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APLICACIONES CLNICAS

DE LA CITOMETRA DE
FLUJO
Dra. Adelaida Vargas Durand
Servicio de Inmunologa y Bioqumica
Hosp. Nac. Edgardo Rebagliati M.
Qu es la citometra de flujo?
Amplificacin Representacin
digitalizacin y Anlisis

FSC/SSC
Lser

Permite identificar clulas,


contarlas y caracterizarlas
Columna
de muestra
Flujo
Liquido envolvente
Camara de flujo

Nucleo de flujo de muestr

Rayo laser
Y
Subsistemas trabajando integrados

Flow
Chamber
Filters

Color
Detectors
Sample
SSC

FSC Laser

Light Detectors
Identificacin de marcadores celulares
con anticuerpos

Clulas

Anlisis
en el
+ Citmetro
Incubar
Clulas marcadas

Anticuerpos
7
PROBLEMAS CLNICOS ABORDABLES
MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO

Para la toma de decisiones diagnsticas y


teraputicas :

. El diagnostico de leucemias y linfomas.


. El seguimiento de marcadores pronsticos como
las cuentas de linfocitos CD4.
. La determinacin de la eficacia de tratamientos
antitumorales e inmunosupresores.
4. Estudio de inmunodeficiencias congnitas y
adquiridas.

5. Monitorizacin del efecto de terapia


inmunosupresora en pacientes trasplantados.

6. Estudio de la ploidia y proliferacin celular.

7. Cuantificacin de concentraciones de molculas


solubles.

8. Purificacin de clulas antgeno-especficas.

9. Leucocitos residuales en hemoderivados


Fuentes biolgicas

Mdula sea
Sangre perifrica
Lquidos corporales (cavidades, lavados)
Tejidos slidos (piel, ganglios linfticos,
bazo, otros).
Productos de Afresis, muestras procesdas
para obtener C.P.H.
COMPARTIMENTOS CELULARES

CITOPLASMA : MPO,
MEMBRANA CD79a, Ig, CD22, CD3
CELULAR :
>CDs

NCLEO : TdT
Procesamiento

Recepcin: datos clnicos y dx. presuntivo


Lisado glbulos rojos no nucleados (muestras
hematolgicas)
Lavado y filtrado (muestras no hematolgicas)
Aplicacin de Ac : paneles (fases)
Adquisicin y almacenamiento de datos
Anlisis e interpretacin
Informe
Medida de fluorescencia en clulas
individuales por citometra de flujo
Propiedades Ventajas

Es especfica de color Permite estudio


multiparamtrico simultneo
Es cuantitativa con un Altsima sensibilidad
amplio rango de medida
Alta Mide en cantidades elevadas
velocidad de clulas
Obtener conclusiones
estadsticamente fidedignas
objetivas y reproducibles
Recuento de poblaciones
celulares
Recuento de poblaciones celulares

Determinacin del nmero absoluto de


clulas
Clulas pequeas y de complejidad
interna reducida (patrn FSC/SSC) :
-Linfocitos B
-Linfocitos T
- CD4+
- CD8+
- CD4+/CD8+
-Clulas NK
-Clulas inmaduras
-Serie Eritrocitaria/Cls. no vlidas
Anlisis de antgenos celulares

4,29 % Red Events


5,36 % Green Events
8,40 % Blue Events
4,71 % Yellow Events
0,0 % Violet Events
0,36 % Cyan Events
0,0 % White Events
76,89 % Unclassified Events

Secuencia lgica de seleccin


de la poblacin a estudiar
Cuantificacin del nmero de linfocitos
T CD4 en pacientes con HIV
CD4 T cells

CD 8
T Cells
Seguimiento de HIV
recuento de linfocitos CD4
MONITORIZACION POR CITOMETRIA FLUJO
PACIENTES TRASPLANTADOS

APLICACIN: DIFERENCIACION ENTRE INFECCION


VIRAL AGUDA Y RECHAZO DE TRASPLANTE
MEDIANTE MONITORIZACION DE LINFOCITOS
EN SANGRE PERIFERICA

INFECCION VIRAL AGUDA:


Disminucin de la relacin CD4/CD8
Incremento de clulas CD8+, HLADR+, CD57+
RECHAZO A INJERTO:
Incremento de clulas T IL-2R+
Incremento de Clulas T CD4+, CD45 Ra-
MONITORIZACION POR CITOMETRIA FLUJO
ENFERMEDADES AUTOINMUNES

APLICACIN: Esclerosis Mltiple, A.R.,


L.E.S., Cirrosis Biliar primaria, Artritis
Psoriasica, Enf. De Graves.
MEDIANTE MONITORIZACION DE LINFOCITOS
EN SANGRE PERIFERICA

