo que demuestra un efecto restrictivo del crecimiento, mientras que
no se observó zona de inhibición para la muestra de leche nTg, como se esperaba.
Ensayo bactericida in vitro
La actividad bactericida del grupo de leche Tg contra M. luteus se demostró mediante una reducción
de 7 a 8 veces en el número de CFU observado después de la incubación en comparación con el
control negativo y con el grupo nTg. Además, las muestras S-rhLZ y nTg + rhLZ inhibieron
completamente el crecimiento de M. luteus. Las muestras utilizadas contra S. sonnei no mostraron
ningún efecto bactericida, mientras que E. feacalis mostró una sensibilidad relativa a nTg + rhLZ y
una discreta sensibilidad a las muestras Tg y S-rhLZ en comparación con el control negativo y los
grupos nTg.
Viabilidad celular in vitro
La evaluación de los efectos de dilución de la muestra (1: 5, 1:20 y 1:40) sobre la viabilidad celular
mostró que las diluciones 1:20 y 1:40 de los grupos nTg, S-rhLZ y nTg + rhLZ redujeron
significativamente la viabilidad después de 24 h de exposición en comparación con los otros grupos.
Sin embargo, después de 48 h de exposición, las células expuestas a muestras de Tg a diluciones 1: 5
y 1:20 tenían una viabilidad menor en comparación con los controles y el grupo nTg. Después de 72
h, las diluciones de Tg y nTg fueron estadísticamente similares entre sí y entre los grupos, y todas las
diluciones utilizadas en el grupo de control mostraron una viabilidad celular aumentada. El grupo
rhLZ mostró una disminución significativa en la viabilidad celular en comparación con el otro grupo
después de 24, 48 y 72 h de cultivo.
Ensayo de migración celular in vitro
Las características de migración de IEC-18 no se vieron negativamente afectadas por la leche o la
presencia de lisozima humana. Se observó un aumento en el número de células migratorias en la
dilución 1:20 para todos los grupos en comparación con los controles. Se observó un aumento en la
velocidad de migración en todas las diluciones para los grupos nTg, Tg y S-rhLZ, siendo similar a
los controles cuando se agrega rhLZ a nTg. La distancia de migración también se incrementó a las
diluciones 1:20 y 1:40 para los grupos nTg y Tg, mientras que se observó una reducción para el grupo
nTg + rhLZ a diluciones 1: 5 y 1:40. No se detectaron diferencias entre las diluciones dentro de los
grupos. La dilución 1:20 para los grupos nTg y Tg tenía parámetros de migración significativamente
mejores para las células en cultivo (p <0,05) que los controles.
Ensayo de migración celular in vitro en presencia de patógenos
En general, y en comparación con los controles, la presencia de rhLZ en cultivo fue favorable para la
velocidad y la distancia de migración celular in vitro en ausencia o presencia de E. faecalis, S. aureus
y E. coli, sin que se observara un efecto positivo para S. sonnei. En ausencia de patógenos
seleccionados a dilución 1:20, los grupos Tg mejoraron la cantidad de células migratorias, los grupos
nTg, Tg y S-rhLZ mejoraron la velocidad de migración, y todos
los grupos aumentaron la distancia de migración en las células en cultivo en comparación con los
controles. En presencia de patógenos, los grupos de leche Tg, S-rhLZ y nTgrhLZ en dilución 1:20
promovieron un aumento en el número de células (E. coli para Tg y S-rhLZ, y S. aureus para S-rhLZ),
migración de crecimiento velocidad (E. faecalis, S. aureus y E. coli) y distancia (E. faecalis, S. aureus
y E. coli) en comparación con el grupo control, excepto S. sonnei (p <0.05). Por el contrario, las
muestras nTg mostraron un menor número de células en presencia de E. faecalis y S. sonnei. En
presencia de S. sonnei, las muestras SrhLZ y nTg + rhLZ se asociaron con un número menor de
células, con una menor distancia de migración (p <0,05) en presencia de muestras nTg + rhLZ.
La expresion genica
No se observaron diferencias entre los grupos para los patrones de expresión relativa de ZO-1 en
células cultivadas. Sin embargo, aunque el patrón de expresión de IL-6 fue estadísticamente similar
entre los grupos control (PBS) y rhLZ, su expresión aumentó en el grupo de células expuestas a
muestras de leche nTg (nTg y nTg + rhLZ), siendo el grupo Tg similar a todos los grupos.
Discusión
La leche de cabra (Capra hircus) contribuye con aproximadamente el 2.4% de la producción mundial
de leche, lo que representa una importante fuente de proteínas en las comunidades pobres. La leche
de cabra tiene más contenido de proteínas y minerales que la leche humana y la fácil adaptación de
cabras a ambientes de pobreza extrema hace que esta especie sea atractiva para la producción de
proteínas recombinantes y nutracéuticos para el consumo humano. En consecuencia, aumentar la
leche de cabra con lisozima humana puede ser una estrategia interesante para combatir la desnutrición
y las enfermedades endémicas. En este estudio, en vista de tal potencialidad, informamos la
producción de un linaje de cabra transgénico para la expresión de rhLZ en la leche y la caracterización
de la leche producida por el animal fundador, que es un paso importante para evaluar las propiedades
lácteas para el futuro uso potencial de la leche de cabra rhLZ como producto nutracéutico.
