CAPITULO V

Vitaminas
VITAMINAS
 Introducción
• Compuestos de peso molecular relativamente bajo
que cualquier organismo vivo que dependa de la
materia orgánica como fuente de nutrientes,
requieren en pequeñas cantidades para el
metabolismo normal. Los humanos no pueden
sintetizar la mayoría de las vitaminas y, por lo tanto,
deben obtenerlas de los alimentos y los suplementos.
• Los niveles insuficientes de vitaminas resultan en
enfermedades carenciales [por ejemplo, escorbuto y
pelagra, que se deben a la falta de ácido ascórbico
(vitamina C) y niacina, respectivamente].
• serequiere información precisa sobre la composición
de los alimentos para determinar la ingesta dietética
para evaluar la adecuación de la dieta y mejorar la
nutrición humana en todo el mundo. Desde el punto
de vista del consumidor y de la industria, se requieren
métodos de ensayo confiables para garantizar la
precisión del etiquetado de los alimentos.
Métodos de extracción
•A excepción de algunos estudios de alimentación, los
análisis de vitaminas en la mayoría de los casos implican
procesos de extracción de su matriz biológica antes del
análisis. Esto generalmente incluye uno o varios de los
siguientes tratamientos: calor, ácido, álcali, solventes y
enzimas.
• Los procedimientos de extracción son específicos para
cada vitamina y están diseñados para estabilizarla.
Algunos procedimientos son aplicables a la extracción
combinada de más de una vitamina, por ejemplo, para
la tiamina y la riboflavina, así como para algunas de las
vitaminas liposolubles.
Los procedimientos de extracción
típicos son los siguientes:
Ácido ascórbico:

Extracción en frío con ácido metafosfórico / ácido acético

Vitamina B1 y B2:

Ebullición o autoclave en ácido más tratamiento enzimático.

Niacina:

Autoclave en ácido (productos no cereales) o álcali (productos de cereales)

Folato:

Extracción enzimática con α-amilasa, proteasa y γ-glutamil hidrolasa (conjugasa)