DISMINUCION DE CELULAS NK

ACTIVACION DE LINFOCITOS T y B
(HLA DR, IL2-R en Clulas T, CD23, CDw78 en Clulas B)
CAMBIO EN FENOTIPO LINFOCITOS CD4
(CD45 RA+ CD45 RA-)
Otras aplicaciones clnicas del
inmunofenotipo de superficie

Identificacin de pacientes spticos con alto riesgo de


mortalidad : Niveles aumentados de CD69 y CD62L.
Actividad de la enfermedad y prediccin de la
eficacia teraputica en pacientes con LES

Porcentaje y cifras de linfocitos T CD69+


en pacientes con sepsis de alto riesgo

CONTROLES
300
SEPSIS NO SOBREVIVEN
SEPSIS SOBREVIVEN
vs
IAM NO SOBREVIVEN
p<0.05
40 CONTROLES IAM SOBREVIVEN
250

CD3+CD69+ (N/l)
SEPSIS NO SOBREVIVEN
SEPSIS SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN 200 vs p<0.05
vs p<0.05
CD3+CD69+ (%)

30 *
vs p<0.05
150
vs p<0.05
p<0.05
* *
100
20 *

p<0.05 * 50

* * 0
10 * * T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
p<0.05

* CONTROL SEPSIS IAM

0
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CONTROL SEPSIS IAM


Porcentaje y cifras de linfocitos B CD23+
en pacientes con sepsis de alto riesgo
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVEN
CONTROLES SEPSIS SOBREVIVEN
120 400 IAM NO SOBREVIVEN
SEPSIS NO SOBREVIVEN
SEPSIS SOBREVIVEN IAM SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN

CD19+CD23+ (N/l)
100 vs p<0.05
CD19+CD23+ (%)

300

80 p<0.05 * *
*
*

60 200

*
40 *
p<0.05
100

20 *
*

0 0
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28 T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CONTROL SEPSIS IAM CONTROL SEPSIS IAM


PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE
SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
CONTROL
R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

0.1% 0.22%

R1

PACIENTE SHOCK SEPTICO


R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

33.8%
0.3%

R1

PE
CUANTIFICACIN DE

LA ACTIVIDAD

FAGOCTICA
PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA
ACTIVIDAD FAGOCTICA
100

% DE FAGOCITOSIS
80

60

40

MACRFAGO / 20
GRANULOCITO 10 min, 0 oC 0
0 3 5 10
TIEMPO (min)
2.5 min, 37oC

+ 5 min, 37oC

E. Coli 10 min, 37oC

FITC

27
ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DE LOS
LOS GRANULOCITOS
GRANULOCITOS
(CD15+) DE SANGRE PERIFERICA
DE PACIENTES CON SHOCK SEPTICO
R1=Granulocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)
Control
9 5 .4 5 %
0.84%
R1

Paciente con Shock Sptico

57%
0. 73 %

R1

28
LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA
PERIFERICA
DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
PRESENTAN UNA ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA
DISMINUIDA
R1=Monocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)
Control

2 .2 5 % 8 1 .2 8%

R1

Paciente con Shock Sptico

1.30%
3 6 .7 4 %

R1

29
ESTUDIO DEL CICLO
CELULAR
. Estudio de la cantidad de DNA en clulas
individuales
. Historial de divisiones de clulas marcadas
Ciclo celular
RESULTADO DE LA MEDIDA DE
DNA EN POBLACIONES DE
CLULAS

G0/G1
S
G2/M
M1
M3
M2

2n 4n
Aneuploidas en clulas tumorales
Hiperplasia y lesin celular
APLICACIN DE LA CITOMETRA DE
FLUJO EN LA DETERMINACION DE
CLULAS PROGENITORAS
HEMATOPOYTICAS OBTENIDAS DE
DIFERENTES FUENTES :

TERAPIA CON CELULAS MADRE


SANGRE DE CORDN UMBILICAL
La terapia celular con clulas madre es uno de
los campos de la medicina que ms expectativas
ha producido por las infinitas posibilidades
teraputicas.
Una clula madre, troncal o progenitora,
es aquella que es capaz de dividirse y
diferenciarse en distintos tipos de clulas
especializadas, no slo morfolgicamente
sino tambin en forma funcional.
Clulas Madre
Potencialidad
Zigoto Mrula Blastocisto Cuerpos embrioides

Clulas madre Clulas madre


totipotenciales pluripotenciales
Clulas madre
multipotenciales
Clulas madre germinales
Clulas madre somticas

