UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

PRÁCTICA 5: AISLAMIENTO DE No. DE EQUIPO: 03

BACTERIOFAGOS A PARTIR DE INTEGRANTES:
AGUAS RESIDUALES ● Cornejo Roblez Arantza Guadalupe
● Mejia Valdes Raúl Alejandro
● Secundino Hernández Jazmin Naomi

OBJETIVO
● Identificar la diferencia entre virus y bacteriofago.
● Conocer las principales bacterias susceptibles a bacteriofagos.
● Identificar la importancia del ciclo vital de los bacteriofagos liticos y temperados
relacionados a su aplicación para el avance de ciencias biomédicas.
● Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo para bacteriofagos.
● Identificar técnicas de conteo y aislamiento para clonas de bacteriofagos.

DEFINICIONES

Aguas residuales:​cualquier tipo de agua cuya calidad se vio afectada negativamente por
influencia antropogénica. Las aguas residuales incluyen las aguas usadas, domésticas,
urbanas y los residuos líquidos industriales o mineros eliminados, o las aguas que se
mezclaron con las anteriores
Bacteriofago: ​virus que infectan exclusivamente a los organismos procariotas por
ejemplo a las bacterias principalmente.
Lisis celular: ​proceso de ruptura de la membrana celular de células o bacterias que
produce la salida del material celular, provocado por lisinas o factores liticos externos
como son los virus.

1. FUNDAMENTO

1.1. BACTERIOFAGO
Edward Twort en 1915y Félix d´Herelle en 1917 informaron independientemente el
aislamiento de entidades ultrafiltrables capaces de destruir cultivos de bacterias o producir
pequeñas áreas de color más claro cuando las bacterias crecían a confluencia en placas
de medio sólido. Fue el canadiense Félix d´Herelle, en el instituto Pasteur de París, quien
dio el nombre de “Bacteriófagos” a estas entidades y utilizó el sufijo.

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan y lisan bacterias de especie específica,
requieren un organismo huésped para su reproducción y permanecen en un estado
suspendido cuando no encuentran un huésped al que infectar, a la deriva en el medio que
lo rodea hasta un nuevo encuentro o su degradación por factores externos. Los fagos
como todos los virus son parásitos obligados intracelulares, es decir necesitan estar
dentro de una bacteria para poder replicarse y en este sentido, los fagos han desarrollado
dos ciclos replicativos.

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ESTRUCTURA
Consisten fundamentalmente de material genético y proteínas. Su genoma puede
componerse de DNA o de RNA el cual puede ser de cadena doble o de una sola cadena.
El material genético está protegido por una cubierta de proteínas denominada cápside. La
estructura de los fagos, está determinada por sus proteínas de envoltura (o proteínas
estructurales) cuya función principal es la protección al material genético fágico, estas
proteínas pueden además proveer al fago de: cuello, cola, fibras caudales, láminas
basales y/o espículas. La forma en la que se arreglan las proteínas alrededor del material
genético del virus, define la complejidad estructural y la forma del mismo, de tal modo que
existen fagos icosaédricos, helicoidales o filamentosos

Estructura de los bacteriofagos

CARACTERÍSTICAS
● Su Tamaño es de alrededor de 100 nm, aproximadamente 10 veces inferior al de
una bacteria
● no pueden ser observados mediante microscopios ópticos convencionales
● Se consideran la forma de vida más abundante en la Naturaleza
● se consideran parásitos obligados
● se reproducen utilizando la maquinaria reproductora de una célula hospedadora
● poseen información genética propia
● se estima que 1 mL de agua marina contiene una media de 1X1077 fagos
● Los bacteriófagos pueden presentar dos estados funcionales: el “estado lítico” o

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“lisogénico”. La presentación de estos dos estados funcionales depende de la

actividad de dos genes: del represor, cl, que inhibe la actividad lítica, y del
regulador, cro, que bloquea la función del gen represor.

MECANISMOS DE INFECCIÓN
Los bacteriófagos, como otros virus, deben infectar a una célula anfitriona u hospedera
para reproducirse. Los pasos que componen el proceso de la infección se llaman
colectivamente el ciclo de vida del fago.

