Lic.
TM Jaime Figueroa Tataje
Las leyes de Lambert y Beer
o
los fundamen
tos de la inter
que se absorb relación de la
e y la que se luz
transmite
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ab
I0 I I0 I I0 I
1 cm. 2 cm. 3 cm.
Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a
través de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentración del medio
absorbente aumenta
I = I0e-ac
I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es
absorbida por una solución es proporcional a la concentración
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará
una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida
por la muestra.
La Transmitancia (T) es la relación entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (Io):
T = I / I0
Se expresa como % T
La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del
recorrido b a través de la solución y la concentración c del
color absorbente. Estas relaciones se dan como:
A = a·b·c
A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por
litro, entonces la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.
¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?
De acuerdo a las características de la sustancia
analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución
LUZ
A
B
S Luz transmitida
O
I0 R
B I
I
D T = I/I0
A
Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)
Absorbancia
Concentración
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo
negativo y comportamiento exponencial)
% Transmitancia
Concentración
Absorbancia
De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o
luz que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo
en base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien
al -log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro
o (“blanco”) es el material de referencia
La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:
Concen
tración
Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores de
Absorbancia
Con base en la relación: T = 10-abc
y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresión anterior
log10 %T = -abc log 10
10 + log10 100
Invirtiendo términos
log %T = log10 100 -abc log 10
10 = 2 – abc * 1
log10 %T = 2 – abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 – A.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en % T?
Log10 % T = 2 – 0.6 = 1.4
Log10 % T = 1.4
%T = 1 / Log10101.4
Aplicando antilog. a
1.4 = 15 % de transmitancia
Obtención de absorbancia a partir de un valor de
% de transmitancia
RECORDANDO:
A = log10 1/T
Ejemplo de cálculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia
Curva Patrón
El razonamiento para el proceso de
determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
CURVA PATRÓN
0.6
0.5
A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3
B
A
0.2
N
C Interpolación
I
0.1
A
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con
la concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:
A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.
Si despejamos C1 = Conc del problema
A1 (problema) * Conc estándar
Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina;
donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo
por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la
calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)
Stock de Safranina Agua Destilada ml
TUBO
(3 x10 -4 g/ml) ml
1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la
preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se
incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0)
contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin
de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero
Compuesto 1 2 3 4 5 6 7
(blanco)
Glucosa 0,1 mg/ml
0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(mL)
Agua destilada
1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0
(mL)
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfúrico
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
(mL)
RESULTADO de la curva patrón anterior
Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm
Tubos Absorbancia
1 0
2 0.135
3 0.253
4 0.417
5 0.658
6 0.574
7 0.768
Curva de calibración de glucosa
1
A bs orba nc ia
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6 7
Tubos
Un aspecto importante de la evaluación
espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo
Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los
espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos
Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos
(RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH),
l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a
absorciones intensas en la región del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.
Regresion Lineal
El método estadístico clásico y que se adecua a las características para la
realización de dicha actividad es el de los Mínimos Cuadrados en los que se
grafica la ordenada (la variable independiente) con los datos de la respuesta del
aparato y la abscisa (variable dependiente) en donde se coloca la concentración
o el tanto por ciento del analito, lo más habitual (y deseable) es que la gráfica se
aproxime a una línea recta, sin embargo puede darse el caso de que los valores
no coincidan en una recta debido a errores aleatorios del proceso de medida, el
método de los mínimos cuadrados nos sirve para intentar ajustar la “mejor” línea
recta que conecte los puntos. La ecuación canónica de la recta se expresa
matemáticamente como:
Y = mx + b
Pendiente Intercepto en Y
