LA ADMINISTRACIÓN DEL SIMBIÓTICO

LACTOBACILLUS BULGARICUS 6C3, INULINA Y

FRUCTOOLIGOSACÁRIDO REDUCE LA
PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD RENAL
CRÓNICA EN EL MODELO MURINO
Alonso Jerez Morales
Tesis para optar al grado de Magíster en Ciencias con mención en Microbiología

Profesora tutora: Dra. Apolinaria García Cancino

 ¿Qué es la enfermedad renal crónica (ERC)?

• Es una enfermedad no transmisible.

El mundo se encuentra
en un momento
decisivo de la historia
de las enfermedades no
transmisibles (ENT) y
tiene ante sí una
oportunidad única de
alterar su curso.

2
 ¿Qué es la enfermedad renal crónica (ERC)?

Se clasifica como una enfermedad inflamatoria sistémica

Zoccali C, Vanholder R, Massy ZA, et al (2017). Nat Rev Nephrol 3

 ¿Qué es la enfermedad renal crónica (ERC)?
• Trastorno de origen heterogéneo que lleva a la disminución de la tasa de
filtración glomerular.

4
Levey AS, Coresh J (2012) Chronic kidney disease. Lancet
 Epidemiología de la ERC

• La prevalencia de ERC ha ido en aumento debido al incremento de

enfermedades que son un factor de riesgo, y también debido al aumento de
la edad de la población.
• La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte.

En 1990 existieron 9.6 En 2010 existieron 11.1

muertes por 100.000 de 15.4% muertes por 100.000 de
población población

Lozano R, Naghavi M,et al (2012). Lancet 5

 Situación en Chile

• En Chile, se estima que

Dentro de los 10 países del la prevalencia de ERC es
mundo con mayor
de 3%
prevalencia 1000 por millón
de población

• En Chile la ERC no es de
Dentro de los 15 países del
mundo con mayor incidencia notificación obligatoria.
200 por millón de población

ERC requiere medidas de prevención temprana.

6
Zuñiga C, et al (2011). Rev Méd Chile.
Terapias para disminuir la progresión de ERC

• El tratamiento de la insuficiencia renal crónica se

basa en evitar la progresión de ésta.

7
 Moléculas de Retención Urémica (MRUs)

• La progresión de la ERC se atribuye a la retención

progresiva de una gran cantidad de compuestos
llamados MRUs.
Moléculas
pequeñas <0.5 KDa Urea y Creatinina
solubles en agua

Moléculas
Sulfato de indoxilo
unidas a <0.5 KDa
(IS) y p-Cresol
proteínas

Moléculas
0.5 - 12 KDa y
medianas y b2-microglobulina
>12 KDa
grandes
8
MRUs afectan a la Nefrona

9
 Efecto de Sulfato de Indoxilo y p-Cresol en las células
tubulares
Sulfato de Indoxilo

p-Cresol
RAAS

or
AT ad
O ort
sp
an
Tr

E-caderinas
Sangre

α-SMA

ROS
IS y p-Cresol promueven la progresión
de laCélula
ERC.tubular

10
Modificado de: Vanholder R, Schepers E, Pletinck A, et al (2014) J Am Soc Nephrol
 Efecto de Sulfato de Indoxilo en glomérulo

11
Ichii, O., Otsuka-Kanazawa, S., Nakamura, T., et al (2014) PLoS ONE
 Sulfato de Indoxilo y p-Cresol

Tirosina P-Cresol

Generan efectos
sistémicos
12
Niwa T (2010). Nagoya J Med Sci
 Efecto de la ERC en el Sistema Gastrointestinal y
microbiota

Zoccali C, Vanholder R, Massy ZA, et al (2017). Nat Rev Nephrol 13

 Microbiota normal

En la microbiota se encuentra compuesta

principalmente por Firmicutes, Bacteroidetes,
Actinobacteria, Proteobacteria y Verrucomicrobia.

Integridad y
función GI Puede variar
dependiendo de la
Efectos Efectos composición del
inmunológicos metabólicos medio.

14
Efecto de la ERC en el sistema Gastrointestinal

• En la ERC se produce una disbiosis en la microbiota.

Permite un influjo masivo dentro del tracto gastrointestinal, lo

Urea cual modifica el pH del lumen y puede causar enterocolitis
urémica.

Ácido úrico Es excretado por el sistema GI

Oxalato Es excretado por el sistema GI

15
Tratamientos para ERC afectan el sistema GI

Para prevenir hipercalemia y

Restricción sobrecarga de oxalatos lo cual limita el
dietaría consumo de frutas, vegetales y
productos altos en fibra.

Agentes El uso en periodos largos de estos

quelantes de agentes ha demostrado afectar la
fosfato microbiota intestinal.

Antibióticos Disbiosis.

16
 Se produce una disbiosis que contribuye a la
progresión de ERC
Los principales metabolizadores de tirosinas y triptófano son Enterobacterias.

Bifidobacterias
Enterobacterias y Lactobacilos

La microbiota se encuentra estrechamente relacionada con la

progresión de la ERC.
17
¿Los Lactobacillus tendrá la capacidad de disminuir
moléculas de retención urémica?

