UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Facultad de Ciencias Naturales y

Matemáticas

Sesión N° 08 y 09:

Recuento Bacteriano UFC y NMP

Asignatura: Microbiología I
Semestre Académico 2021-1
 Replicación bacteriana: fisión
binaria o bipartición.
 De una célula madre se
originan dos células hijas
idénticas.
 Crecimiento ordenado de todos
los constituyentes y estructuras
celulares.
 Aumento exponencial en el
número de células.
Aumento
exponencial en el
número de
células de la
población
CRECIMIENTO INDIVIDUAL
 La bacteria alcanza un tamaño y peso fijo. Constituye el paso previo

a la división celular.

CRECIMIENTO POBLACIONAL

 Es el incremento en el número de células como consecuencia del

crecimiento y división celular.

MÉTODOS DE EVALUACIÓN DEL
CRECIMIENTO

1. Determinación del nº de microorganismos

• Métodos directos: recuento total
– Recuento microscópico directo
(cámara de Neubauer)
– Conteo electrónico (citometría de flujo)
• Métodos indirectos: recuento de viables
– Recuento en placa
– Filtración por membrana e incubación
– Número más probable (NMP), en medio líquido
 Determinación del nº de m.o:
Recuento microscópico directo (Cámara de Neubauer)

• Determinar el número total de organismos de una muestra:

Se utilizan cámaras de recuento (cámara de Petroff-Hauser
o Neubauer) y se visualiza al microscopio.
• Es un método rápido, pero no distingue entre viables o
no viables
• Células muy pequeñas no se ven bien
• No es útil para muestras con baja carga celular
• Pueden contarse materiales del cultivo de manera
errónea
Recuento en Cámara de Neubauer.
Se obtiene nº de células por unidad de vol.
• No se distinguen células muertas.
• Cél. pequeñas no se ven bien.
• No es útil para muestras poco densas

Filtración por membrana

Muestras líquidas
Baja densidad bacteriana
 ALIMENTO

CAJA
MICROSCOPIO
PETRI

 La célula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el

medio de cultivo.
 Se basa en que cada colonia surge de una simple célula.
 Cada colonia contiene una sola especie bacteriana.
 Determinación del nº de m.o: Recuento en placa

• Es un método muy utilizado cuando se necesita determinar

el tamaño de la población bacteriana de una muestra
(alimento, productos farmacéuticos, aguas, producción de
vacunas).
• Se basa en que cada uno de los microorganismos presentes
en la muestra desarrollará una colonia visible
• Cada colonia observada se formó a partir de por lo menos
un microorganismo. Entonces la colonia es considera una
unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos de los
cálculos.
 El número de bacterias viables por muestra se
expresa en:

U NIDADES F ORMADORAS DE C OLONIAS (UFC)

Representa cada colonia contada y su número total representa el número

total de bacterias viables en la muestra.
 DETERMINACIÓN
No. UFC

Método de vertido Método de extensión

en placa en placa
 Determinación del nº de m.o: Recuento en placa

• Una vez pasado el tiempo de incubación se cuentan las colonias crecidas en la superficie.
• Solo se cuentan las placas que tienen entre 30 a 300 colonias y luego se realiza un
promedio.
• Como calcular las ufc/ml:

• Ufc/ mL de muestra = Nº de colonias contadas x Factor de

dilución
mL de la muestra sembrada

Factor de dilución: Inversa de la dilución

 Determinación del nº de m.o: Recuento en placa

• Método de recuento en superficie (recuento por

extensión en placa):
• Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000,
1/
10.000 y 1/ 100.000 de la muestra anterior respetando
un volumen final de 5 a 9 ml.
• Se rotulan 5 placas (una para cada dilución) sembrar 0.1
ml (con pipeta limpia en cada una) de cada dilución en
una placa de Petri con Agar Nutritivo o TSA y con ayuda
de un rastrillo extenderlo por toda la placa.
• Incubar a 37 °C durante 24 a 48 hs.
MÉTODO DE EXTENDIDO EN PLACA

 Es el método de elección para anaerobios facultativos y cultivo de

microaerófilos.
  Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA.

 Útil para la técnica
de

vertido en placa o extensión

en placa.

 Se siembran

volúmenes conocidos de

cada dilución
 Luego se incuba a 35 – 37 0C

durante 24 – 48 horas.
 Finalizado el tiempo de incubación, se realiza el recuento.

 Se toman en cuenta únicamente aquellas cajas Petri que tengan

entre 30 y 300 colonias.

 Este número de colonias es estadísticamente representativo.

 Aquellas placas que tengan más de 300 colonias se reportan como

“INCONTABLES”.
 Para el recuento bacteriano se puede usar cuentacolonias.
 Puede ser contada toda la placa o por cuadrantes.

 Cuando la carga bacteriana es alta, se toma en cuenta un cuadrante con

carga alta, un cuadrante con carga media y un cuadrante con carga baja.

 Se realiza la sumatoria de los tres cuadrantes y se saca el promedio.

