UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMATICA

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular

GUIA DE PRÁCTICAS

BIOQUÍMICA I
(Escuela Profesional de Química)

AUTORES:

Mg. Ana I. F. Gutiérrez Román

Mg. Carlos M. Santa Cruz Carpio
Mg. Oscar P. Nolasco Cárdenas

Lima – Perú

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 2017

Contenido

Temas

1 Introducción

2 Preparación de los Experimentos y registro

3 Medidas de Seguridad

4 Organización de los grupos de práctica

5 Extracción de ADN

6 Osmosis y Difusión transporte Célula vegetal

7 Osmosis y Difusión transporte Célula animal

8 Cálculos en bioenergética

9 Mecanismo de acción del ATP en los Organismos vivos

10 Glicólisis con levaduras

11 Medida de la velocidad inicial de la amilasa 4 practicas

12 Cinética enzimática

13 Efecto de pH y temperatura

14 Efecto de inhibidores sobre la velocidad enzimática

15 Oxido Reducción por la succinico deshidrogenas hígado y aceite capri

16 Fotosíntesis

17 Bibliografía

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Correos de los autores:
Mg. Milagros Quintana Cáceda milagros quintana@gmail.com
Ana Gutiérrez Román: anaisabelflor@gmail.com
Carlos Santa Cruz Carpio: santacruzcm@yahoo.es
Oscar Nolasco Cárdenas: oscarnol@gmail.com

Introducción
Para la comprensión de la Bioquímica, actividad intelectual abierta con
limitaciones que establece el método científico, se requiere una actitud de
curiosidad despierta para observar hechos en condiciones experimentales.

La capacidad de obtener información precisa al máximo de exactitud,

registrar, ordenar y presentar los datos en forma comprensibles a los observadores
independientes que tengan acceso a ellos es una habilidad que no se logra sino es
por la práctica personal del ejercicio.

El costo, espacio y tiempo disponible han hecho imposible el diseño de

prácticas en paralelo con la teoría. Es por ello que la mayoría de las escuelas de
Biología de vanguardia en la educación biológica han reducido radicalmente el
tiempo dedicado al Laboratorio de Bioquímica. Sin embargo, la experiencia
didáctica, nos indica que la práctica de experimentos elementales y sencillos,
aplicados a la biología, estimula el interés científico de los estudiantes de
Bioquímica.

La presente Guía de Prácticas, tiene la finalidad de cumplir con los

siguientes Objetivos Específicos:

1. Ejercitar a los alumnos en el método científico mediante el manejo de técnicas

generales y sencillas, aplicables a múltiples problemas particulares.

2. Desarrollar habilidad para programar experimentos, sistematizar el trabajo de

laboratorio, manipular los equipos y realizar mediciones u observaciones
rigurosas, así como saber expresar sus resultados.

3. Procurar el desarrollo de iniciativa personal y de razonamiento lógico frente a

problemas que se planteen, de tal modo que el alumno pueda realizar
innovaciones o variaciones en los métodos de trabajo.

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4. Desarrollar el sentido de responsabilidad social para manejar los recursos
humanos y materiales que inciden en su propia formación.

5. Exigir en forma intransigente una actitud de honestidad intelectual.

Por la naturaleza de las prácticas y para poder cumplir con sus objetivos es
imprescindible una participación activa y personal tanto de alumnos como de
docentes.

Mg. Ana I. F. Gutiérrez Román

Mg. Carlos M. Santa Cruz Carpio

FCCNM – UNFV
Enero 2010

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Preparación de experimentos y registro de resultados
El registro de los resultados de los experimentos es una parte esencial de
cualquier trabajo científico. Los experimentos de laboratorio son el fundamento de las
hipótesis, teorías, conocimientos científico y tecnología, y son inútiles si no se
consigna por escrito la descripción de lo que se ha hecho y observado en tal forma
que permita a cualquiera, con cierto conocimiento del asunto, que repita, compruebe
o corrija el trabajo realizado sin necesidad de guía especial.

Las anotaciones deben ser breves y muy claras; se llevarán en las páginas en
blanco de esta guía, así como las gráficas y calibraciones de los experimentos que lo
requieran. Se harán inmediatamente después de cada experimento sin confiar a la
memoria un momento más de lo necesario.

Para que los experimentos de laboratorio tengan valor formativo, se aprenda a

hacer observaciones exactas, se estimule la curiosidad y se desarrolle un sentido
crítico basado en los aspectos cuantitativos de la ciencia es necesario que antes de
iniciar el trabajo en el laboratorio:

se revise en textos, los principios fundamentales implicados

se reflexione y relacione con otros principios o hechos previamente conocidos
se estudie y comprenda bien las instrucciones del experimento antes de realizarlo

La guía se conservará limpia y ordenada, para permitir la lectura fácil de las

anotaciones, que deben ser una descripción completa y honesta de lo que ha visto y
echo. No es aceptable hacer anotaciones en borrador para después pasarlo en limpio y
conceder al aspecto estético un valor que no merece.

