Esterilización Medios Líquidos

Fermentación e Ingeniería Metabólica

Agenda

Etapas en la Esterilización de medios líquidos

Cinética de muerte de microorganismos

Esterilzación batch

Esterilzación continua

2
 Métodos de esterilización
 

Método Condiciones Uso Observaciones

121°C (250F)
Calor Húmedo Medios Líquidos Barato
15 psi

(Vapor) 15 minutos
Sólidos Eficiente

200°C
Elementos de Vidrio Más caro que el calor húmedo y más lento, dado que los m.o
Calor Seco
2 horas
son más resistentes al calor seco.
Sólido

 
0.2 mm Para productos sensibles a la temperatura, tales como enzimas,
Filtración
aire.

  No se utiliza en medios, pues puede permanecer e CCapacidad Oxidativa o alcalina:       

Agentes Químicos CCloración que requiere de etapas posteriores para
inhabilitar el crecimiento de los m.o.
eliminar el cloro.
Ozonificación.

    ·         Vibración
Mecánicos ·         Ultrasonido
  ·         Centrifugación a alta velocidad

   
Degradación del DNA
Radiación:
Utilizada en tratamiento de efluentes con flujos bajos
Ultravioleta
ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS
LÍQUIDOS

Esterilización por calor húmedo

 Cinética de muerte de los microorganismos

La cinética de inactivación de los m.o es una cinética de primer orden

respecta al número de m.o.
Cinética de Inactivación
Se expresa como: 
1

dN/dt = - kd N (1)

Num e ro m .o.
0,8

0,6

  0,4

0,2

Donde: 0
1 3 5 7 9 11 13
N: Número de m.o en el tiempo t Tiem po

kd : Constante de decaimiento o muerte,

es función de la temperatura, concentración de agentes nocivos (cloro,
ozono)
Su dependencia con la Ed
( )
temperatura es del tipo Arrhenius:. kd  ko  e RT

 
 Si se integra la expresión (1) se tiene:
N    t

ln     k d  dt  N  N o  exp(  k d  dt )
 No  o
 

Si se trabaja a temperatura constante se tiene:

N  N o  exp(k d  t )

donde No es el número de m.o iniciales en el sistema.

 Parámetros de las cinéticas de desactivación de diferentes m.o.
 

Microorganismo T Constante Energía de

°C decaimiento activación
Kd sec-1 Ded kcal/mol
Esporas de B.subtilis 121 0.0051 74

B.stearothermophilus 104 0.57 68.7

131 250
C.Botulinum 104 7 82.1

E.coli 127

Esporas en general 121 0.0167

 1 Efecto de la Temperatura T3>T2 > T1

Más resistentes 1
0,8
0,9
0,8
0,6
0,7
.o
erom .

0,4 0,6

Numero m.o.
m

0,5
Nu

0,2 0,4
0,3
0 0,2
1 21 41 61 81 101 121 0,1
0
Tiempo 1 3 5 7 9 11 13
Tiempo
Esporas Bacillus Bacillus Esporas T1 T2 T3

Comparación de Cinéticas de decaimiento a diferentes temperaturas

Comparación de cinéticas de decaimiento de diferentes m.o
 Diseño de procesos de esterilización
Se define el factor “DEL”, , como:
 Total = Ln (No/ Nt)

 Donde No número de microorganismos iniciales

Nt número de microorganismos finales.
 
Considerando la ecuación

 Nt  T

ln     k d  dt
 No  To

Se tiene que

 No  T
 Total  ln    k d  dt
 N t  To
Los criterios de diseño son:

1. Si no se conoce kd, destruir las esporas.

2. Imposibilidad de esterilidad absoluta, se espera que sobreviva a lo más 10

-3
esporas, ie,
-3
1 de 1000 fermentaciones se contamine (Nt = 10 esporas). Puede usarse otro criterio.