Algunos fagos solo pueden reproducirse por medio de un ciclo de vida lítico, en el cual
hacen estallar y matan a sus células anfitrionas. Otros fagos pueden alternar entre un
ciclo de vida lítico y un ciclo de vida lisogénico, donde no matan a la célula anfitriona, sino
que se copian junto con el ADN del hospedero cada vez que se divide la célula.

Ciclo lítico

En el ciclo lítico, un fago actúa como un virus típico: secuestra a su célula anfitriona y
utiliza los recursos de la célula para hacer muchos fagos nuevos, lo que causa que la
célula lise (estalle) y muera en el proceso.Lo llevan a cabo los fagos virulentos, en donde
se da un reconocimiento de los receptores de la bacteria por los contra receptores del
fago, una adsorción del fago a la célula huésped, seguido de la penetración del ácido
nucleíco fágico a la bacteria, el desarrollo intracelular de los componentes fágicos y la
liberación de progenie viral.

Las etapas del ciclo lítico son:

1. Fijación: las proteínas en la cola del fago se unen a un receptor específico (en este
caso, un transportador de azúcar) en la superficie de la célula bacteriana.
2. Penetración: el fago inyecta su genoma de ADN bicatenario dentro del citoplasma
de la bacteria.Copia del ADN y síntesis de proteínas: se copia el ADN del fago y
los genes del fago se expresan para hacer proteínas, como las proteínas de la
cápside.
3. Ensamblaje del nuevo fago: las cápsides se ensamblan a partir de las proteínas de
la cápside y se rellenan con ADN para hacer nuevas partículas de fago.
4. Lisis: en las últimas etapas del ciclo lítico, el fago expresa los genes para las
proteínas que hacen agujeros en la membrana plasmática y la pared celular. Los
agujeros dejan que entre agua, y hacen que la célula se expanda y estalle como
un globo con demasiada agua.

La célula que estalla, o se lisa, libera fagos nuevos, que pueden encontrar e infectar a
otras células anfitrionas próximas. De esta manera, unos pocos ciclos de infección lítica
pueden dejar que el fago se propague como fuego a través de una población bacteriana.

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Ciclo lisogénico

Este ciclo permite a un fago reproducirse, pero sin matar las células de su huésped. Las
fases de fijación e inyección del ADN son iguales que en el ciclo lítico. Pero se diferencian
en que no se va a copiar ni expresar el ADN, su ADN se va a incorporar al genoma de la
bacteria (pasa a denominarse profago) y se va a replicar junto con el genoma de la
bacteria sin que se produzca la síntesis de los componentes virales ni la liberación de la
progenie viral. En el ciclo lisogénico, los primeros dos pasos (fijación e inyección del ADN)
ocurren tal como sucede en el ciclo lítico. Sin embargo, una vez que el ADN del fago está
dentro de la célula, no se copia ni se expresa inmediatamente para hacer las proteínas.
En cambio, se recombina con una región particular del cromosoma bacteriano. Esto hace
que el ADN del fago se integra al cromosoma.

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El tiempo que tarda la replicación viral es variable, algunos de ellos pueden replicarse en
cuestión de minutos (alrededor de 30). En cuanto a la cantidad de virus liberado por
bacteria infectada, (tamaño de estallamiento) varía dependiendo de cada caso.