Aunque los experimentos que se harán, producen resultados previsibles por las
teorías conocidas que de ellos se derivan originalmente, cualquier resultado
imprevisto, raro, o aún absurdo debe anotarse y de ningún modo llenar el protocolo
con lo “que debió pasar” pues sería una relación completamente inútil. Los asientos
falsos o las omisiones no enseñan nada. Sí en cambio, el análisis concienzudo de los
resultados inesperados o contrarios a lo previsto, que pueden ser fuente de mucha
información útil para el desempeño futuro en el laboratorio.

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Medidas de Seguridad
Todos los accidentes personales por triviales que sean deben comunicarse al profesor
encargado de la práctica.

Las sustancias que se utilizan, y las operaciones que se realizan en el laboratorio son
potencialmente tóxicas y peligrosas. Trabaje con cuidado, atento a los eventos que puedan
comprometer la seguridad personal o colectiva.

1. Usar mandil, para proteger la ropa y el cuerpo

2. No fumar en el interior del laboratorio

3. No consumir alimentos, ni bebidas en el laboratorio

4. No utilizar la llama del mechero sin cerciorarse antes de que no haya cerca
líquidos inflamables.

5. Dirija la boca del tubo o matraz de reacción, lejos de sí mismo y del vecino, el
contenido puede proyectarse.

6. Con los líquidos corrosivos, ácidos y álcalis concentrados, o venenosos, se debe

tener cuidado de no inhalar sus vapores y el contacto con cualquier parte del cuerpo.
Si se tiene contacto accidentalmente, lávese de inmediato con abundante agua del
caño y avise al profesor.

7. No mantenga el mechero o cocina encendida sin necesidad.

8. No arroje sólidos (grasa, cerillos, papel de filtro, etc.) al desagüe.

9. Cuídese de no arrojar cerillos encendidos o incompletamente apagados a los

depósitos de basura.

10. No cambie de lugar los reactivos para uso del grupo. Deben estar disponibles
para todos.

11. No confunda los tapones de los frascos de reactivos ni se introduzcan en ellos

pipetas o goteros. De preferencia sirva un poco del que necesita en un tubo de ensayo
o matraz muy limpio y de allí sírvase para su experimento.

12. Tenga especial cuidado con los solventes volátiles que pueden llegar a provocar
explosiones. Si se vierte accidentalmente sobre la mesa, séquela inmediatamente con
un trapo húmedo y enjuáguese éste en el chorro de agua, exprimiéndolo.

13. Conserve limpio su lugar. Lave con mucho cuidado el material de vidrio y

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 enjuagar con abundante agua

Actividad N°1:Coordinación y formación de grupos

En esta actividad se organizarán los grupos de trabajo de acuerdo al horario y número
establecido por la EPQ y de acuerdo a la asistencia de los alumnos, los integrantes se
mantendrán en su respectivo grupo por todo el semestre académico, serán responsables del
cumplimiento de lo solicitado para el mejor desarrollo de las actividades programadas.

Actividad N°2:EXTRACCIÓN DE ADN

Introducción

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos
son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior
extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente,
vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN.
En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción.

Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en

cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda,
por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente.

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración.

Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas y deshidratación
de la molécula, lo cual posibilita su agregación y precipitación.

Objetivo

El objetivo fundamental de esta práctica es utilizar unas sencillas técnicas para poder
extraer el ADN

Materiales

 Solución de Cloruro de sodio al 2 %

 Detergente no ionico al 1%
 Alcohol isopropílico frio

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 Colorante azul de metileno
 3 vasos descartables plástico o de cristal limpios

Procedimiento

1. Beber (sin tragar) tres cucharadas de solución salina y removerla en la boca

durante un minuto.
2. Devolver la solución salina a un vaso (esto se hace para coger células
epiteliales de la boca y así poder extraer el ADN de ellas). RECORDAR
QUE ES ADN de tus células y de las bacterias presentes en la boca.
3. Añadir un ml de la solución detergente a la solución que contiene las
células epiteliales extraídas de nuestra mucosa bucal. Remover despacio
para no hacer burbujas (así rompemos las membranas celulares y podemos
extraer el ADN de las mismas). Verter en un tubo unos 5 ml de este lisado
celular.
4. En un tubo por separado, mezclar los 1ml de alcohol isopropílico frio con
tres gotas de azul de metileno.
5. Con cuidado verter la mezcla del alcohol y colorante en el tubo que
contiene el lisado celular, inclinando el tubo para que el alcohol genere una
capa sobre el lisado celular.
6. Esperar 5 minutos y ver cómo se forman grumos y cadenas blancas.

Como el ADN no es soluble en alcohol, forma un sólido en la interfase de la capa

de alcohol y agua salada (donde las capas se juntan). La mayor parte de las
células epiteliales se verán disueltas en el agua salada, mientras que las cadenas
blancas serán miles de moléculas de ADN unidas unas contra la otra formando
grumos. Las moléculas de ADN individuales son demasiado pequeñas para ser
vistas a simple vista.

A partir de la longitud enorme de las fibras, también se confirma que en el núcleo el ADN
se encuentra compactado.

Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción no es ADN

puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción
especifica se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y
proteínas (protocolos de PURIFICACIÓN de ADN).