Vitaminas A, E o D:
Extracción con solvente orgánico, saponificación y reextracción con solventes orgánicos. Para
las vitaminas inestables como estas, los antioxidantes se agregan rutinariamente para inhibir la
oxidación.
• Para las vitaminas liposolubles, la extracción inicial con un solvente
orgánico hidrofóbico elimina todos los compuestos liposolubles de
los alimentos, incluidos todos los triacilgliceroles.
• El paso de saponificación (generalmente a temperatura ambiente o
reflujo a 70 ° C, utilizando un antioxidante que protege la muestra
de la oxidación) hace que los ácidos grasos liberados de los
triacilgliceroles sean insolubles en un solvente orgánico (por la
formación de una sal de potasio), pero las vitaminas liposolubles
permanecen solubles.
• Estasvitaminas luego se vuelven a extraer con un solvente
orgánico hidrofóbico y se concentran según sea necesario.
Métodos de análisis
Los ensayos para la determinación de vitamina se pueden clasificar
de la siguiente manera:
• Bioensayos con seres humanos y animales
• Ensayos microbiológicos que usan organismos protozoarios,
bacterias y levaduras
• Ensayosquímicos que incluyen el método espectrofotométrico,
fluorométrico, cromatográfico, enzimático, inmunológico y
radiométrico.
• Loscriterios de selección para un ensayo particular dependen de
una serie de factores, que incluyen precisión y exactitud, factores
económicos y cantidad de muestra. La aplicabilidad de ciertos
métodos para una matriz particular también debe ser considerada.
• Debido a la sensibilidad de ciertas vitaminas a condiciones adversas
como la luz, el oxígeno, el pH y el calor, se deben tomar las
precauciones adecuadas para evitar cualquier deterioro durante el
proceso analítico, independientemente del tipo de ensayo
utilizado. Esos pasos de precaución deben seguirse con el material
de prueba en bioensayos a lo largo del período de alimentación. Se
requieren métodos microbiológicos y químicos durante la
extracción y durante el procedimiento analítico.
MÉTODOS DE BIOENSAYO
• Fuera de los estudios de biodisponibilidad de vitaminas, los
bioensayos en la actualidad se usan solo para el análisis de
vitaminas B12 y D, sin embargo son muy limitadas, por ejemplo
para el caso de vitamina D (método AOAC 936.14), (especificado
para leche, preparaciones vitamínicas y concentrados para piensos)
se conoce como prueba de línea, que se basa en la calcificación
ósea. Las ratas se alimentan inicialmente con una dieta que agota
las ratas de vitamina D y luego se alimenta a grupos de ratas con
una cantidad conocida (para la curva estándar) o desconocida
(muestra) de vitamina D. Luego se sacrifican las ratas, y las
secciones de los huesos se tiñen para mostrar la extensión de la
calcificación ósea.
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS
• En ensayos microbiológicos, el crecimiento de un determinado
microorganismo en un extracto de una muestra que contiene
vitamina se compara con el crecimiento de este microorganismo en
presencia de cantidades conocidas de esa vitamina.
• El crecimiento se puede medir en términos de turbidez, producción
de ácido, gravimetría o respiración.
• Los análisis microbiológicos se limitan al análisis de vitaminas
hidrosolubles.
• Los métodos son muy sensibles y específicos para cada vitamina.
• Losmétodos consumen mucho tiempo, y el cumplimiento estricto
del protocolo analítico es fundamental para obtener resultados
precisos.
METODOS QUIMICOS
• Numerosas vitaminas ahora se miden comúnmente por HPLC (por
ejemplo, A, D, E, K, C, diversas vitaminas B), muchas como
métodos oficiales y otras no oficiales.
• La HPLC estándar se emplea comúnmente como un método oficial
de análisis para las vitaminas A (p. Ej., Método AOAC 992.04,
50.1.02), E (por ejemplo, método AOAC 992.03, 50.1.04) y D (por
ejemplo, método AOAC 2002.05, 45.1. 22A) y como un método de
control de calidad para la vitamina C.
• Los métodos de HPLC se consideran los únicos métodos aceptables
para proporcionar mediciones precisas de los alimentos de la
actividad de la vitamina A. La vitamina A también se puede analizar
utilizando columnas de HPLC de fase inversa.
HPLC
 Otros métodos químicos