TIPOS DE FAGOS QUE INFECTAN BACTERIAS

FAGO BACTERIA CABEZA COLA ACIDO NUCLICO ESTRUCTURA TIPO

HUÉSPED

T1 E.coli hexagonal simple DNA+/- lineal virulento

T2,T4,T6 E.coli icosaedrico compleja DNA+/- lineal y bases virulento

n modificadas

T3,T7 E.coli hexagonal corta DNA+/- lineal virulento

T5 E.coli hexagonal simple DNA+/- lineal y una virulento

cadena
segmentada

Lambda , E.coli hexagonal simple DNA+/- lineal y extremos atemperado

fi-80,P2, Mu cohesivos

N4 E.coli hexagonal corta DNA+/- lineal virulento

S13 E.coli icosaedrico no DNA+/- circular virulento

M12,G4 E.coli icosaedrico no DNA+/- circular virulento

M13 E. coli Filamentoso no DNA+/- circular virulento

Ms2, f2 E.coli icosaedrico no ARN + lineal virulento

F1,Fd E.coli no filamentoso +/- - virulento

P22 Salmonella hexagonal compleja +/- lineal virulento

P1 Salmonella icosaedrica compleja +/- - atemperado

PM2 Pseudomona hexagonal no +/- circular virulento

con
envoltura

fi-6 pseudomona poliedrico no +/- - virulento

con evoltura

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FAGOS QUE INFECTAN A ESPECIES ESPECÍFICAS DE BACTERIAS

FAGO BACTERIA HOSPEDADORA

B30, NTC11261 Streptococcus agalactiae

11 Sthaphylococcus aureus

T7 Sthaphylococcus warneri

CULTIVOS BACTERIÓFAGOS:
Los bacteriófagos se pueden cultivar en suspensiones de bacterias en medios líquidos o
en cultivo bacteriano de medios sólidos. El uso de los medios sólidos posibilita el método
de las placas para detectar y contar los virus. Una muestra de bacteriófagos se mezcla
con las bacterias del huésped y agar fundido; posteriormente el agar con los bacteriófagos
y bacteria huésped se vuelca en una placa de petri que tiene una capa solidificada en una
delgada capa superior que contiene una capa capa solidificada de medio de cultivo de
agar. La mezcla de virus y bacterias se solidifica en una delgada capa superior de una
célula de espesor, cada virus infecta una bacteria, se multiplica y libera varios centenares
de virus nuevos. Estos virus recién producidos infectan otras bacterias en la vecindad
inmediata, y se producen más virus nuevos. Después de varios ciclos de multiplicación
viral todas las bacterias de la zona que rodea el virus original están destruidas. Esto
produce diversos claros, o placas, visibles en un cultivo bacteriano sobre la superficie del
agar. Mientras se forman las placas de las bacterias no infectadas en el resto de la placa
petri, se multiplican con rapidez y producen un fondo turbio.
En teoría cada placa corresponde a un único virus de la suspensión inicial. En
consecuencia, las concentraciones de suspensiones virales medidas por la cantidad de
placa en general se denominan unidades formadoras de placa (UFP).

CULTIVOS CELULARES
Estos consisten en células desarrolladas en medios especiales en el laboratorio y como
en general son conjuntos de células bastante homogéneas y se pueden propagar de
manera similar a los cultivos bacterianos, es más conveniente trabajar con ellos que con
animales enteros o huevos embrionados. Las líneas de cultivos celulares se inician al
tratar un corte de tejido animal con enzimas que separan las células individuales. Estas
células se suspenden en una solución que le proporcionan la presión osmótica, los
nutrientes y los factores de crecimiento necesarios para que crezcan . Las células
normales tienden adherirse al recipiente de vidrio o plástico y se reproducen hasta formar
una monocapa.

Clases de cultivos celulares:

● Cultivos primarios: Son células provenientes del tejido original y recién

transplantado a condiciones artificiales. Este primer cultivo contiene una población
celular variada; después de pases sucesivos la población celular capaz de

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proliferar rápidamente predomina, y la que no proliferado lo hace más lento

desaparece. Este tipo de cultivo suele tener una duración limitada, por lo que se le
llama cultivo celular finito. Las células poseen el mismo cariotipo de tejido original,
el mismo número de cromosoma y la misma cromatina sexual.

- Líneas celulares: Son células derivadas de un cultivo primario, las cuales

pueden sub cultivarse in vitro repetidamente. Pueden subdividirse en:

a) Diploides: En estos cultivos el 75%de la población tiene el mismo

cariotipo de las células normales de la especie de la cual se origina
el tejido.
b) Continuas: Aquellos en los cuales menos del 75%de la población
presenta cariotipo de las células de origen, debido a la pérdida de
cromosomas. Puede originarse de un tejido normal o anormal, pero
se considera que estas células han sufrido una transformación que
le confiere características de crecimiento diferentes, entre las que
tenemos: inmortalización, capacidad de crecer en agar y de inducir
tumores en ratones.

● Cepas celulares: Es el cultivo derivado, por selección (podría decir clonación) de

una célula, desde un cultivo primario de una línea celular. El nuevo cultivo tendrá
propiedades o marcadores específicos que persistirán durante los pases
subsiguientes.

