IESTP “Perú – Japón”

Técnica en Laboratorio Clínico

Determinación de Perfiles Bioquímicos en Muestras
Biológicas Humanas I

Tema: Espectrofotometría y Fotolorimétrico.

Absorbancia y Tramitancia.
Semana: 03
Docente:
Mg. Marcos Daniel García Rodríguez
Biólogo Microbiólogo
Especialista en Laboratorio de Análisis Clínico y
Biológicos.
E-mail: marcogarcia.rodriguez@gmail.com
 Objetivos de la Sesión
• Objetivo:
Comprensión integral de los fundamentos de la
Espectrofotometría y Fotolorimétrico. Absorbancia y
Tramitancia.

IDEX "Perú - Japón" 2

LAS LEYES DE LAMBERT
Y BEER *
o
los fundamentos de la interrelación de la luz
que se absorbe y la que se transmite

Mg. Mblgo. Marcos García Rodríguez

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ab

I0 I I0 I I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a
través de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentración del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ac

I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es
absorbida por una solución es proporcional a la concentración
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará
una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida
por la muestra.
La Transmitancia (T) es la relación entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente proporcional a
la longitud del recorrido b a través de la
solución y la concentración c del color
absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

• A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro, entonces la

absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.
 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución
LUZ A
B
S
O Luz transmitida
R

I0 B
I I
D
A T = I/I0
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:

Concen
tración
Un espectrofotómetro es un instrumento
que descompone un haz de luz (haz de
radiación electromagnético), separándolo
en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro
atravesado por numerosas líneas oscuras
y claras, semejante a un código de barras
del objeto, con el propósito de identificar,
calificar y cuantificar su energía
Distribución de la luz en el
espectrofotómetro
 

Espectrofotómetro Mecanismo Interno

Es usual que al seguir una “receta” para la
determinación de la concentración de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (l)
específica a la que hay que leer con el colorímetro o
espectrofotómetro.

¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)

compuestos parecidos pero diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada

producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismática
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual
se vierte la solución a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un
comportamiento constante ante la variación de la longitud de
onda es común que las celdas del espectrofotómetro o
colorímetro sean de este material .
 Curva Patrón

El razonamiento para el proceso de

determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
A
Absorbancia del problema
B
S
0
R
B
A
N
C
I Interpolación
A
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con
la concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Tipos de Espectrofotómetro
Existen en la actualidad diversos
tipos de aparatos con los mismos
principios los hay mecánicos y
digitales; unos miden solo la luz
visible, otros son más precisos y
miden también luz U.V. ,
Infrarroja, de absorción atómica
(AA), flurescencia de rayos-X de
emisión de plasma (ICP),,
multipropósitos (para medir
directamente la solución con
suspensión, muestras sólidas y
biológicas), acoplado a masas,etc..
 MCI MCI
Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.

MCI
Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotómetros

Spectronic 20 D Spectrónic 20
Partes del Spectronic 20 D
 Manejo de espectrofotómetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el manejo el

espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.
Manejo de espectrofotómetro
• Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se
activará la luz roja de encendido (b).
• Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).
• Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada
y sin muestra.
• Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).

d
c

a
• Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
• Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra
problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.
• La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se
lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia

e
CUIDADOS
• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse
turbias o con precipitados.
• El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de que
sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o
papel absorbente suave, para evitar rayarla.
• La cubeta se sujeta por los lados opacos.
• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes
de la cubeta
• No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes,
ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta,
se puede dañar parte del mecanismo
• Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y
libre de humedad
Actividad - Trabajo

• Defina que es un fotocolorímetro y un

espectrofotómetro. Explique su fundamento
de uso.
• Dibuje.

IDEX "Perú - Japón" 31

Links de Referencia
• https://es.slideshare.net/elajj/fotocolor
metro
• https://www.equiposylaboratorio.com/si
tio/contenidos_mo.php?it=1311

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