3. 3
Si la esterilidad inicial es desconocida, se asume una concentración, [No], del orden de 10 esporas/ml (10
9

3
esporas/m )
 Procesos de esterilización
El proceso de esterilización comprende tres etapas:

a) Etapa de calentamiento
b) Etapa de mantención
c) Etapa de enfriamiento
  kd
TOTAL
Por lo tanto el factor “DEL” puede
dividirse en estas tres etapas:

Total   calentamiento   mantención   enfriamiento

Puede ser llevado a cabo en:

• Forma Batch
• Continua
Esterilización Batch
 Esterilización Batch

 Tiene las típicas etapas de calentamiento y enfriamiento

Perfiles de Variación de temperatura en
Reducción de celulas viables durante
Esterilización Batch
La esterilización batch
 Esterilización Batch
 Las etapas de calentamiento y/o enfriamiento pueden ser: 
Para Calentamiento
• a)  Vapor Directo (Modelo hiperbólico)
• b)  Resistencia Eléctrica (Modelo Lineal)
• c)  Camisa de calefacción con fuente isotérmico (Modelo Exponencial)

Vapor
Camisa de Vapor

Resistencia Eléctrica
 Esterilización Batch

Para Enfriamiento
d) Camisa de enfriamiento alimentada con fuente no-isotérmica y
recirculación.

Camisa de Enfriamiento
 Los factores “DEL”

Calentamiento o enfriamiento
T
 Ed 
 calentamiento/ enfriamiento   k do  exp  dt
To  RT 

donde la temperatura es una función del tiempo, ie. T = f(t) 

Dependen del tipo de calentamiento o enfriamiento utilizado.

Mantención

mantención = kd mantención * Dt
 Perfiles de temperatura
Calentamiento

 a)      Con vapor directo (Modelo hiperbólico)

T = To + (H * ms* t)/ (c* (M+ms*t)

To: temperatura absoluta inicial del medio [K]

c: calor específico del medio [J/Kg K]

H: Entalpía del vapor relativa a la temperatura del medio M

H =HPresión saturación – H Tªmedio [J/Kg]

ms : Flujo másico de vapor [kg/s]

M: Masa inicial de medio a esterilizar [kg]

ms
 Perfiles de temperatura
Calentamiento

b) Con flujo de calor constante, resistencia eléctrica (Modelo Lineal)

 T = To + q* t/(c* M)  

To: temperatura absoluta inicial del medio [K]

q: velocidad de transferencia de calor [J/s]

c: calor específico del medio [J/Kg K]

M: Masa inicial de medio a esterilizar [kg]

 Perfiles de temperatura
Calentamiento

c) Camisa de calefacción con fuente isotérmico (Modelo exponencial)

(-U*A*t/c*M)
  T = TH + ( To – TH)* e

TH: Temperatura absoluta de la fuente de calor [K]

To: temperatura absoluta inicial del medio [K]

c: calor específico del medio [J/Kg K]

M: Masa inicial de medio a esterilizar [kg]

2
U: Coeficiente de transferencia global [J/s m K]

2
A: Area de transferencia [m ]
 Perfiles de temperatura

Enfriamiento

d) Camisa con fuente no isotérmica y recirculación (Modelo exponencial)

(-U*A/c*mc)
  T = Tco + ( To – Tco)* exp [(1- e ) mc *t /M]

TCO: Temperatura absoluta de la fuente enfriadora

To: temperatura absoluta inicial del medio [K]

mc: Flujo másico del refrigerante [kg/s]

c: calor específico del medio [J/Kg K]

M: Masa inicial de medio a esterilizar [kg]

2
U: Coeficiente de transferencia global [J/s m K]

2
A: Area de transferencia [m ]
Perfiles Temperatura v/s Tiempo para diferentes tipos de calentamiento y enfriamiento
 Algoritmo para el diseño del proceso de esterilización
batch.