Medios de cultivo:
Se han utilizado diversos medios de cultivo para el crecimiento y aislamiento de
bacteriófagos en BAL; los principales son:
el M17, más 0.5% de lactosa a 30 °C; el Elliker, con 1% de extracto de carne; y 2.5 g mL1
de cloranfenicol, que para su conservación a 80 °C se adiciona 10% de glicerol.
Para las pruebas de sensibilidad y presencia de fagos (técnica de la doble capa):
se ha utilizado el agar Bacto (1.5% y 0.75% de agar para cada placa), el medio MRS,
adicionando CaCl2·6H2O 10 mM y el medio a base de tripticasa peptona y extracto de
levadura.

● LB medio de cultivo líquido utilizado de forma habitual para el crecimiento

bacteriano. En algunos experimentos se modificó la osmolaridad del medio
cambiando la concentración de NaCl.
● LB agar: es el medio de cultivo sólido utilizado de forma habitual y consiste en
añadir 15 g/l de agar para bacteriología (Schärlau Microbiology) al medio LB arriba
especificado.
● LB agar blando: medio de cultivo semisólido utilizado para la titulación de lisados
fágicos al permitir el crecimiento en masa de la bacteria. En este caso al medio LB
se le añaden de 6-8 g/l de agar para bacteriología.
● EBU: medio sólido utilizado para la obtención de clones libres de pseudolisógenos
después de una transducción generalizada con el fago P22. Consiste en el medio
LB agar que una vez esterilizado se suplementa el resto de componentes abajo

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indicados, todos ellos esterilizados por filtración.

● E y NCE: los medios E y NCE se usaron en su calidad de medios mínimos. La
composición y preparación de ambos medios es prácticamente la misma, salvo
que el medio E contiene citrato, fuente de carbono utilizable por Salmonella,
además de la glucosa, que es la fuente de carbono habitual. El medio NCE no
contiene citrato, por lo que es necesaria una variación en la composición de sales
para que el pH sea neutro. Tanto el medio E como el NCE se preparan como
soluciones de sales 50 veces concentradas, que se esterilizan con cloroformo. En
el momento de preparar el medio se diluyen 50 veces en agua bidestilada estéril
para el medio líquido, y en agua con agar 15 g/l para el medio sólido.
● MS medio mínimo resultado de una ligera modificación del medio MOPS, en el que
sus componentes están perfectamente controlados, por lo que se puede utilizar
para limitar la concentración de determinados nutrientes como el fósforo, el
nitrógeno o la glucosa.

APLICACIONES DE LOS FAGOS EN BIOTECNOLOGÍA

● Fagoterapia: Empleados para el tratamiento de enfermedades en humanos; un
ejemplo de ello fue el desarrollo del Phagobioderm utilizado con éxito en el
tratamiento de pacientes infectados con Staphylococcus aureus con resistencia a
varios antibióticos; geles como endolisinas, como control biológico introducción
intencional para controlar la presencia de bacterias patógenas en los pacientes
(gastroenteritis).
● Biomarcadores de salud/enfermedad: Ayudan en la identificación de bacterias, al
colocar sobre muestras de bacterias aisladas de pacientes, indicando la prueba
positiva para cuando se produce una lisis.
● Enzibioticos: Las enzimas líticas de los fagos se utilizan para destruir la pared
bacteriana desde el interior de la célula infectada y así facilitar la liberación de la
descendencia fágica.
● Reporteros de diversidad microbiana.
● Vectores genéticos o de medicamentos.
● Controladores de la microbiota:estos microorganismos hacen parte de los
mecanismos que mantienen la homeostasis bacteriana en este órgano gracias a
su especificidad por cada una de las especies bacterianas residentes en el tracto
gastrointestinal.
● Seguridad en alimentos.
● Existen compañías que comercializan fagos para terapia en humanos o animales
además de otras aplicaciones como sanitizantes.

PURIFICACIÓN DE BACTERIOFAGOS POR EL METODO DE AGAR DOBLE PLACA

Los métodos clásicos para la detección de bacteriófagos se basan en la detección de sus
efectos sobre sus bacterias huéspedes. Tradicionalmente para la enumeración de los
bacteriófagos se utiliza el ensayo de la doble capa de agar, en el que se deposita una
capa de agar semisólido que contiene una cepa huésped determinada (en función del
bacteriófago que se quiera cuantificar) y la muestra a analizar, sobre una capa de agar. La
cuantificación de los bacteriófagos se realiza mediante la detección de zonas o placas de

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lisis originadas por la infección y lisis de la bacteria huésped por un bacteriófago o grupos
de bacteriófagos presentes en la muestra, tras un periodo de incubación de dicha cepa
huésped.