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Alternativa extracción a partir del manto de choros

Osmosis y Difusión

Objetivos:

a) Observar los fenómenos de difusión y ósmosis

b) Describir la importancia en el intercambio de sustancias en la célula.

Teoría:
La membrana plasmática celular es una bicapa lipídica fluida y semipermeable, ya que
permite el paso de algunos solutos hacia el interior de la célula.
Muchas sustancias, además del agua, entran a la célula y salen de ella por efecto de los
gradientes de concentración, aunque sólo unas cuantas (CO2 y O2) puedan hacerlo tan
fácilmente como el agua.
El volumen celular cambia cuando el agua penetra o sale de la célula por un proceso
denominado osmosis. Por lo cual, las células de los organismos pluricelulares deben
permanecer en equilibrio osmótico con los líquidos tisulares que los bañan.
La ósmosis se define como una difusión pasiva,
caracterizada por el paso del agua, disolvente, a través
de una membrana semipermeable, desde la solución
más diluida a la más concentrada.
Si los líquidos extracelulares aumentan su
concentración de solutos, se haría hipertónica respecto
a las células, como consecuencia se originan pérdida
de agua y deshidratación (las células animales se
crenan y las vegetales la membrana puede desprende
bruscamente de la pared
celular ocurriendo la
plasmólisis)

De igual forma, si los

líquidos extracelulares se
diluyen, se hacen
hipotónicos respecto a las

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células.

El agua tiende a pasar al protoplasma y las células se hinchan y se vuelven turgentes,

pudiendo estallar (en el caso de células vegetales la pared de celulosa lo impediría, en el
caso de los animales puede producirse la lisis celular), por un proceso de turgescencia.

Según el medio en el que se encuentre la célula, la membrana dejará pasar algunos solutos,
modificando así la turgencia de la célula.

Materiales Microscopio óptico

 Agua destilada
 Tubos de ensayo
 Algodón
 Gradillas
 Marcador de vidrio
 Solución hipotónica NaCl 0.065 M (0.43%)
 Solución hipertónica NaCl al 2% y 4%
 Azul de metileno
 Solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico)

Deberás traer de casa

Lanceta hematológica
 3 Goteros
 Planta Elodea
 Cebolla
 Buscar el coeficiente de extinción molar de la hemoglobina

Procedimiento

Actividad N°3: Prueba en células vegetales

1. En cinco laminas numeradas coloque:
-0.5 ml. de solución hipotónica NaCl 0.09 %
-0.5 ml. de solución hipotónica NaCl 0.45 %
-0.5ml. de solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico)
-0.5 ml. de solución de hipertónica NaCl al 2%
-0.5 ml. de solución de hipertónica NaCl al 4%
2. Colocar una hoja de Elodea en cada solución y esperar 3 a 5 min.
3. Colocar una laminilla y observar.
Repetir con muestras de cebolla

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Actividad N°4: Prueba en células animales
1. Colocar los tres huevos en un vaso de precipitación de 1 litro y verter el vinagre hasta cubrir
completamente los huevos. Debe realizarse este proceso 5 días antes de la práctica.
2. Al momento de la práctica lavar con mucho cuidado con agua de caño.
3. Frotar cuidadosamente con los dedos para sacar la cáscara. Realizar este proceso hasta tener
casi un tercio del huevo libre de cáscara.
4. Coloquen agua de caño en uno de los vasos de precipitación de 100ml y ubiquen allí uno de los
huevos. El agua debe cubrir al huevo.
5. En otro vaso de precipitación colocar un huevo en la mezcla muy concentrada de sal en agua y
colocar allí otro de los huevos.
6. Llenar el tercer vaso con agua destilada y poner allí el tercer huevo.
7. en cada frasco se adicionó unas gotas de azul de metileno
8. Dejar por una hora y observar membrana y el contenido interno del huevo.
NOTA: En todos los vasos de precipitación, los huevos deben quedar sumergidos en el
líquido.

Alternativa
1 En cinco tubos de ensayo numerados coloque:
-1 ml. de solución hipotónica NaCl 0.09 %
-1 ml. de solución hipotónica NaCl 0.45 %
-1 ml. de solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico)
-1 ml. de solución de hipertónica NaCl al 2%
-1 ml. de solución de hipertónica NaCl al 4%
2 Obtener unas gotas de sangre empleando la lanceta hematológica en un tubo limpio
con heparina
3 Dejar caer 3 a 4 gotas de sangre en cada uno de los tubos con un gotero (o directamente
de la punción).
4 Agite los tubos y dejar en reposo durante 2 ó 3 minutos.
5 Con un gotero coloque en una lámina portaobjeto una gota de cada uno de los tres
tubos.
6 Luego examine en el microscopio su aspecto. Observar qué efecto ha tenido las
distintas soluciones sobre la morfología del eritrocito y explicar por qué.
7 Estime la concentración de hemoglobina al espectrofotómetro

Cuestionario:
1. Dibujar todo lo observado en la práctica que pueda servirle para la discusión de sus
resultados.
2. Indique en que muestras se observó: a) Osmosis b) Difusión c) Turgencia d)
Plasmólisis
3. Mencione y dibuje las diferencias encontradas en cada uno de los huevos sometidos a
cada proceso.
4. ¿Qué factores podrían afectar la velocidad de difusión?
5. Defina el movimiento Browniano y como se relaciona con la difusión?
6. Diferencie la pared celular de la células vegetales.