La mayoría de los análisis y parámetros evaluados en este estudio indicaron características de gran
potencial para dicha aplicación. La composición de los alimentos es un tema de interés en la industria
alimentaria para desarrollo de productos, control de calidad o propósitos reguladores, para asegurar
calidad y seguridad, y el análisis fisicoquímico de la leche es un importante requisito para el consumo
humano. La composición aproximada de alimentos incluye los contenidos de macronutrientes,
específicamente humedad, cenizas, lípidos, proteínas e hidratos de carbono.
La leche fresca contiene la capacidad natural para resistir los cambios de pH, debido a su "acidez
natural"; sin embargo, la acción de las bacterias que normalmente se desarrollan en la leche cruda
produce más o menos ácido láctico. Las propiedades físicas y químicas de la leche fresca del fundador
de la cabra transgénica se analizaron durante ocho semanas, siendo muy similares a las observadas
en cabras no transgénicas y cumpliendo con los estándares de calidad requeridos por la ley para el
consumo humano en Brasil.
La importancia de las diferencias en la composición de grasas y proteínas observadas en la leche de
la cabra transgénica, aunque dentro de los valores normales, puede estar relacionada con el efecto
animal. Se necesitan estudios futuros que incluyan más animales para desentrañar esos hallazgos. El
contenido medio de rhLZ en la leche de la cabra transgénica fue de aproximadamente 224 μg / ml, lo
que representa el 56% de la concentración de lisozima típica que se encuentra en la leche materna
humana. Los valores medios de concentración de lisozima en la leche humana varían, ya que
disminuye desde el calostro (370 μg / ml) hasta la leche de transición (270 μg / ml), y hasta la leche
madura entre 15 y 28 días (240 μg / ml) de lactancia. Sin embargo, los niveles de lisozima aumentan
en la leche madura desde los días 29-56 (330 μg / ml) hasta los días 57-84 (890 μg / ml) de lactancia.
La rhLZ presente en la leche de cabra transgénica se ha caracterizado en estudios previos como capaz
de modular la población microbiana. Los experimentos que utilizan el modelo porcino, donde los
animales fueron alimentados con leche de cabra transgénica que contiene rhLZ a 270 μg / ml, han
mostrado un impacto positivo en la morfología gastrointestinal, metabolitos séricos, poblaciones de
linfocitos e incremento en la expresión de citoquinas antiinflamatorias.
De hecho, después de la lactancia, las cabras transgénicas mantuvieron un nivel más bajo de recuentos
de células somáticas en la leche en comparación con las cabras no transgénicas. Tal medida se usa
para monitorear la infección de la glándula mamaria, indicando una ubre más saludable. Tal beneficio
probablemente esté asociado con la actividad antimicrobiana de la lisozima, lo que resulta en una
mejor seguridad de la leche y el bienestar de los animales
El análisis del efecto antimicrobiano de la leche mostró que las muestras Tg, S-rhLZ y nTg + rhLZ
tenían actividad antibacteriana y bactericida contra M. luteus, una cepa Gram-positiva normalmente
utilizada como organismo de referencia para estudios sobre la actividad de la lisozima (Diler et al. .,
2011). La otra cepa Gram-positiva, E. faecalis, mostró discreta sensibilidad a la presencia de muestras
Tg y S-rhLZ, mientras que el número de CFU disminuyó significativamente en el grupo nTg + rhLZ,
que contenía cantidades de rhLZ bastante más altas. La alta resistencia de E. faecalis a la acción de
la lisozima ya es bien conocida, lo que permite la supervivencia del agente patógeno en los mamíferos.
A pesar del efectivo efecto bactericida contra las cepas Gram-positivas, la lisozima se mostró eficaz
contra las cepas Gram negativas solo cuando se asocia con otras sustancias, como la lactoferrina. .
Ambas proteínas están presentes en la leche de mamíferos, presentando propiedades antimicrobianas
sinérgicas. La lactoferrina se une a los lipopolisacáridos en la membrana bacteriana externa, lo que
contribuye a la disrupción de la membrana y permite que la lisozima tenga un mejor acceso a la capa
de peptidoglicano en bacterias Gram negativas.
Por lo tanto, como se esperaba para las bacterias Gram negativas S. sonnei, no se verificó ninguna
sensibilidad en presencia exclusiva de lisozima. Nuestros resultados corroboran con otros estudios,
en los que la presencia de lisozima (a concentraciones de 10 y 100 μg / ml) no produjo variación o
retraso en las curvas de crecimiento de ninguno de los seis tipos de bacterias Gram-negativas probadas
(Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Salmonella
enteritidis, Shigella sonnei y Shigella flexneri).