El objetivo es aislar y tener una población clonal de un bacteriofago a partir de cualquier

muestra, la técnica se fundamenta en la aplicación de un método de recuento en placa
similar al de las bacterias pero al final del proceso en lugar de contar colonias, se
recuperan los halos de lisis aislados y se liberan los fagos del agar en un medio acuoso.
Todos los fagos recuperados de un único halo de lisis son la progenie de un único fago,
por lo tanto obtenemos una población clonal. Los lisados recuperados pueden
multiplicarse hasta generar stocks de alto título.

FAGOS LISOGÉNICOS O ATEMPERADOS

Algunos bacteriófagos se pueden dividir en dos grupos dependiendo de su ciclo de vida:

a) Los fagos líticos o virulentos

Provocan la lisis de las células hospedadoras, liberando una nueva progenie fágica en un
proceso conocido como ciclo lítico.

b) Los fagos atemperados

El DNA viral puede integrarse en el genoma de la bacteria infectada y replicarse junto a
éste, transmitiendo el material genético de una generación a otra sin que se produzca la
lisis celular. Este fenómeno se conoce como lisogenia, a la cepa así infectada como
lisógeno y al DNA viral integrado como profago. En determinadas condiciones, el profago
puede comenzar un ciclo lítico que conducirá a la lisis celular.

APARIENCIA DE LA LISIS DE BACTERIOFAGOS EN PLACA

Virulentos líticos Virulentos no líticos Temperados

Pacas claras Placas turbias y Placas turbias no

homogéneas homogéneas

Ejemplo:T4 Ejemplo: M13 Ejemplo:λ

BIBLIOGRAFÍA

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UNIVERSIDAD DE OVIEDO Departamento de Biología Funcional Área de Microbiología;
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pdf?sequence=3&isAllowed=y

MATERIALES
a) Material no esterial
Cepas bacterianas en tubo con 5 mL de medio Luria
Gasas
Micropipeta de 100 µL
Tubos con 3 mL de agar blando fundido
Caja de cultivo con medio rico sólido

b) Material esteril
Probeta de 10 mL
Jeringa de 10 mL
Filtro tipo pirinola

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Pipeta graduada de 5 mL
Puntas de micropipeta amarillas

REACTIVOS
N/A

PROCEDIMIENTO
1. Preparación de las cepas indicadoras (preparado previo a la práctica)
a) Sembrar una asada de las bacterias: Escherichia coli, Salmonella tiphy, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus fecalis, Pseudomona aeruginosa, en tubos
conteniendo 5 mL de medio Luria.
b) Incubar a 37°C durante 18-24 h, sin agitación.

2. Agitar la muestra de agua y pasarla a través de varias capas de gasa para eliminar todas
las partículas grandes, hasta tener un volumen de filtrado de 10 mL aproximadamente.
3. Con una jeringa y enroscada a un filtro tipo pirinola, con un poro de 0.22 μm, filtrar 5 mL del
filtrado obtenido en el paso anterior y recolectarlo en un vial estéril; este paso se realiza
despacio.
4. Prueba de gota:
a) Colocar 0.1 mL de cada uno de los cultivos (PASO NÚMERO 1), por separado, sobre
tubos conteniendo 3 mL de agar blando fundido y mantenido a 45°C.
b) Mezclar y vaciar el contenido del tubo sobre una caja con medio rico sólido (una para cada
cepa indicadora), dejar solidificar.
c) Colocar en las cajas preparadas de la manera anterior, tres gotas del filtrado del agua
residual, de manera dispersa en cada una de las placas.
d) Dejar absorber las gotas en el medio e incubar a 37°C durante 18-24 h.

1. Registrar los resultados de la prueba de gota.

2. Describir la forma de las placas líticas
3. Contar el número de placas líticas obtenidas

Disposición de residuos:
• Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.
• Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
• Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan
hipoclorito al 5%.

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