https://www.youtube.com/watch?v=xFkJhuLqZvk
• Cada tipo de método tiene sus ventajas y desventajas.
• Al seleccionar un determinado método de análisis para una vitamina o
vitaminas en particular, se deben tener en cuenta una serie de factores,
algunos de los cuales se enumeran a continuación:
• Método de exactitud y precisión
•  La necesidad de información de biodisponibilidad
•  Requisitos de tiempo e instrumentación
•  Requisitos de personal
•  El tipo de matriz biológica a analizar
•  El número de muestras a analizar
•  Requisitos reglamentarios: ¿se deben utilizar los métodos oficiales de
AOAC International?
• En la actualidad, la aplicabilidad de los ensayos microbiológicos se limita a las
vitaminas hidrosolubles (más comúnmente niacina, B y ácido pantoténico).
Aunque toman algo de tiempo, generalmente se pueden usar para el análisis
de una matriz relativamente amplia de matrices biológicas sin
modificaciones importantes.
• Además, a menudo se requiere menos preparación de la muestra en
comparación con los ensayos químicos; sin embargo, con más y más
métodos oficiales que se desarrollan para HPLC y UHPLC, se espera que el
empleo de estos ensayos microbiológicos disminuya con el tiempo.
• Al seleccionar un sistema para el análisis, al menos inicialmente, es
aconsejable considerar el uso de métodos oficiales que han sido probados
mediante estudios interlaboratorios y que son publicados por organizaciones
tales como AOAC International, British Standards Institution, US
Pharmacopeial Convention o el AACC Internacional. De nuevo, uno debe
darse cuenta de que estos métodos están limitados a ciertas matrices
biológicas.
RESUMIEN DE VITAMINAS…
• Se han descrito tres tipos de métodos para el análisis de vitaminas
(ensayos biológicos y ensayos microbiológicos y químicos), con
énfasis en los métodos químicos. Los métodos son, en general,
aplicables al análisis de más de una vitamina y varias matrices de
alimentos. Sin embargo, los procedimientos analíticos deben
adaptarse adecuadamente al analito en cuestión y a la matriz
biológica que se analizará; cuestiones relacionadas con la preparación
de la muestra, la extracción y las mediciones cuantitativas también
están involucradas. Es esencial validar cualquier nueva aplicación de
forma directa mediante la evaluación de su exactitud y precisión.
• Lavalidación de métodos es especialmente importante con métodos
cromatográficos como la HPLC, porque estos métodos acentúan
básicamente las separaciones en lugar de la identificación de los
compuestos. Por esta razón, es esencial garantizar no solo la
identidad de estos compuestos sino también, su pureza.
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN GRASA
Vitamina A y precursores
Retinol AOAC 992.04 Vitamina A en leche y HPLC - 340 nm
fórmula infantil a base de
leche
Retinol AOAC 2001.13 Vitamina A en alimentos HPLC 328 o 313 nm
Todos los trans retinol AOAC 2011.07 Vitamina A en fórmulas UHPLC - 326 nm
infantiles y nutrición para
adultos
Todos los trans retinol EN 1283-1 Todos los alimentos HPLC 325 nm o
13 – cis – retinol Fluorescencia Ex λ =
325 nm , Em λ=475 nm
β – caroteno AOAC 2005.07 β-caroteno en suplementos y HPLC 445 o 444 nm
materias primas
β – caroteno EN 1283-2 Todos los alimentos HPLC 450 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN GRASA
Vitamina D
Colecalciferol AOAC 936.14 Vitamina D en alimentos Bioensayo
Ergocalciferol
Cholecalciferol AOAC 995.05 Vitamina D en fórmula infantil y HPLC 265 nm
Ergocalciferol productos enterales
Cholecalciferol AOAC 2002.05 Vitamina D en alimentos HPLC 265 nm
Ergocalciferol seleccionados
Cholecalciferol AOAC 2011.11 Vitamina D en fórmula infantil y UHPLC-MS/MS
Ergocalciferol fórmula nutricional para
adultos / pediátricos
Cholecalciferol AOAC 2012.11 Determinación simultánea de ESI LC-MS/MS
Ergocalciferol vitaminas D2 y D3 en fórmula
infantil y fórmula nutricional
para adultos / pediátricos.
Cholecalciferol EN 1282172 Vitamina D en alimentos HPLC 265 nm
Ergocalciferol
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN GRASA
Vitamina E
Todos los α-tocoferol AOAC 2012.10 Determinación simultánea de NP-HPLC Fluorescencia
racémicos vitaminas E y A en fórmulas Ex λ = 280 nm
infantiles y nutricionales para Em λ = 310 nm