Ectodermo Endodermo Mesodermo

Neuroesferas Piel Hgado Gastrointestinal Mdula sea Msculo


Neuronas,glias Epid.,dermis Cl.ovales Cond.pancreticos HSC MSC Cl.satlite

Hepatocitos Neutrf.,plaq.,erit. Condrob.,Osteob Mioblastos

Adipocitos Miofibras
Trasplante de clulas progenitoras CD 34+

Establecimiento del momento ptimo de


recoleccin:
Leucocitos>1000/L y CD34+
entre 40-50/L
Correlacin entre el nmero de clulas
CD34+ en el producto de la afresis y
la recuperacin de los pacientes
trasplantados.
Clulas progenitoras de la Sangre de
Cordn Umbilical

Una de las fuentes ms prometedoras


de clulas pluripotenciales
Puede extraerse en el momento del
nacimiento sin afectar al neonato ni a
la madre.
Clulas progenitoras de la
Sangre de Cordn Umbilical
Potencial hematopoytico: responsabilidad
en la reconstruccin hematolgica de
sujetos sometidos a tratamientos mieloablativos.

CD34

Progenitor
cell CD8 CD38

Thy
Procesamiento de la sangre de
cordn umbilical

Reduccin Fraccionamiento Congelacin


del volumen de muestra

Identificacin, y
ubicacin de las
muestras por cdigo
de barras
Determinacin de CD34+,CD45+,
Viabilidad por FACS
DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOLGICAS

Sntomas y signos Laboratorio

Morfologa + citoqumica

Citogentica
Inmunofenotipo

Biologa molecular/FISH
1) DISCRIMINACIN
POR FSC-SSC
Granulocitos

Linfocitos
R1

Monocitos
Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de la
heterogeneidad celular
Monocitos
Granulocitos CD14+
CD15+

Linfocitos
CD3+
T2ab
T1gd
CD4+
CD8+
CD56+
0 256 512 768
CD19+
1024
FS C-Hei gh t ->
4C 51 44 00 1
CD5+
CD5-
Maduracin de neutrfilos

CD16-PE
CD11b-FITC
ANTGENOS Y LINAJES
LINAJE T LINAJE B MIELOIDE INMADUREZ
Y NK
TCR ab/gd CD79a , MPO CD33, TdT, CD34,
CD3 Ig M, CD22 CD13 CD117,
(Sm,Cy) Ig D, Ig A, Lisozima
Ig G, k, l

CD1a, CD2, CD10, CD19 CD14, CD15, CD38


CD4, CD5, CD20, CD11c CD16, HLA-DR
CD7, CD8, CD25, FMC7 CD64,CD11b
CD103
CD56, CD57 Gly-A, CD71,
CD16 CD41a ,CD61
CARACTERIZACIN INMUNOFENOTPICA
DE LAS CLULAS

EN QU DIFIEREN LAS ANORMALES ?

Reflejan desarreglos de expresin proteica con


fenotipos aberrantes con o sin anomalas
genticas asociadas
Fenotipos aberrantes

Intensidad fluorescente anormal por Ac


Ausencia o sobreexpresin de Ac
Expresin asincrnica madurativa
Maduracin/compartimento biolgico
Curva de maduracin anormal
Expresin antignica de varios linajes
Clasificacin de las leucemias: OMS

LMA con anormalidades citogenticas recurrentes


LMA con t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO)
LMA con inv(16)(p13;q22) o t(16;16) (p13;q22)
LPA: LMA con t(15;17)(q22;q12)(PML/RARa)
y variantes
LMA con anormalidades del 11q23(MLL)
LMA con displasia multilinaje
LMA y SMD relacionados a terapia
LMA con t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO)
LPA con t(15;17)(q22;q12) (PML/RARa)
LMA sin maduracin (M1)
Monoblastos

Lymphoblastos
TWO LEUKEMIC
POPULATIONS

B-negative, CD64+
CD14+/-CD33+
(MONOCYTIC
LEUKEMIA)

CD19+CD22+
CD10-CD15+
(B-lineage ALL)
MLL associated
APLICACIONES DE LA C.F. PARA
LINFOMA/LEUCEMIA CRONICA
Contribuciones al diagnstico
Demostracin de poblacin monoclonal B
Demonstracin de expresin antignica
anormal en malignidades de clulas T .

Contribuciones a la classificacin
Descripcin detallada del IFTP
Definicin de las caractersticas FSC/SSC
Estudio de la proliferacin
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA

Clulas anormales no
estn en el hueco
blstico
Linfocitos
anmalos
Tumor
Normal CLL

En un fondo de
cls. Normales B
CASO
Hombre de 59 aos con anemia y trombocitopenia
CLL Hairy
cell
GRACIAS

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