El efecto antimicrobiano potencial de la lisozima, con modulación positiva de la población
microbiana, ha sido previamente descrito por múltiples estudios. Además, la estabilidad de LZ a
tratamientos térmicos y condiciones ácidas asegura la integridad y efectividad a lo largo del tracto
gastrointestinal, lo que hace que la leche transgénica que contiene rhLZ sea un prometedor producto
nutracéutico, adecuado para el consumo en forma de leche cruda o pasteurizada fresca.
Además, la rhLZ puede purificarse de la leche para su uso como suplemento de soluciones de
rehidratación oral. De hecho, el uso de leche transgénica de cabra como potencial producto
nutracéutico o como suplemento a la terapia de rehidratación oral fue informado por Carvalho et al.
(2012), que demostraron que la presencia de nutrientes en el medio de cultivo, en proteínas y grasas
especiales de la leche de cabra, puede ser beneficioso para la proliferación de células intestinales in
vitro.
Los resultados en el ensayo celular obtenido en este estudio mostraron alteraciones en la viabilidad
celular en presencia de muestras diluidas. Después de 24 h, la dilución 1:20 de la muestra de leche
Tg fue significativamente similar al grupo de control y diferente de nTg, mostrando un efecto positivo
sobre la migración celular.
Además de la fuente de nutrientes, se evaluó la capacidad antimicrobiana de la leche transgénica
comparando la migración celular en presencia de diluciones de muestra 1:20, 24 h después de la
inoculación in vitro de bacterias patógenas.
Se observó una proliferación celular mejorada en cultivos expuestos a muestras del grupo Tg junto
con E. faecalis, S. aureus (estadísticamente similar a S-rhLZ y nTg + rhLZ) y S. sonnei. Aunque las
muestras de leche Tg no mostraron ningún efecto bactericida contra E. faecalis, la presencia de leche
per se fue beneficiosa para la proliferación celular.
El menor efecto de migración celular observado después de la exposición a muestras del S-rhLZ y
los grupos nTg + rhLZ pueden deberse a una mayor actividad de la proteína LZ en la leche Tg que
en la leche suplementada con rhLZ, ya que la lisozima producida in vivo en la leche a través de la
glándula mamaria ha demostrado ser más potente como agente antimicrobiano que la leche
suplementada con proteína purificada
Las proteínas de unión fuerte son principalmente responsables de funcionar como barrera de la
mucosa intestinal contra la difusión macromolecular. La presencia de muestras en cultivo celular no
alteró el patrón relativo de expresión génica para la proteína ZO-1, lo que sugiere que no hay efecto
sobre la permeabilidad epitelial intestinal en células cultivadas. Por el contrario, el patrón de
expresión de la citoquina proinflamatoria IL-6 por IEC-18 se incrementó en presencia de muestras de
leche (nTg, Tg y nTg + rhLZ), lo que sugiere que la leche de cabra transgénica o no transgénica puede
provocar una inflamación intestinal proceso en condiciones in vitro (Atreya y Neurath, 2005). Sin
embargo, el análisis in vivo de regiones intestinales (duodeno e íleon) de cerdos que recibieron una
asociación de leche de cabra transgénica pasteurizada y leche de vaca no transgénica pasteurizada,
con una concentración final de 135 μg / ml de rhLZ, no mostró aumento en la expresión de IL-6
(Cooper et al., 2013). Se necesitan más estudios para evaluar los efectos in vitro e in vivo de la leche
Tg y nTG en el epitelio intestinal, en moléculas pro y antiinflamatorias y en la permeabilidad
intestinal
Conclusión
Este estudio se centró en la caracterización de la leche de cabra de una línea transgénica que expresa
la lisozima humana en la leche. Las propiedades fisicoquímicas de las muestras de leche de cabras
transgénicas y no transgénicas fueron similares y cumplieron con los requisitos mínimos de calidad
para el consumo humano (MAPA, 2000). La rhLZ activa está presente en la leche de la línea de cabra
transgénica en cantidades comparables a los valores encontrados en la leche materna humana,
demostrando también efectos antibacterianos y bactericidas in vitro. La leche transgénica no alteró ni
afectó la viabilidad, proliferación y migración in vitro de las células epiteliales intestinales (IEC-18)
en cultivo. Este estudio se llevó a cabo en la región noreste de Brasil, donde el número de muertes
infantiles por desnutrición y enfermedades infecciosas es alto. La rhLZ producida en la leche tiene el
potencial de ser utilizada en fórmulas para lactantes o en natura, como producto nutracéutico, con
valores nutricionales y médicos comparables a la leche humana. Se están llevando a cabo otros
estudios in vitro e in vivo utilizando modelos animales, que son absolutamente necesarios para
garantizar la seguridad y la observación de los efectos beneficiosos sin consecuencias perjudiciales o
involuntarias del uso de leche transgénica de cabra que contiene rhLZ.