 Finalmente el promedio se multiplica por 65

No. Colonias = (CA + CM + CB /3) * 65

 CA = 32
 CM = 19
 CB = 10
 Sumatoria
Σ = 61
 Promedio
61/3 = 20.33
 Factor
= 20.33*65
= 1322
Terminado el conteo por cualquiermétodo, se
debe aplicar la
siguiente fórmula para obtener el No. de UFC/ ml o UFC/g.

UFC/ml ó UFC/g = No. de colonias por placa X el factor de dilución *

ml de la muestra sembrada

*Factor de dilución: inversa de la dilución.

 EJEMPLO 1  EJEMPLO 2

No. de colonias: 280 No. de colonias: 56

Dilución: 10 -3 Dilución: 10 -4

Volumen de siembra: 1 ml Volumen de siembra: 0.2 ml

UFC/ ml = 280 X 1000 /1 UFC/ ml = 56 X 10000 /0.2

UFC/ ml= 280.000 UFC/ ml= 2 800.000

 Cuando se realiza más de una dilución para cada uno de los parámetros

se garantiza los resultados obtenidos.

 Este método disminuye el margen de error y abaliza la calidad de las

pruebas.

 Para obtener los resultados por duplicado se aplica la siguiente fórmula:

UFC / ml parámetro = UFC / ml dilución A + UFC / ml dilución B

2
 Ejemplo 1
Dilución A: 5 600.0000
Dilución B: 6 000.000
Resultado : 5 600.000 + 6 000.000 / 2 = 5 800.000 UFC / ml FLORA TOTAL

 Ejemplo 2
Dilución A: 1 245.647
Dilución B: 2 340.500
Resultado: 1 245.647 + 2 340.500 / 2 = 1 793.074 UFC / ml
FLORA
COLIFORME
• Veamos un ejemplo con
números……….

Ufc/ mL= 159(colonias contadas) x 1000 (inverso del factor de dilución que es
10 -3)
1mL (volumen que sembré en la placa)

Ufc/ mL = 159000 = 1,59 x 105 ufc/ mL

BROCK. BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS (12ª EDICION) JOHN MARTINKO , ADDISON-WESLEY, 2009
 Para
pensar:
•Problema 1:
• Nº de colonias contadas:
280 Dilución: 10-3
280 x 1000 / 1mL = 280.000 =2,8 x 105 ufc/
• Volumen sembrado: 1 mL
mL Ufc/ mL: ????????

• Problema 2:
• Nº de colonias:
56 x 10000 / 0,2 mL =2.800.000 =2,8 x 106 ufc/
56 Dilución: mL
10-4
• Volumen sembrado: 0,2
mL Ufc/ mL:?????????
Determinación del nº de m.o: Recuento
en placa

• Método de recuento incorporado (recuento por inclusión o

recuento por vertido en placa):
• Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/
100.000 de la muestra anterior respetando un volumen final de 5 a 9 ml.
• Se rotulan 5 placas (una para cada dilución) sin medio de cultivo. Fundir
el medio a utilizar y termostatizarlo a 45ºC no más.
• Sembrar en cada placa cada una de las diluciones (1mL) y luego colocar
el medio de cultivo termostatizado.
• Agitar suavemente (homogenizar), esperar que solidifique el medio e
incubar a 37ºC durante 24 a 48 hs.
 1/10000 (10-4) 1/100000 (10-5) 1/1000000 (10-6)
1 mL 1 mL 1mL

142 colonias 30 colonias 17

colonias
Ufc/ mL= 142(colonias contadas) x 10000(inverso del factor de dilución que es 10
-4)

1mL (volumen que sembré en la placa)

Ufc/ mL = 1420000 = 1,42 x 106 ufc/ mL

 Determinación del nº de m.o:
Recuento por filtración en
membrana

• Se realiza por filtración de un volumen de la

muestra a través de un filtro de membrana de
tamaño adecuado para retener a las bacterias (0.22
-
0.45 µm)
• El filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido
y se incuba.
• Luego se cuentan las colonias que crecieron en
el filtro.
• Se utiliza con frecuencia para determinar el
número de bacterias en agua.
 Determinación del nº de m.o: Numero mas
probable (NMP)

• Nos proporciona un recuento de viables

• Se basa en el principio de que una única célula viva
puede desarrollarse y producir un cultivo turbio
• Requiere la realización una serie de diluciones seriadas
al décimo de la muestra de cultivo, en un medio
líquido adecuado para el crecimiento de dicho
organismo
• Puede emplearse para determinar la
contaminación del agua potable o de alimentos
 5 3 1

Ir a la tabla de NMP y buscar la cifra

531
CÁLCULO:

factor de dilución (primero usado) x NMP (tabla) = N° de células /

mL

1000 x 11,0 = 11.000 células / mL=11 x 103 celulas/ mL

Para pensar:

•Se siembra un NMP con las siguientes diluciones :

1/ 10.000, 1/100.000 y 1/1.000.000 y el resultado
al saca los tubos de la estufa es el siguiente:
•4 2 1
•Indique cual es el resultado / mL de muestra