Bibliografía:
1. ..

Page 11
2. ..

Actividad N°5: Cálculos en bioenergética

En esta actividad tiene un carácter de dinámica pequeña de grupo, en ella se desarrollarán
problemas para el cálculo de las variaciones de energía en un determinado proceso
biológico, cada alumno deberá conseguir 10 problemas de esta temática los cuales serán
intercambiados en clase discutidos y resueltos con la ayuda del profesor. Los problemas
podrán ser obtenidos de los textos de bioquímica que figuran en la bibliografía del sillabus
o de páginas webs de internet.

Actividad N°6: Mecanismo de acción del ATP en los

Organismos vivos
En esta sesión de seminario y discusión los alumnos buscaran artículos recientes sobre el
rol y el mecanismo de acción del ATP en un sistema biológico, estos artículos serán
presentados y expuestos por el alumno discutidos y evaluados.

Actividad N°7:Glucolisis con levadura

Objetivos:

a)Diferenciar respiración anaeróbica de aeróbica.

b)Definir y comprender la fermentación, conocer sus materiales de partida y sus
productos finales.
c)Estudiar la tasa de fermentación en levadura midiendo la producción de CO2.
d) Analizar el efecto de la presencia de O2 en cultivos anaerobios de levadura.

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Teoría

Los heterótrofos obtienen energía oxidando moléculas orgánicas y acoplando las

reacciones de oxidación a la síntesis de ATP. El ATP es entonces usado para realizar
reacciones metabólicas necesarias para mantener la integridad física del organismo y
sustentar todas sus otras actividades.

Algunos organismos son capaces de existir en ausencia de oxígeno molecular y

pueden ser perjudicados por la presencia de este elemento. La respiración anaeróbica, en
ausencia de oxígeno es llamada fermentación. Comienza con una sustancia rica en energía
como la glucosa, utiliza las enzimas de la glicólisis y finalmente produce etanol y anhídrido
carbónico o una mezcla de ácidos orgánicos y otros compuestos. Hay una ganancia neta de
solamente dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa oxidada en la fermentación.

Las levaduras son hongos eucarióticos unicelulares comercialmente muy

importantes. Ellas son necesarias para la producción de cerveza, vino, pan y productos
químicos industriales. En este experimento se estudiará la producción de CO 2 durante la
fermentación de varios carbohidratos por células de levadura y el efecto del O2 en la
fermentación.

Cuando microorganismos facultativos se están cultivando anaeróbicamente y se

exponen al oxígeno, hay una inhibición de la fermentación alcohólica y disminución del
consumo de glucosa, esto es conocido como efecto Pasteur y refleja el incremento de
rendimiento energético obtenido por el metabolismo respiratorio de la glucosa comparado
con el obtenido por la fermentación de la glucosa. Cuando se consume glucosa
aerobiamente por cada mol oxidado se producen 36/38 moles de ATP, por lo que se
consume menos glucosa que cuando se oxida por la vía anaerobia en la que solo se obtienen
2 moles de ATP por mol de glucosa.

2(ADP+Pi) 2ATP

GLUCOSA

ETANOL
Figura Nº1. Destino de la glucosa en condiciones aerobias (respiración) o anaerobias (fermentación).

Materiales y Reactivos:

1. Pipetas Pasteur 2. Parafilm

2. Tubos de ensayo 3. Levadura
3. Pipetas graduadas 4. Sacarosa 2%

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5. Galactosa 2% 7. Almidón 2%
6. Glucosa 2%

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Experimento I:

1. Debe disponer de una gradilla, una piseta con agua destilada, seis tubos de ensayo, seis
pipetas graduadas de 2 ml, seis pipetas Pasteur con bulbo y trozos de parafilm. Marque
los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llénelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de sacarosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de galactosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 4 = 1.25 ml de almidón (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 5 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensión de levadura.
2. Mezcle las soluciones. Selle el extremo inferior de una pipeta graduada con parafilm.
3. Usando la pipeta Pasteur llene completamente la pipeta graduada con la solución del tubo
1 por el extremo superior.
4. Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido. Invierta
luego todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la pipeta.
Repita el procedimiento con los demás tubos.
5. El gas producido se acumulará en el extremo cerrado de la pipeta graduada.
6. Registre el nivel del gas en las pipetas cada 2 minutos por alrededor de 20 min.
7. Anote los datos en una la tabla.

Nivel de Gas (ml)

Minuto
Glucosa Sacarosa Galactosa Almidón Agua
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20

Experimento II:

1. Marque los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llénelos del siguiente modo:

Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensión de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de agua
2. Mezcle las soluciones y colóquelas en matraces de 25 ml. Agite por 20 minutos.
3. Filtre el contenido del tubo 1 (Experimento I) y de los matraces 1 y 2 (Experimento II) y
usando el método enzimático determine la cantidad de glucosa presente.

