Cromatografía de

Líquidos
Elba Rojas Escudero

ERE
¿¿¿ Ab o Ad ???
 Temario
• Fundamentos
– Definiciones básicas
– Aspectos teóricos
• Instrumentación
– Elementos básicos
– Columnas
– Inyectores
– Detectores y sistemas acoplados
• Análisis
– cualitativo y cuantitativo
Cromatografía de líquidos

• Método físico de separación

• La muestra se distribuye entre dos fases

– Fase estacionaria: sólido o líquido

– Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos

 Elución
• La muestra se aplica al principio de la
columna como una banda fina
• El eluyente tiene menor afinidad por la fase
estacionaria que los solutos
• Los solutos avanzan por el sistema a
velocidades diferentes, menores a la de la
fase móvil
• Los solutos se separan en bandas que eluyen
al final de la columna
 Cromatografía

Gas Líquido

Columna Plano

CLS CLL CFE CII CE CCF CP

CPG CFG
 Tipos de CL
• PM  2000
• Cromatografía de intercambio iónico
• Adsorción: líquido-sólido
• Partición: líquido-líquido
– Cromatografia en fase normal
– Cromatografia en fase inversa
• PM  2000
• Cromatografia de exclusión por tamaño
 Requisitos de la muestra

• Soluble en la fase móvil

• “Limpia”

• No debe reaccionar con ningún componente

del sistema cromatográfico
HPLC ideal para muestras con:

• Presión de vapor baja

• Compuestos iónicos

• Compuestos de peso molecular elevado

• Compuestos Termolábiles
 Instrumentación

Bomba de Gradiente
Fase móvil
alta presión de elución

Muestra Inyector

Columna
Control de
temperatura
Detector Registrador
 Fase móvil

• Disolventes grado cromatográfico

• Agua de 18 m
• Baja viscosidad
• No vólatil
• Miscibilidad
• Filtrada
• Sin oxígeno disuelto (degasificada)
 Fase móvil

• Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por

unidad de tiempo . Se determina a la salida de
la columna a temperatura ambiente (mL/min)
H = f (v)
 Cromatografía

FM
FE

Inyector Detector
 Proceso Cromatográfico
• La fase móvil fluye, arrastrando consigo los
solutos
• Los solutos se reparten entre ambas fases

Fase estacionaria Fase móvil

Muestra
Cromatografía de líquidos
• Se realiza en columna
• Separación por adsorción y partición
• Diversidad de técnicas en función de
la muestra
• Análisis cualitativo y cuantitativo
• Separaciones analíticas y preparativas
• Análisis de mezclas “relativamente”
complejas
 Fase estacionaria
(columna)
• Tubo de acero inoxidable

• Dimensiones
–Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm
–Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm
– Tamaño de partícula: 3, 5, 10 m
– Forma de la partícula: irregular o esférica
Dimensiones de la
columna

di

dp
 Fase estacionaria
(columna)

• Empaque
–Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino,
Resinas, Polímeros
• Carga de Carbón 5-20 % w/w
• Intervalo de pH = f (FE)
• Límite de presión de trabajo
• Compatible con la fase móvil
Fase estacionaria
Soportes de la FE
Permeación o exclusión
Cuidados de la columna

• Instalación
• Introducción de muestras “limpias”
• Contaminación por fase móvil o muestra
• Almacenarla y guardarla de forma
adecuada
• Lavarla después de utilizarla con
disoluciones reguladoras de pH
 Precauciones
• No exceder la presión de trabajo
• Cambios bruscos de presión
• Intervalo de pH adecuado
• No utilizar H+ y OH- concentrados
• Filtrar la muestra y la fase móvil
• w de la muestra=f (dimensiones de la
columna)
Cromatografía

• Fase Normal
– FE polar
– FM No-polar
• Fase Inversa
– FE No-polar
– FM polar
 Cromatografía
de fase inversa
• FE
– Sílica químicamente modificada con
grupos no-polares: hidrocarburos
saturados: C18 octadecil, C8 octil,
C4 tetrametil, C2 dimetl
• FM
– Mezclas: agua/disolventes orgánicos
H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
 Cromatografía
de fase inversa