18
 Terapias con probióticos para evitar la progresión de
la ERC

Lactobacillus
capaces de
reducir fenol y p-
Cresol en el
medio

Nowak A, Libudzisz Z (2007). Ann Microbiol 19

 Terapias con probióticos para evitar la progresión de
la ERC

Miranda Alatriste PV, Urbina Arronte R, et al, (2014) Nutr Hosp 20

 Terapias con probióticos para evitar la progresión de
la ERC

21
Fang C-Y, Lu J-R, Chen B-J, et al (2014). J Funct Foods
Terapias con probióticos para evitar la progresión de
la ERC

22
 Pregunta de investigación
Las cepas L. bulgaricus 6c3 y L. acidophilus VIIIc2 que poseen actividad in vitro
para reducir MRUs, sin embargo, ¿Tendrán efecto en modelo murino al desarrollar
un simbiótico con inulina y FOS?.

Hipótesis

La progresión de la ERC causada por elevadas concentraciones de IS y pCr

plasmáticos disminuye debido a la administración de un simbiótico desarrollado
con las cepas L. bulgaricus 6c3 y L. acidophilus VIIIc2.

23
 Objetivo General
Desarrollar un simbiótico con las cepas L. bulgaricus 6c3 y/o L. acidophilus VIIIc2
capaz de disminuir la progresión de la ERC en modelo murino.

Objetivos Específicos

1. Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus con respecto a la

reducción de p-Cresol e IS para escoger el tratamiento que se administrará a ratas Sprague-
Dawley con ERC inducido.

2. Determinar los niveles plasmáticos de IS y p-Cresol luego de la administración del

tratamiento probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC inducido.
3. Evaluar el daño renal luego de la administración del tratamiento probiótico en ratas
Sprague-Dawley con ERC inducido.
24
 Objetivo 1: Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus
con respecto a la reducción de p-Cresol e IS.

Materiales y método

Productos lácteos y Diluciones seriadas y

farmacéuticos agar MRS
37°C por 24 hrs
Sulfato e indoxilo
G1 6c3 (IS) 21 µg/L

Inulina 12
G2 VIIIc2 g/L

G3 6c3 + VIIIc2 FOS 12 g/L

37°C en microaerófilia por p-Cresol 53

48 horas
µg/L 25
Objetivo 1: Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus
con respecto a la reducción de p-Cresol e IS

Resultados

Figura 1: Disminución de IS al inicio del experimento y luego de 48 horas de cultivo.

La cepa 6c3 disminuyo un 16% el IS, la cepa VIIIc2 redujo un 12%, al utilizar ambas

cepas, solo redujo un 7%.

26
Objetivo 1: Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus
con respecto a la reducción de p-Cresol e IS

Resultados

Figura 2: Disminución de pCr al inicio del experimento y luego de 48 horas de cultivo.

La cepa 6c3 disminuyo un 43% el p-cresol en el medio, mientras que la cepa VIIIc2 y el

cocultivo un 57%.

27
Objetivo 1: Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus
con respecto a la reducción de p-Cresol e IS

Discusión

Los resultados que observaron sugieren que

un Lactobacillus es capas de producir

enzimas para degradar MRUs como

creatinina.

28
Objetivo 1: Evaluar si existe sinergismo entre ambas cepas de Lactobacillus
con respecto a la reducción de p-Cresol e IS

Discusión

29
Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Materiales y método

Nefrectomía ⅚ en Cepas bacterianas en

Ratones Sprague Dawley anestesia con Xilacina y agua de bebida
de (8 a 10 semanas de Ketamina
edad)

HPLC para reducción de MRUs y creatinina para función

● Sangre renal. Evaluar hematocrito.
● Riñón Análisis Histológico (Tinción de Masson y H-E)

30
Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Materiales y método

Nef Lac
C

Nefrectomizada Nefrectomizada
Grupo control con tratamiento
sin tratamiento
probiótico

31
Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Resultados

1 Figura 3. (a) Niveles de creatinina en suero de ratas Sprague-Dawley al comienzo y al

final de las 16 semanas de administración del simbiótico. (b) Comparación entre
grupos.

(a) (b)

Control aumento un 2%, mientras que Existe diferencia significativa entre los

Nef y Lac aumentaron un 127% y 121% grupos Lac-control y Nef-Control, mientras

respectivamente. que en Nef-Lac no hubo diferencia.

32
Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Resultados

Figura 4. (a) Niveles de IS en suero de ratas Sprague-Dawley al comienzo y al final de las 16

semanas de administración del simbiótico. (b) comparación entre grupos.

(a) (b)

El grupo control aumento un 0.5%, el grupo Entre Lac-Control no hubo diferencia significativa,

Nef aumento un 38.8% y el grupo Lac mientras que en Nef-control y Nef-Lac si hubo

disminuyo un 0.8%. diferencia significativa. 33

Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Resultados

Figura 5. Valores de hematocrito de ratas Sprague-Dawley al final

de las 16 semanas de administración del simbiótico.