Absorbancia [Glucosa]
 Tubo 1
Matraz 1
Matraz 2
Matraz 3

Discuta sus resultados

Cuestionario

1. ¿El tipo de carbohidrato fermentado afecta la tasa formación de gas?

2. ¿Qué tipo de carbohidrato sustentó la tasa más rápida de fermentación? ¿Por qué?

3. ¿Qué molécula es desdoblada en la reacción que produce el CO2?

4. ¿Por qué es ventajoso para un organismo realizar fermentación?

5. Cuando el carbohidrato es fermentado por la levadura, sólo un tercio de los carbonos son
liberados en forma de CO2. El resto del carbono es liberado como moléculas
de.....................

Actividad N°8 Primer exámen de practica

Actividad N°9: Medida de la velocidad inicial.

OBJETIVOS:
a) Evaluación de la actividad de la amilasa salival
b) Definir las condiciones del sistema enzimático y medir la actividad enzimática
(velocidad inicial).

TEORÍA:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparición del substrato o aparición
del producto de la reacción. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo condiciones
cuidadosamente controladas y se sacan alícuotas a intervalos de tiempo para ser analizadas. Debe
considerarse además controles para corregir los errores que se presentan debido a reacciones químicas
espontáneas no específicas ni catalizadas por la enzima.
La amilasa es la enzima responsable de la hidrólisis del almidón, tanto su actividad como la
presencia de sus transcriptos está asociada a este polisacarido. Kuhn, en 1925 demostró la presencia
de dos amilasas: la alfa amilasa Ec 3.2.1.1 y la beta amilasa 3.2.1.2. La alfa amilasa hidroliza los
enlaces alfa 1-4 pero no puede hidrolizar los enlaces alfa 1-6 de las cadenas ramificadas de la
amilopectina, por lo que se requiere de la enzima desramificadora para la hidrólisis completa del
almidón.
El estudio "in vitro" implica, sin embargo, aislar y purificar aunque sea parcialmente la
enzima y posteriormente analizar individualmente las variables que influyen en su actividad. Para
todo este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones
experimentales en que se realizará el ensayo enzimático, tomando en consideración todos los
conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos
particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en
estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubación compatible
con la naturaleza proteica de la enzima, condiciones que deben ser en lo posible lo más semejantes a
las del medio en el cual la enzima actúa "in vivo". Además se debe procurar que las concentraciones
de la solución amortiguadora del pH que se use en el medio de incubación, garanticen la estabilidad
del pH elegido durante el lapso de observación y que la concentración del substrato sea lo
suficientemente alta para mantener la saturación de la enzima, mientras dure el experimento.
Un método para la determinación cuantitativa de la actividad de la amilasa es el amiloclasico
iodometrico. En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra produciéndose
la hidrólisis enzimática. Este se detiene al agregar el reactivo de yodo. La disminución de color
respecto a un sustrato sin muestra permitirá medir la actividad enzimática.
La técnica mide el almidón que queda sin hidrolizar = Ash
La diferencia Blanco-Almidón sin hidrólisis (Ash) = Almidón hidrolisado (Ah) = Producto

La Unidad Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que

puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos,

MATERIALES y REACTIVOS:
1. Solución de Sustrato almidón 500 3. Enzima amilasa
mg/L, en buffer fosfato 0.1 M y NaCl 4. Tubos de prueba y pipetas
0.15 M (pH 7) 5. Centrífuga clínica
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo 6. Espectrofotómetro o fotocolorímetro
en HCl 0.02M 7. Baño de maría a 37°C.

PROCEDIMIENTO:
 Reactivos 1 2

Agua Destilada (mL) 0.01 ---

Substrato (mL) 0.5 0.5
Incubar a 37 °C por 5 min
Enzima (mL) --- 0.01

 Inmediatamente mezcle e incube a 37 °C por 7.5 min

 Agregar 4,5 de solución reveladora
 Leer al espectro a 640nm
En esta técnica se incuban 10 µl de muestra con 0.25 mg de almidón contenidos en 0.5 ml de
solución de sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra
con 10 000 mg de almidón durante 30 minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad
amilásica de la muestra sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la
fracción de almidón digerido se multiplica por 1000.
Absorbancia (Tubo1)  Absorbancia (Tubo 2)
AmilasaUA / dl  1000
Absorbancia (Tubo1)

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la actividad de la muestra analizada?
2. La actividad de la amilasa es directamente proporcional al volumen empleado? Si no es
así que cantidad describe mejor la cantidad de enzima presente?
3. En relación al almidón defina los términos gelatinización, licuefacción, sacarificación
4. En que se diferencian las enzimas amilasas y que orígenes tienen?
5. Qué reacción catalizan las amiloglucosidasas y cuál es su origen?

Actividad N°10: Cinética enzimática.

