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Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas moleculares. Explica los diferentes tipos de marcaje como el marcaje de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas usando PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. Además, describe los errores comunes y la importancia del marcaje molecular mediante sondas específicas para identificar secuencias de DNA.
Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas moleculares. Explica los diferentes tipos de marcaje como el marcaje de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas usando PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. Además, describe los errores comunes y la importancia del marcaje molecular mediante sondas específicas para identificar secuencias de DNA.
Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas moleculares. Explica los diferentes tipos de marcaje como el marcaje de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas usando PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. Además, describe los errores comunes y la importancia del marcaje molecular mediante sondas específicas para identificar secuencias de DNA.
Objetivos de aprendizaje Explica los procedimientos para el marcaje de fragmentos de DNA utilizando la tecnologa de PCR. Reconoce los tipos y caractersticas de sondas moleculares y los fundamentos del marcaje, asi como la importancia de su utilizacin. Conoce y explica generalidades de diferentes mtodos de marcaje.
Errores mas frecuentes.
La mala traduccin de algunos libros de textos, tienden a cambiar la idea general de los conceptos. Confundir las tcnicas de los distintos tipos de marcaje molecular. No saber de donde proviene el fragmento de Klenow. Casarse con la idea de que solo existe un solo tipo de marcaje de DNA por sonda Qu es una sonda de DNA?
Son molculas de DNA de cadena sencilla marcadas mediante radiacin o agentes qumicos, con el fin de ser utilizadas para la deteccin de secuencias complementarias de DNA. Importancia. La capacidad de encontrar en un genoma las secuencias de DNA de interes mediante sondas especificas siendo usado principalmente en el campo de la medicina.
marcaje de fragmentos de DNA utilizando la tecnologa de PCR.
Se usan nucleotidos modificados con moleculas fluorescentes o atomos radiactivos (la molecula fluorescente solo debe de fijarse a la base de uno de los cuatro nucleotidos usados como precursores en la sintesis de DNA) Los nucleotidos se marcan radiactivamente con 32P y el 35 S.
Tambien se pueden marcar los nucleotidos con biotina o dixogigenina marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser Usados en la macarcion de sondas por la la tecnologa de PCR. oligonucleotidos degenerados. MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS EN EL EXTREMO 3
SE MARCAN USANDO LA ENZIMA TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN EL EXTREMO 3 Marcacin de oligonucleotidos con TdT MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS EN EL EXTREMO 5
SE MARCAN USANDO LA ENZIMA POLINUCLEOTIDO CINASA QUE AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32 EN EL EXTREMO 5 DE CADA CADENA DE DNA RNAm cDNA Plantilla para PCR oligonucleotidos Degenarados marcados PCR RT-PCR Sondas DNA marcadas. SONDAS MOLECULARES CONVENCIONALES. SONDAS. DNA. RNA. Sondas convencionales, DNA obtenido por clonacion celular. EXTRACCION DEL DNA PLASMIDICO
RESTRICCION DEL INSERTO
DESNATURALIZACION DEL DNA Sondas convencionales, RNA obtenido por clonacin celular. Marcaje de sondas Mtodo Directo. Mtodo Indirecto. El marcador se detecta unido a la sonda. El marcador para poderse Detectar debe unirsele una Proteina detectora. MARCAJE DE SONDAS, METODO INDIRECTO Generalidades de diferentes tipos de marcaje. NICK TRANSLATION.
RANDOM PRIMER EXTENSION.
MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.
MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito en marcaje de fragmentos de DNA utilizando PCR, se usa un nucleotido marcado con 32Pd NTP, -35Sd NTP. Marcacin de SONDAS NICK trasnlation.
ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 1
SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA
SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE LAS DNAasas.
PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS
NICK TRANSLATION. Marcacin de SONDAS RANDOM PRIMER
SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.
SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA POR CALOR).
SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
Metodo de cebador al azar Marcaje terminal por relleno Bibliografia. Biologia celular y molecular. Lodish, Berk, Zipursky, 4ta. Edicion, editorial panamericana.
Biologa molecular e Ingeniera Gentica. Luque, Jos ngel. ; Editorial Harcourt.