adultos.
α-tocoferol AOAC 2012.09 Vitaminas A y E en fórmula HPLC Fluorescencia
infantil y fórmula nutricional Ex λ = 295 nm
para adultos / pediátricos Em λ = 330 nm
R,R,R – tocoferoles EN 12822 Vitamina E en alimentos HPLC Fluorescence
Ex λ = 295 nm
Em λ = 330 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN GRASA
Vitamina K
Filoquinona AOAC 999.15 La vitamina K en la leche y las HPLC reducción
fórmulas infantiles. postcolumna, Fluorescencia
Ex λ = 243 nm
Em λ = 430 nm
Fitonadiona (K1) AOAC 2015.09 Transvitamina K1 en nutrición NP-HPLC reducción
infantil, pediátrica y para postcolumna, Fluorescencia
adultos Ex λ = 245 nm
Em λ = 440 nm
Filoquinona EN 14148 Vitamina K en alimentos HPLC reducción
postcolumna,Fluorescencia
Ex λ = 243 nm
Em λ = 430 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Vitamina C
Acido Ascórbico AOAC 967.21 Vitamina C en jugos y Valoración con 2,6-
preparaciones vitamínicas dicloroindofenol
Acido Ascórbico AOAC 967.22 Vitamina C en jugos y Fluorescencia
preparaciones vitamínicas Ex λ = 350 nm
Em λ = 430 nm
Acido Ascórbico AOAC 2012.21 Vitamina C en fórmula HPLC 254 nm
infantil y fórmula nutricional
para adultos / pediátricos
Acido Ascórbico AOAC 2012.22 Vitamina C en fórmula UHPLC 254 nm
infantil y fórmula nutricional
para adultos / pediátricos
Acido Ascórbico EN 14130 Vitamina C en alimentos HPLC 265 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Vitamina B1
Tiamina AOAC 942.23 Tiamina en alimentos Tiocromo
Fluorescencia
Ex λ = 365 nm
Em λ = 435 nm
Tiamina AOAC 2015.14 Vitaminas totales B1, B2 y B6 Digestión enzimática y
en fórmula infantil y UHPLC-MS / MS
productos nutricionales
relacionados
Tiamina EN 14122 Tiamina en alimentos HPLC Tiocromo
Fluorescencia
Ex λ = 366 nm
Em λ = 420 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Vitamina B2
Riboflavina AOAC 970.65 Riboflavina en alimentos y Fluorescence
preparaciones vitamínicas. Ex λ = 440 nm
Em λ = 565 nm
Riboflavina AOAC 2015.14 Vitaminas totales B1, B2 y B6 Digestión enzimática y
en fórmula infantil y UHPLC-MS / MS
productos nutricionales
relacionados
Riboflavina EN 14152 Rivoflavina en alimentos HPLC
Fluorescencia
Ex λ = 468 nm
Em λ = 520 nm
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Niacina
Ácido nicotínico AOAC 944.13 Niacina y niacinamida en Microbiológica
Nicotinamida preparaciones vitamínicas.
Ácido nicotínico AOAC 985.34 Niacina y niacinamida en Microbiológica
Nicotinamida preparaciones vitamínicas.
Vitamina B6
Piridoxina AOAC 2004.07 Vitamina B6 total en fórmula HPLC
Piridoxal infantil Fluorescencia
Piridoxamina Ex λ = 468 nm
Em λ = 520 nm
Piridoxina AOAC 2015.14 Vitaminas totales B1, B2 y B6 Digestión enzimática y
Piridoxal en fórmula infantil y UHPLC-MS / MS
Piridoxamina productos nutricionales
relacionados
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Acido fólico, folato
Folatos totales AOAC 2004.05 Folatos totales en cereales y productos a Microbiológica
base de cereales: procedimiento de
trienzima
Folatos totales AOAC 2011.06 Folatos totales en fórmulas infantiles y Extracción de trienzima y
nutricionales para adultos. HPLC-MS / MS
Acido folico AOAC 2013.13 Folato en fórmula infantil y fórmula Extracción de trienzima y
Ácido 5-metil nutricional para adultos / pediátricos UHPLC-MS / MS
tetrahidrofólico
Vitamina B12
Cianocobalamina AOAC 986.23 Cobalamina (vitamina B 12) en fórmula Microbiológica
infantil a base de leche
Cianocobalamina AOAC 2011.10 Vitamina B 12 en fórmulas infantiles y HPLC 550 nm
pediátricas y nutricionales para adultos.
Cianocobalamina AOAC 2014.02 Vitamina B 12 en fórmulas infantiles y UHPLC 361 nm
pediátricas y nutricionales para adultos.
 Métodos reguladores comúnmente
utilizados para el análisis de
vitaminas.
VITAMINAS DESIGNACION APLICACION ENFOQUE
DEL METODO
VITAMINAS SOLUBLES EN AGUA
Biotina
Biotina USP29 / NF24, Biotina en suplementos dietéticos HPLC 200 nm o microbiológica
monografía
oficial de
suplementos
dietéticos
Acido pantoténico
Pantotenato de AOAC 992.07 Ácido pantoténico en fórmula infantil a base Microbiológica
calcio de leche
Pantotenato de AOAC 2012.16 Ácido pantoténico (vitamina B5) en fórmula UHPLC-MS/MS
calcio infantil y fórmula nutricional para adultos /
pediátricos