• Efecto solvofóbico fuerte:

– Parte apolar de la molécula del soluto es mayor
– % C en la FE es mayor
– Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
 Fases estacionarias
• Fases impregnadas
– Cubren uniformemente el soporte
– Insolubles en la FM
– Compatibles con el detector
– El flujo de la FM no debe ser elevado

NO son Estables
 Fases estacionarias
• Fases químicamente unidas (“Bonded
phases”)
– Unidas al soporte por enlaces covalentes
– Mayor eficiencia que las Fases impregnadas
– Costo elevado
– Son estables
 Cromatografía
de fase inversa
• Ventajas
– Reproducibilidad en las separaciones
– Estabilidad de la FE (pH  7)
– Mezclas: acuosos/orgánicos H2O
+(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)
Fuerza del eluyente
Viscosidad del eluyente
Polaridad
Polaridad
 Detectores

• Indice de refracción
• Ultravioleta-Visible
• Fluorescencia
• Electroquímico
• Radioactividad
• Infrarrojo
• Espectrómetro de masas
 Instrumentación

Bomba de Gradiente
Fase móvil
alta presión de elución

Muestra Inyector

Columna
Control de
temperatura
Detector Registrador
Elución
Problema general de
la elución
Gradiente de elución
Gradiente de elución
Elución con alta presión
Elución
Equipo con gradiente de
elución
Proceso Cromatográfico

• El lecho cromatográfico puede ser abierto

(placa) o cerrado (columna)
• La fase móvil fluye a lo largo del lecho
cromatográfico en contacto con la fase
estacionaria
Proceso Cromatográfico

• Las móleculas de soluto en fase estacionaria

se estancan
• Las móleculas en fase móvil avanzan con
ella

Mm m m M
m m M
 Proceso Cromatográfico

• La velocidad del soluto varía inversamente con

la afinidad por la fase estacionaria
 Separación de los solutos

• Los componentes con constantes de reparto

diferentes, se separarán

Mm
m M M
M M
m m M M
Separación de los solutos
H = f (v)
Ensanchamiento de
banda
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FE
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FM
“movimiento”
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FM
“estancada”
H= f (ensanchamiento de
la banda)
k´ 2 vt
HL = 2 DM / v HS = 2 a
1+k´

HF = 2dp HD = vdp2 / DM

HM = HF + HD

(1-  + k´)2 dp2v

HSM =
30(1-)(1+k´)2DM
H = f (ensanchamiento de
la banda)

H = L/N

H = HL + HS + HM + HSM

H = HS + HM + HSM
 Ventajas

• Análisis de compuestos iónicos, de alto

peso molecular
• Diversidad de columnas y detectores
• Formación de derivados pre-columna y
post-columna
• Separaciones con control de pH
• Separaciones preparativas
 Limitantes
• Muestras “relativamente” limpias
• Solubilidad de la muestra en la fase móvil
• Viscosidad de la fase móvil
• Dimensiones de la columna
• Presión de trabajo
• Intervalo de pH
• Utilizar un filtro (pre-columna)
Cromatografía de Líquidos

Formación de derivados

ERE
 Derivados

• Fuera de línea
• En línea
• Pre-columna
• Post-columna
Equipo para la formación
de derivados

FM
FE

Inyector Reactor Detector

FM
FE

Inyector Reactor Detector

Derivados
Derivados
Cromatografía de Líquidos

Aplicaciones

ERE
CCF - CLAE
FE = f (diámetro interno)
Diferente 
Cambio de 
Aplicación
Aminas
Aplicación
Fluorescencia
Polar - No polar
¿¿¿ Qué sucedió ???
Sensibilidad
Sensibilidad
Peso molecular
Propiedades = f (PM)
Oligosacáridos
Oligoglucosa
 Ejemplos
Campo Mezclas típicas
Fármacos Antibióticos, sedantes,
esteroides, analgésicos
Bioquímica Aminácidos, proteínas,
carbohidratos, lípidos
Alimentos Edulcorantes, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,
fenoles
Química Drogas, venenos, alcohol en
forense sangre, narcóticos