OBJETIVO:
a) Conocer como la concentración de substrato puede modificar la velocidad de reacción
y calcular la constante de Michaelis de una enzima.
TEORÍA.-
Si se analiza la influencia de la concentración del substrato, manteniendo la
concentración de la enzima constante, y se dibuja una gráfica con los resultados, se obtiene
una hipérbola rectangular. Esta curva está expresada matemáticamente por la ecuación de
Michaelis:
Vmax Vmax S
v = -------------- ó v = -------------
1 + Km. / S S + Km.
donde v es la velocidad de la reacción, Vmax es la velocidad máxima, S es la concentración
molar de substrato y Km. es una constante equivalente a la concentración de substrato con la
que se obtiene la mitad de velocidad máxima. Suele usarse la expresión de Lineweaver-Burk,
que es la reciproca de la ecuación de Michaelis y da una línea recta.

1 Km. 1 1
--- = ------- . ---- + ----
 v Vmax S V

MATERIALES y REACTIVOS:
1. Solución de Sustrato almidón 500 3. Enzima amilasa
mg/L, en buffer fosfato 0.1 M y NaCl 4. Tubos de prueba y pipetas
0.15 M (pH 7) 5. Centrífuga clínica
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo 6. Espectrofotómetro o fotocolorímetro
en HCl 0.02M 7. Baño de maría a 37 °C

PROCEDIMIENTO
Se montará el siguiente set de trabajo:

1(Reacción 2(Reacción 3(Reacción 4(Reacción 5(Reacción

Reactivos
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od (mL) 0.4 0.3 0.2 0.1 ---
Substrato (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Enzima (mL) 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Para cada tubo de reacción deberá hacerse un tubo blanco enzimático (sin enzima)
El blanco para el espectrofotómetro se realizará mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL
de solución de lugol.
 Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
 Agregar 4,5 mL de solución reveladora
Leer al espectro a 640nm

Actividad N°11: factores que afectan la velocidad

enzimática.
Experimento I.- Concentración de la Enzima
OBJETIVO:
a) Conocer como la concentración de la enzima puede modificar la velocidad de
reacción.

PROCEDIMIENTO
Se montará el siguiente set de trabajo

1(Reacción 2(Reacción 3(Reacción 4(Reacción 5(Reacción

Reactivos
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od (mL) 0.4 0.3 0.2 0.1 ---
Substrato (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Enzima (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Deberá hacerse un tubo blanco enzimático (sin enzima)

El blanco para el espectrofotómetro se realizará mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL
de solución de lugol.
 Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
 Agregar 4,5 mL de solución reveladora
 Leer al espectro a 640nm

CUESTIONARIO
1. …
2.

Experimento II.- Efecto del pH

OBJETIVOS:
a) Conocer como la variación de pH puede modificar la velocidad de reacción.

TEORÍA.-
El efecto de pH en la cinética enzimática es debido a cambios en el estado de
ionización de los componentes del sistema enzimático (enzima libre, complejo enzima -
substrato, substrato). Es posible que la enzima reaccione con una sólo especie iónica de un
substrato ionizable o tenga diferente afinidad con las diferentes especies iónicas del substrato.
Por su carácter de proteína posee numerosos grupos ionizables. Si se varia la
ionización de estos grupos en el nivel del sitio activo o en algún punto lejano, para que de
alguna manera altere el sitio activo, se afecta el tipo de unión y la estabilidad del complejo
enzima - substrato o la actividad catalítica misma.
Los efectos del pH sobre la actividad enzimática implican modificación del Km o de
la velocidad máxima de la reacción o de ambos.

PROCEDIMIENTO
Se montará el siguiente set de trabajo:

1(Reacción 2(Reacción 3(Reacción 4(Reacción 5(Reacción

Reactivos
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
Substrato (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Enzima (mL) 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Deberá hacerse un tubo blanco enzimático (sin enzima)

El blanco para el espectrofotómetro se realizará mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL de
solución de lugol.
 Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
 Agregar 4,5 mL de solución reveladora
Leer al espectro a 640nm

CUESTIONARIO
3. …
4.

Experimento III.- Efecto de la Temperatura

OBJETIVO:
a) Conocer como la variación de temperatura puede modificar la velocidad de reacción.
PROCEDIMIENTO
Se montará el siguiente set de trabajo

1(Reacción 2(Reacción 3(Reacción 4(Reacción

Reactivos
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
Substrato (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5
Enzima (mL) 0.01 0.01 0.01 0.01
TEMPERATURA Sobre hielo Ambiente 37 C 60 C

Deberá hacerse un tubo blanco enzimático (sin enzima)

El blanco para el espectrofotometro se realizará mezclando 0.5mL de agua con
4.5mL de solución de lugol.
 Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
 Agregar 4,5 mL de solución reveladora
Leer al espectro a 640nm

CUESTIONARIO
1. Realice sus anotaciones y haga sus respectivos cálculos.
2. Para cada experimento ejecute su respectiva gráfica.
3. Comente sus resultados.
4. Grafique las absorbancias vs. las concentraciones de almidon digerido.
5. Grafique la velocidad (concentración de producto) vs. tiempo.

BIBLIOGRAFÍA
1. Gutierrez R., Ana y Santa Cruz C., C. (1998) Guía de Prácticas Bioquímica.
Universidad Nacional Federico Villarreal.
2. WIENER LAB. 1995. Vademécum. Edición Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.