Control 41%, Nef 49% and Lac 50%.

34
 Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Discusión

(3-hydroxyphenyl)
propionic acid
T2 toxin tetrol
benzopyrene
phenethylamine
amebamide glucuronide

aspartyl
glutamine
35
Objetivo 2: Determinar niveles plasmáticos de IS y Creatinina luego de la
administración del probiótico en las ratas Sprague-Dawley con ERC

Discusión

36
Objetivo 3: Evaluar el daño renal luego de la administración del tratamiento
probiótico en ratas Sprague-Dawley con ERC inducido

Materiales y método

Tinción tricromica de
Masson
Cortados a 7 μm

Fijados en pfa Embebidos en

10% (12 hrs) parafina

Microscopia de
Cortados a 7 μm excitación de
dos fotones
37
 Objetivo 3: Evaluar el daño renal luego de la administración del tratamiento
probiótico en ratas Sprague-Dawley con ERC inducido

Resultados

1 Control Nef (ERC sin tratamiento) Lac (ERC con tratamiento)

Control 0% de tejido fibrótico,
Nef 25% y Lac 12%. Las
lesiones se ven en la capa
parietal del corpúsculo renal y
membrana basa de los
túbulos.

Hubo lesiones en todas las

muestras. La conformación del
colágeno fue igual para todas.
No se encontraron lesiones en
el corpúsculo renal.

38
Objetivo 3: Evaluar el daño renal luego de la administración del tratamiento
probiótico en ratas Sprague-Dawley con ERC inducido

Discusión

Hubo reducción significativa del área fibrótica en las

Las ratas Nx mostraron un aumento significativo del
ratas Nx +AST en comparación a las ratas Nx.
área fibrótica tisular en la tinción de Masson-tricromo
en comparación a las ratas Sham. El tratamiento lact
no mejoro el índice fibrótico.

39
 Objetivo 3: Evaluar el daño renal luego de la administración del tratamiento
probiótico en ratas Sprague-Dawley con ERC inducido

Discusión

RAAS

or
AT ad
O ort
sp
an
Tr

E-caderinas

α-SMA

ROS

40
Vanholder R, Schepers E, Pletinck A, et al (2014) J Am Soc Nephrol
 Conclusiones

1. No existe sinergismo entre las dos cepas de Lactobacillus estudiadas

2. El tratamiento desarrollado logra disminuir las concentraciones de IS en el suero, sin

embargo, no logra disminuir creatinina.
3. La progresión del daño renal disminuyó debido a la administración del simbiótico

41
 Financiamiento

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Investigación y Desarrollo del

Laboratorio Pasteur con el apoyo de los Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana,

Laboratorio de Biotecnología y Biofármacos, Laboratorio de Screening de

Compuestos Neuroactivos y Laboratorio de Desarrollo y Evolución (LADE)

42
 Proyección

• Utilizar marcadores celulares para evaluar el daño renal en conjunto con microscopia de
excitación de 2 fotones.

• Evaluar la efectividad en Humanos en una intervención nutricional.

43
 LA ADMINISTRACIÓN DEL SIMBIÓTICO
LACTOBACILLUS BULGARICUS 6C3, INULINA Y
FRUCTOOLIGOSACÁRIDO REDUCE LA
PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD RENAL
CRÓNICA EN EL MODELO MURINO
Alonso Jerez Morales
Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias con mención en Microbiología

Profesora tutora: Dra. Apolinaria García Cancino

Anexos

45
 Anexos

Duranton F, Cohen G, et al (2012) J Am Soc Nephrol

 Anexos
Creatinina
12

10
f(x) = 2.17275066177763E-06 x − 0.144662017009348
R² = 0.999440184027178
8

0
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000

p-Cresol
Sulfato de Indoxilo
2000
60
1800 f(x) = 4.56243218481881E-05 x − 21.4311849845354
50 f(x) = 1.06332011656235E-05 x − 0.925809213318459 1600 R² = 0.999761969043421
R² = 0.999552915019235
1400
40 1200
1000
30
800
600
20
400
10 200
0
0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000
0
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000
 Anexos

Zhang L y Davies S (2016) J Genome Medicine

 Anexos

Höglund E, Øverli Ø y Winberg S (2019) Front Endocrinol

 Daño cardiaco

1
2 Control Nef Lac
3
4
5
6
7
8
9

Figure 5. Masson’s trichrome stain of the heart of Sprague-Dawley rats. Fibrotic

areas are stained in blue (arrows). Nef: nephrectomized rats not receiving the
synbiotic, Lac: nephrectomized rats receiving the synbiotic. Control: sham-
nephrectomized rats. Scale bar 100 µm.

50
Anexo

51
Agradecimientos

52
A mi familia

53
A mis compañeros
del laboratorio

54
A la FCB y a mis
compañeros de trabajo
A mi profesora guía

56
¡A mi futura esposa!

57
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PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD RENAL
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Alonso Jerez Morales
Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias con mención en Microbiología

Profesora tutora: Dra. Apolinaria García Cancino