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DE LA CITOMETRA DE
FLUJO
Dra. Adelaida Vargas Durand
Servicio de Inmunologa y Bioqumica
Hosp. Nac. Edgardo Rebagliati M.
Qu es la citometra de flujo?
Amplificacin Representacin
digitalizacin y Anlisis
FSC/SSC
Lser
Rayo laser
Y
Subsistemas trabajando integrados
Flow
Chamber
Filters
Color
Detectors
Sample
SSC
FSC Laser
Light Detectors
Identificacin de marcadores celulares
con anticuerpos
Clulas
Anlisis
en el
+ Citmetro
Incubar
Clulas marcadas
Anticuerpos
7
PROBLEMAS CLNICOS ABORDABLES
MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO
Mdula sea
Sangre perifrica
Lquidos corporales (cavidades, lavados)
Tejidos slidos (piel, ganglios linfticos,
bazo, otros).
Productos de Afresis, muestras procesdas
para obtener C.P.H.
COMPARTIMENTOS CELULARES
CITOPLASMA : MPO,
MEMBRANA CD79a, Ig, CD22, CD3
CELULAR :
>CDs
NCLEO : TdT
Procesamiento
CD 8
T Cells
Seguimiento de HIV
recuento de linfocitos CD4
MONITORIZACION POR CITOMETRIA FLUJO
PACIENTES TRASPLANTADOS
DISMINUCION DE CELULAS NK
ACTIVACION DE LINFOCITOS T y B
(HLA DR, IL2-R en Clulas T, CD23, CDw78 en Clulas B)
CAMBIO EN FENOTIPO LINFOCITOS CD4
(CD45 RA+ CD45 RA-)
Otras aplicaciones clnicas del
inmunofenotipo de superficie
CONTROLES
300
SEPSIS NO SOBREVIVEN
SEPSIS SOBREVIVEN
vs
IAM NO SOBREVIVEN
p<0.05
40 CONTROLES IAM SOBREVIVEN
250
CD3+CD69+ (N/l)
SEPSIS NO SOBREVIVEN
SEPSIS SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN 200 vs p<0.05
vs p<0.05
CD3+CD69+ (%)
30 *
vs p<0.05
150
vs p<0.05
p<0.05
* *
100
20 *
p<0.05 * 50
* * 0
10 * * T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
p<0.05
* CONTROL SEPSIS IAM
0
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD19+CD23+ (N/l)
100 vs p<0.05
CD19+CD23+ (%)
300
80 p<0.05 * *
*
*
60 200
*
40 *
p<0.05
100
20 *
*
0 0
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28 T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
0.1% 0.22%
R1
33.8%
0.3%
R1
PE
CUANTIFICACIN DE
LA ACTIVIDAD
FAGOCTICA
PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA
ACTIVIDAD FAGOCTICA
100
% DE FAGOCITOSIS
80
60
40
MACRFAGO / 20
GRANULOCITO 10 min, 0 oC 0
0 3 5 10
TIEMPO (min)
2.5 min, 37oC
+ 5 min, 37oC
FITC
27
ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DE LOS
LOS GRANULOCITOS
GRANULOCITOS
(CD15+) DE SANGRE PERIFERICA
DE PACIENTES CON SHOCK SEPTICO
R1=Granulocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)
Control
9 5 .4 5 %
0.84%
R1
57%
0. 73 %
R1
28
LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA
PERIFERICA
DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
PRESENTAN UNA ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA
DISMINUIDA
R1=Monocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)
Control
2 .2 5 % 8 1 .2 8%
R1
1.30%
3 6 .7 4 %
R1
29
ESTUDIO DEL CICLO
CELULAR
. Estudio de la cantidad de DNA en clulas
individuales
. Historial de divisiones de clulas marcadas
Ciclo celular
RESULTADO DE LA MEDIDA DE
DNA EN POBLACIONES DE
CLULAS
G0/G1
S
G2/M
M1
M3
M2
2n 4n
Aneuploidas en clulas tumorales
Hiperplasia y lesin celular
APLICACIN DE LA CITOMETRA DE
FLUJO EN LA DETERMINACION DE
CLULAS PROGENITORAS
HEMATOPOYTICAS OBTENIDAS DE
DIFERENTES FUENTES :
Adipocitos Miofibras
Trasplante de clulas progenitoras CD 34+
CD34
Progenitor
cell CD8 CD38
Thy
Procesamiento de la sangre de
cordn umbilical
Identificacin, y
ubicacin de las
muestras por cdigo
de barras
Determinacin de CD34+,CD45+,
Viabilidad por FACS
DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOLGICAS
Morfologa + citoqumica
Citogentica
Inmunofenotipo
Biologa molecular/FISH
1) DISCRIMINACIN
POR FSC-SSC
Granulocitos
Linfocitos
R1
Monocitos
Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de la
heterogeneidad celular
Monocitos
Granulocitos CD14+
CD15+
Linfocitos
CD3+
T2ab
T1gd
CD4+
CD8+
CD56+
0 256 512 768
CD19+
1024
FS C-Hei gh t ->
4C 51 44 00 1
CD5+
CD5-
Maduracin de neutrfilos
CD16-PE
CD11b-FITC
ANTGENOS Y LINAJES
LINAJE T LINAJE B MIELOIDE INMADUREZ
Y NK
TCR ab/gd CD79a , MPO CD33, TdT, CD34,
CD3 Ig M, CD22 CD13 CD117,
(Sm,Cy) Ig D, Ig A, Lisozima
Ig G, k, l
Lymphoblastos
TWO LEUKEMIC
POPULATIONS
B-negative, CD64+
CD14+/-CD33+
(MONOCYTIC
LEUKEMIA)
CD19+CD22+
CD10-CD15+
(B-lineage ALL)
MLL associated
APLICACIONES DE LA C.F. PARA
LINFOMA/LEUCEMIA CRONICA
Contribuciones al diagnstico
Demostracin de poblacin monoclonal B
Demonstracin de expresin antignica
anormal en malignidades de clulas T .
Contribuciones a la classificacin
Descripcin detallada del IFTP
Definicin de las caractersticas FSC/SSC
Estudio de la proliferacin
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Clulas anormales no
estn en el hueco
blstico
Linfocitos
anmalos
Tumor
Normal CLL
En un fondo de
cls. Normales B
CASO
Hombre de 59 aos con anemia y trombocitopenia
CLL Hairy
cell
GRACIAS