Actividad N°12: Efecto de inhibidores enzimáticos.

Evaluar el efecto de los inhibidores de la amilasa

Actividad N°13: Oxido reducción por la succínico DH

Objetivos:

a) Usar el azul de metileno como indicador del proceso de oxidación, es decir como
aceptor final de hidrógenos.
b) Determinar la actividad Enzimática de la Succínico Deshidrogenasa, en un extracto de
 hígado, riñón o corazón.
c) Estudiar algunos factores que afectan el transporte de electrones, siguiendo esta vía.

Teoría.-

La Succínico Deshidrogenasa cataliza la oxidación del ácido Succínico a ácido Fumárico.

HOOC - CH2 - CH2 - COOH <===> HOOC - CH = CH - COOH + 2H+

La Succínico Deshidrogenasa es una flavoproteína que no requiere coenzima
nicotinamida y que se encuentra en las mitocondrias. Además de formar parte del ciclo de
Krebs es capaz de reducir directamente a la coenzima Q de la cadena respiratoria. Es
altamente específica para el ácido succínico y es inhibida competitivamente por numerosos
ácidos dicarboxílicos, en especial, málico y oxaloacético. Es una típica "enzima -SH";
inhibida no competitivamente por arsenicales trivalentes, monoyodoacetato, metales pesados
y aún por el oxígeno. Estos inhibidores oxidan los grupos sulfihidrilos o forman compuestos
covalentes con ellos (Asmercapturos, derivados S-alquilos, sales de metales pesados).

Fundamento.- El azul de metileno es un pigmento de color azul que se decolora al

reducirse. El NADH2 puede reducirlo debido a la presencia en el extracto de tejido de una
diaforasa, que es una flavoproteína capaz de catalizar esa reacción y corresponde al Lipoato
Deshidrogenasa; el potencial redox del azul de metileno es + 0.011 voltios.

La reacción deben hacerse en anaerobiosis, pues el azul de metileno reducido es

autooxidable, es decir, puede ser oxidado espontáneamente por medio del oxígeno molecular.
Para conseguir la anaerobiosis se utilizan los tubos de Thumberg, en los cuales se puede
hacer fácilmente el vacío y reemplazar el aire por un gas inerte (nitrógeno). Una anaerobiosis
relativa se puede conseguir mediante una capa de vaselina líquida, que aísla el medio de
incubación del aire.

Materiales y Reactivos:

1. Fosfato de sodio 0.15 M a pH 7.0

2. Succinato de sodio 0.10 M
3. Malonato de sodio 0.10 M
4. Azul de metileno 0.02 %
5. Cianuro de potasio 0.08 M
6. Cloruro de mercurio 0.10 M
7. Vaselina líquida
8. Arena
9. Tubos y pipetas

Procedimiento:

1. Preparación de la enzima

a. Se usarán hígados, riñones o corazones de ratas, órganos que se guardarán

congelados. Cortar los órganos en pequeños trozos y colocarlos en un mortero.
b. Agregar aproximadamente un gramo de arena y 5 mL de fosfato de sodio pH 7,0.
c. Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros 5 mL. de fosfato. Dejar esta mezcla
a la temperatura ambiente por unos 15 minutos, revolviendo de vez en cuando para
destruir substratos endógenos.
 d. Vaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a baja velocidad durante
unos 5 minutos para sedimentar la arena, núcleos y células enteras que haya quedado
sin destruir. Conservar en hielo el sobrenadante.

2. Ensayo de la Succínico Deshidrogenasa.- Determinar la actividad de la Succínico

Deshidrogenasa, usando los controles adecuados para un sistema completo: Succinato de
sodio 0.020 M; azul de metileno 0.004%; 1.0 mL de preparación enzimática para un
volumen final de la mezcla de 5.0 mL. Es recomendable colocar los componentes en el
orden indicado. Inmediatamente después de colocar el sistema, mezclar y agregar
aproximadamente 2.0 mL de vaselina líquida al tubo, no usar pipeta.

La actividad enzimática se reconocer por la decoloración del azul de metileno. Cada grupo
de trabajo diseñará sus propios experimentos, que permitan responderlas preguntas que se
han formulado con respecto a los blancos necesarios y a los factores que puedan influir en
la reacción.

Cuestionario

1. Escriba la ecuación del azul de metileno

2. Use la magnitud de decoloración del azul de metileno como índice de la actividad
enzimática. Evalúe semi - cuantitativamente el efecto de los diversos factores estudiados.
3. ¿Qué significado energético para la fosforilación oxidativa tiene el hecho de que la
Deshidrogenasa Succínico no requiere NAD?
4. ¿Qué diferencias existen entre actividad succínico deshidrogenasa y succínico oxidasa?
5. ¿Cuál es el fundamento del método manométrico de Warburg? ¿Cómo se podría medir la
respiración de un tejido mediante el método de Warburg?
6. Mencione tres enzimas flavínicas, indicando las reacciones que catalizan.
7. ¿Cuál es la característica espectrofotométrica que permite distinguir al NAD reducido del
oxidado?
8. ¿Qué efecto tiene el KCN sobre la succínico deshidrogenasa? ¿Cómo lo demostraría?