El objetivo es determinar el tiempo que debe durar la etapa de

mantención, dado el tiempo de las etapas de calentamiento y
enfriamiento dependen del proceso de transferencia utilizado.

a)      Calcular Total = ln (No/Nt)

b)      Determinar perfiles de T v/s tiempo de duración de las etapas
c)      Graficar kd v/s t, dependiendo del proceso de calentamiento y
enfriamiento.
d) Integrar el área de kd v/s tiempo para las etapas de calentamiento y
enfriamiento. Integración gráfica, algebraica o numérica.

 mantención  total  ( calentamiento   enfriamiento )

t mantención  
k d  mantención k d  mantención
 Ejemplo
Un fermentador contiene 40 m3 (25ºC). Dicho fermentador será
esterilizado por inyección directa de vapor saturado.
El medio contiene 5 *1012 [bacterias/m3] y necesita ser reducido a los
niveles estándar (1* 10-3 bacterias )
El vapor (345 KPa) puede ser inyectado a un flujo de 5000 [kg/hr] y se
detendrá cuando el sistema alcance 122ºC.
Durante la mantención la pérdida de calor será despreciable.
Una vez producida la esterilización se pasarán 100 [m 3/hr] a 20ºC de agua
para enfriar hasta 30ºC. El serpentín tiene un área de 40[m2] y un
coeficiente de transferencia de calor para el enfriamiento de 2500 [kJ/hr
m2 K]
 La resistencia de las esporas se puede caracterizar por : 
kd = 5.7 1039 e ( -2.834 105/ RT) [hr-1]
La capacidad calórica del medio y la densidad son : 4.187kJ/kg K y
1000 kg/m3
La entalpía del vapor saturado a 345K , HPresión saturación = 2731 KJ/Kg
La entalpía a 25ºC, Htemp medio = 105 KJ/Kg
 
Estime el tiempo necesario para realizar una esterilización adecuada.
 Calculo de Total

 5 *1012[m 3 ] * 40[m 3 ] 
total = ln (No/N) =
ln  3   39.8[]
 1*10 
 Perfiles de calentamiento y Enfriamiento

• TCalentamiento = 298+ 78.4* t /(1+.0125*t)

– Si Tfinal = 122ºC = 395K  t = 1.46 [h]
• calentamiento = 14.8 [-]
• TEnfriamiento = 39.8 - 102* e(-0.674*t)
- Si Tfinal = 30ºC = 303 K  t = 3.45 [h]
• enfriamiento = 13.9 [-]
  mantención  total  ( calentamiento   enfriamiento )
t mantención  
k d  mantención k d  mantención

39.8  14.8  13.9

t mantención   0.056[hr ]  3.37[min]
197.6
Esterilización Continua
 Diseño de sistemas de esterilización continua

  Los equipos de esterilización continua pueden ser de dos tipos:

Inyección directa de vapor.

Resultan ser más eficientes dado que no hay barreras entre el medio y el vapor.
Ventajas

Son más baratos que los sistema que incluyen intercambiadores de calor

Desventajas

Dilución del medio por la condensación del vapor

La producción de espuma por la inyección de calor puede producir problemas en el evaporador flash.

Perfil de Variación de temperatura

 Diseño de sistemas de esterilización continua

Intercambiadores de calor.

   Placa

Los que deben trabajar a bajas presiones, pero presentan una mayor área de transferencia de calor

Desventaja

Ensuciamiento en paredes internas

produce disminución de la eficiencia

Tubo y carcaza

Se recomiendan cuando se utilizan líquidos viscosos

 Perfil de Variación de temperatura en esterilización continua

Temperatura
 Ventajas que presenta la forma de operación continua v/s la batch

1. Presentan mayor reproducibilidad

2. Operan en forma más rápida

3. Pueden operar a temperaturas más altas

4. Son fáciles de automatizar

5. Se puede recuperar el calor

Perfil de Variación de temperatura en esterilización batch
Perfil de Variación de temperatura en esterilización continua
 Diseño para sistemas de esterilización continua

Resultan ser análoga a la forma batch salvo que se debe diseñar el “largo de la zona de esterilización, L” en vez del tiempo de

esterilización.

El tiempo de retención de una partícula en el esterilizador, tmantención, se puede determinar considerando el largo del esterilizador, L

y la velocidad promedio a la que se mueven las partículas, ū.