Práctica N°14: Fotosíntesis

OBJETIVO:
a) Observar y Evaluar la Tasa Fotosintética.
TEORÍA
La fotosíntesis es el proceso biológico mediante el cual las plantas y los
microorganismos fotosintetizadores obtienen biomasa. Básicamente está constituida por una
fase de transducción de energía y otra fase de síntesis. La ecuación general de la fotosíntesis
es: 6CO2 + 6H2O → C6H12O6 +6O2 .
La tasa de fotosíntesis se puede obtener midiendo la cantidad de oxígeno producido
por unidades de tiempo. La tasa fotosintética por lo tanto se puede entender como la
velocidad de producción de oxígeno dada por la siguiente ecuación:
 VO2= (Vol O2)/t
donde VO2 es la velocidad o tasa de fotosíntesis, Vol O2 es el volumen de oxigeno
producido y t es el tiempo.
Debido a que las burbujas de O2 son de tamaño y formas regulares y además es
proporcional al Vol O2, se puede cuantificar la VO2 por medio de la ecuación,
VO2= (N° burbujas O2)/t.
La tasa de fotosíntesis es dependiente de la intensidad de luz, de la temperatura, de la
concentración de CO2 y de la composición química del agua en el caso de una planta
acuática.

MATERIAL y REACTIVOS
1. Elodea sp. u otra planta acuática. 5. 2 frascos de boca ancha
2. Agua destilada 6. 2 embudos de vidrio
3. Fuente de luz. 7. 2 tubos de ensayo
4. Cronómetro 8. 2 soportes con focos de 20 y 75 Watts

PROCEDIMIENTO
1. Preparar frascos con agua destilada.
2. Colocar en estos frascos la elodea o planta acuática bajo el embudo y sumergir
dentro del frasco.
3. Llena el tubo de ensayo con agua e inviértelo sobre el vástago del embudo,
procurando que no se derrame.
4. Repite los pasos descritos en el otro frasco obteniendo 2 montajes similares
5. Ilumina cada frasco con un foco distinto
6. Espera unos 15 minutos y mide con una regla el espacio vacío que queda en el
tubo de ensayo. Hasta aquí obtenemos la cantidad de O2 en volumen.
7. Para obtener en número de burbujas hacer otra preparación con agua destilada.
8. Colocar en estos la planta acuática sumergida cortando previamente una rama.
9. Medir la tasa de fotosíntesis cronometrando el número de burbujas de oxígeno
producidas por cada 10 segundos durante 100 y 120 segundos.
10. Observa durante una hora lo que pasa en ambos frascos
11. Anota la cantidad de burbujas que se desprenden cada minuto y mide nuevamente
el espacio vacío en el tubo de ensayo
12. Diseña una tabla de datos que resuma los resultados y colocar en una hoja de
cálculos.

CUESTIONARIO
1. Anote sus resultados y explique.

2. hacer una guía de practica. Como compruebo

en el laboratorio el proceso de la fotosintesis
Bibliografía

Teoría

1. ARMSTRONG F. B. (1989): Biochemistry. Thrid Edition. Oxford University Press.

2. BOHINSKI C. R. (1978): Bioquímica. Fondo educativo Interamericano, S.A.
3. BOHINSKI C. R. (1991): Bioquímica. 5ta. Ed. Addison-Wesly Iberoamericana.
4. LEHNINGER A. L. (1982): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, INC.
U.S.A.
5. LEHNINGER A.L.; NELSON D. Y COX M. (1995): Principios de Bioquímica. 2da.
Ed. Editorial Omega S.A.
 6. MATHEWS C. K. y van Holde K. E. (1990): Biochemistry. The Benjamin/Cumming
Publishing Company, U.S.A.
7. STRYER L. (1976): Bioquímica. Editorial Reverté S.A. Encarnación, 86, Barcelona -
España.
8. VOET D. Y VOET J. (1990): Bioquímica. Ed. Omega S.A.

Prácticas
1. ARIAS M. F., ARROYO B. A., GARCÍA DE GÓMEZ M. E. y VILLALOBOS M.
R. (1985): Curso de Bioquímica. Univ. Nacional Autónoma, México.
2. FALEN B. J. M. (1982): Manual de Práctica de Bioquímica. UNFV. Lima - Perú.
3. FRAIS F. (1972): Practical Biochemistry an Introductory course. Butterworths
London, University Park Press Baltimore.
4. GORNALL A.G., BARDAWILL C. y DAVID M.M. (1949): Determination of serum
proteins by means of the Biuret reaction. J. Biol. Chem. 177: 751 - 766.
5. NELSON N. (1944): A photometric adaptation of de Somogy Method for the
determination of glucosa. J.Biol.Chem. 153: 375 - 380.
6. PLUMMER T. D. (1981): Introducción a la Bioquímica Práctica. Ed. Mc Graw-Hill
Latinoamerica S.A.
7. BRYAN L.W. y WILSON K. (1981): Principios y Técnicas de Bioquímica
Experimental. Ed. Omega, S.A. Barcelona 36, España.