Asi:

 tmantención = L/ ū

L
 El algoritmo de resolución debe considerar que en este tipo de proceso de esterilización los tiempos de calentamiento y enfriamiento

son despreciables (calentamiento continuo = enfriamiento continuo = 0)

por lo cual se cumple que:

(-DEd/RT)
mantención continuo = ln (No/Nt) = kdo e *tmantención  

El tiempo de mantención es:

(-DEd/RT)
tmantención = ln (No/Nt)/( kdo e )

El largo del esterilizador se puede calcular por:

L = tmantención * ū
 Ejemplo

3
Se requiere diseñar el sistema de esterilización para esterilizar un flujo de 2 m /hr. La esterilización del medio

debe realizarse en forma continua durante 5 semanas. Los niveles de esterilidad deben ser tales que la

probabilidad de contaminación sea de 1 en 100.

   Se utilizará un esterilizador continuo tubular de 10 cm de diámetro para calentar el medio a 125°C. Calcule el

largo requerido del esterilizador.

Nota:

La cinética de muerte está dado por la expresión:

39 5 -1
kd = 5.7 10 exp ( -2.834 10 / RT) [hr ]

  La constante ideal de los gases R, es igual a 8.31 [J/K mol]

3
  La densidad y viscosidad del medio son: 1000 [kg/m ] y 3.6 [kg/m h] respectivamente

  El diseño debe considerar el total de m.o que pudieran ingresar al fermentador, durante todo el tiempo de la fermentación.

 
 Efecto de dispersión

Existe una desviación del frente de avance del fluido por efectos de la viscosidad, las turbulencias y la fricción con las paredes

de la tubería. Esto provoca que se genere un frente de velocidades en el interior de la tubería, lo que conlleva a una

esterilización desigual llegando a casos extremos en que haya una parte del fluido que no se esterilice.

um Velocidad máxima

um > ū
Si se considera un modelo dispersión, en la dirección x, para evaluar esta situación se tiene :

d ( D  dNdx ) d(u  N )
-  kd N  O (A)

dx dx

 
Difusión Convección Muerte

Donde D: Coeficiente de difusividad

ū: Velocidad promedio del fluido

Si se adimensionalizan las variables de la ecuación anterior:

N’ = N/No x`= x/L

ū = F/A = Flujo volumétrico / Área Transversal

Si se definen los números adimensionales

Número de Pecler

Pe = ū * L /DZ = Transferencia de masa convectiva

Transferencia de masa difusiva

 donde

L: Largo del esterilizador

Dz: Difusividad en el sistema, se puede utilizar correlaciones o con la siguiente gráfica en función del Número de Reynold

Modificado,

NRe Modificado = dt * ū*r/m

 Correlación para estimar la Difusividad de un sistema, en función del Número de Reynold Modificado

Dz/(dt *ū)

NRe Modificado = dt * ū*r/m

dt: Diametro de la tubería
 

Número de Dahmkoler

Da = kd*L/ ū = Velocidad de reacción (muerte)

Transferencia de Masa

Sustituyendo en la ecuación (A) y resolviendo se llega a:

N ( L) 4    exp( Pe 2)  


No (1   ) 2  exp( Pe 2)  (1   ) 2 exp(0.5  Pe) (B)

Donde 4  Da
  1
Pe
Gráficamente la ecuación (B) queda de la forma:

N ( L)
No

Pe = ū * L /DZ

Figura B
 Algoritmo para determinar el largo, L, de un sistema de esterilización continuo

1.- Calcular el Número de Reynold Modificado (N Re Modificado)

NRe Modificado = dt * ū*r/m

donde dt: Diámetro de la tubería

r, m y ū : Densidad, viscosidad y velocidad media del fluido

2.- Es base al Número de Reynold Modificado determinar la difusividad (Dz) en el sistema (usar correlaciones o Figura A)

3.-Asumir un largo, L, de esterilización y calcular el Número de Pecler y Número de Dahmkoler

4.- En base a la figura B determinar N/No. Grafica de la ecuación (B)

5.- Si cumple con el nivel deseado OK, sino volver al paso 3.

 Ejemplo

3
Se desea esterilizar un medio de cultivo con un caudal de 2 m /hr mediante intercambio de calor con vapor en un
12 3
esterilizador continuo. El líquido contiene esporas bacterianas con una concentración de 5*10 [bact/m ]. La

energía de activación y constante de Arrhenius para la destrucción térmica de estos contaminantes son 283
39 -1
[kJ/mol] y 5.7*10 [hr ], respectivamente. Se considera aceptable un riesgo de contaminación de un organismo

sobreviva en cada 60 días de operación. La tubería del esterilizador tiene un diámetro de 0.1 m y la longitud de la
3
sección isoterma es de 24 metros. La densidad y viscosidad del medio son: 1000 [kg/m ] y 3.6 [kg/m h]

respectivamente.

¿ Qué temperatura se necesita en el esterilizador?

 Nota: Considere los efectos de dispersión axial.

Resumiendo

Esterilización de medios líquidos: Hay tres etapas: Calentamiento, mantención y enfriamiento.

Cinética de muerte de microorganismos

Esterilización batch, donde es fundamental la etapa de calentamiento

Esterilzación continua, donde es fundamental la etapa de mantención y donde se debe tener en consideración la dispersión

del fluido.

46
 EJEMPLO-CINETICA DE MUERTE
Determinar el valor del tiempo de reducción decimal a 116 º C
(D116) de un microorganismo a partir de los siguientes datos de
supervivencia al tratamiento

Duración del Número de

tratamiento viables
x
5 340.0 D116 
log( N 0 / N X )
10 65.0
20 min
15 19.0 D116 
20 4.5
log(340 / 1.3)
25 1.3
D116  8,27 min
 El valor-Z es
el cambio de
temperatura
que se
requiere para
modificar el
valor D por un
factor de 10.
DONDE:

(t 2  t1 )  Incremento de la temperatura

Dt1 , Dt 2  Valores respectivos de D

EJEMPLO:

Para un microorganismo determinado el valor

D104.4 es 113.0 min. y D121.1 es 2.3 min.
Calcular el valor z.
temp
z
log( Dt1 / Dt 2 )
(121.1  104.4)
z
log(113 .0 / 2.3)
z  9.9º C
Para medios de fermentación:

Probabilidad aceptable de fallo en la

esterilización puede ser de 0,001 (1
fallo de cada 1.000 preparaciones).
Ejemplo: va a realizarse la
esterilización de 100 litros de líquido de
maceración de maíz, el nivel de
contaminación es de 103 esporas
viables/ ml, la contaminación biológica
total será de 1017 esporas. Si la
temperatura de procesamiento es de
121 °C y el valor D de las esporas del
Bacillus contaminante a esta
temperatura es de 3 min entonces
No= 1017 esporas viables/ ml
Nf= 103 esporas viables/ ml
T= 121ºC
D= 3 min
FS  D(log N 0  log N )

Fs=3min(log1017 -log103 )
Fs=3 X14
Fs=42 minutos
El tiempo de procesamiento requerido para tener
una probabilidad de fallo de 0,001 es de un total
de 14 x D = 42 minutos.
 Si por alguna razón, por ejemplo,
presencia de sustancias termolábiles,
no es posible utilizar esta
combinación de tiempo/temperatura,
será posible encontrar un nuevo
tiempo de procesamiento a partir de
la ecuación anterior:
(121-T )/z
t = 42 x 10
Si la nueva temperatura es 131°C,
ENTONCES
F = 1,0
z = 10
t = 42 x10-1 =4,2 min nuevo tiempo de
procesamiento
En otras palabras si se eleva la temperatura de
esterilización en 10°C, el tiempo de
calentamiento debería disminuirse en 10 veces.
EJEMPLO:
Si el organismo contaminante más resistente es mucho
menos resistente que el organismo resistente modelo, con
un valor D de 1,2 min a 121 °C, entonces para llevar a
cabo la letalidad equivalente a 121 °C.

Fs = 1,2 (log 1017 - log 103) = 16,8 minutos