NDICE 1 Introduccin.......................................................................pgina 2 2 Biodesulfurizacin de combustibles diesel..................pginas 35 3 Desarrollo de biorreactores para desulfurizacin......pginas 5 y 6 4 Microorganismos potencialmente tiles en desulfurizacin.................................................................pginas 69 5 Conclusiones..........................................................pginas 9 y 10 Bibliografa.................................................................

.....pginas 10 y 11 1 Introduccin En la pasada dcada, decenas de millones de dlares se han invertido en el desarrollo de biotecnologa para mejorar la calidad de los combustibles fsiles. La mayor parte de este esfuerzo se ha centrado en la biodesulfurizacin de dichos combustibles, un viejo concepto (originado hace 50 aos) que recientemente ha recibido renovada atencin como mtodo verde para el procesamiento del petrleo. Esta reciente atencin se debe tambin a las dificultades tcnicas y econmicas asociadas con los procedimientos convencionales de desulfurizacin. Cada da, alrededor de 80 millones de barriles de petrleo (aproximadamente 10 millones de toneladas) son bombeados desde el interior de la tierra, y no hay indicios de que este ritmo se decrezca en un futuro cercano; recientes estimaciones auguran que las reservas de gas natural, crudo, turba y carbn son suficientes para continuar as al menos durante los prximos 70 aos. La mayora (el 90%) de los hidrocarburos extrados de la tierra son quemados para la obtencin de energa. Dado que las reservas, tanto slidas como lquidas, suelen estar contaminadas por azufre, la combustin directa de este combustible conducira a la liberacin de grandes cantidades de xidos de azufre a la atmsfera. stos xidos son la principal fuente de lluvia cida, por lo que la mayora de los pases han impuesto regulaciones para controlar esta liberacin. Estas reglamentaciones se constituyen en forma de limitaciones en las emisiones de azufre en las plantas generadoras de energa (obligadas a usar combustibles de bajo azufre y a realizar depuraciones postcombustin) y en la imposicin de cada vez mas duras restricciones en los niveles de azufre permitidos en los combustibles de transporte (aerocombustibles y gasleo) y combustibles calefactores del hogar. Ms recientemente, el azufre de la gasolina ha sido objeto tambin de estas medidas, ya que la combustin de la gasolina envenena el convertidor cataltico de los sistemas de escape automovilsticos. Estos convertidores son usados para quemar en el motor de escape los hidrocarburos que no han ardido, que contribuyen significativamente a la polucin urbana. Los niveles de azufre en el petrleo crudo oscilan entre 1.000 y 30.000 ppm (partes por milln), y en el combustible diesel corriente a veces excede las 5.000 ppm. En la pasada dcada, los niveles de azufre aceptables en este combustible han descendido desde las 2.0005.000 ppm hasta las 500 ppm. Inminentes regulaciones conducirn a unos niveles de 350 ppm. En un futuro no muy lejano (20052007), las refineras esperan alcanzar cantidades de azufre de entre 1015 ppm. En los ltimos diez aos ha existido un considerable inters en el desarrollo de tecnologas para extraer el azufre de los combustibles de transporte; existen distintas operaciones de refinacin convencionales que se han usado para esto, y han aparecido nuevos procedimientos respondiendo a la necesidad de una desulfurizacin con bajo coste. Un posible enfoque es aprovechar las ventajas de la especificidad de los enzimas y el relativamente bajo coste de las biotransformaciones para producir gasolinas y gasleos de bajo azufre. La desulfurizacin cataltica (BDS) 1

posee los potenciales beneficios de bajos costes de operacin y capital y pueden producir gases substancialmente no invernadero. 2 Biodesulfurizacin de combustibles diesel Como ya se ha mencionado, se han identificado ciertos catalitos microbianos que puedan biotransformar los compuestos azufrados que se encuentran en los combustibles, incluyndose algunos capaces de extraer selectivamente el azufre de componentes heterocclicos del dibenzotiofeno. Se estn desarrollando para ello biosistemas de energa que implican la extraccin de hidrocarburos que contienen azufre de corrientes de destilados o naphta. La corriente de destilado es mezclada primero con un medio acuoso que contiene sosa custica, bacterias y nutrientes para las mismas. Los enzimas bacterianos inicialmente oxidan los tomos de azufre para seguidamente romper algunos de los enlaces azufrecarbono. El azufre queda tras el proceso en forma de sulfonato de hidroxifenilbenceno, el cual tiene uso comercial como sustrato para la produccin de surfactantes. Diseos basados en estudios en plantas piloto combinan biodesulfurizacin y mtodos de hidrotratamiento convencionales para producir combustible diesel que contiene 50 ppm de azufre.

Fig. 1. La ruta de la desulfurizacin biolgica del compuesto modelo dibenzotiofeno se basa en la biocatlisis por especificidad. DSZA, DSZB, DSZC y DSZD son los productos gnicos catalticos de los genes dszA, dszB, dszcC y dszD, respectivamente. La figura 1 muestra los pasos generales en el sistema de biodesulfurizacin basado en estudios realizados en varias especies bacterianas. Esta ruta a veces recibe el nombre de ruta 4S por la existencia de cuatro intermediarios azufrados. Resulta interesante que esta ruta qumica bacteriana es capaz de extraer el azufre de dibenzotiofenos sustituidos con grupos alquilo, que impiden la catlisis qumica y resisten la hidrodesulfurizacin. Esta actividad se ha observado en diferentes bacterias y, en la mayora de los casos, bacterias emparentadas catalizan la misma reaccin. Los principales genes implicados en el metabolismo del dibenzotiofeno (DBT) han sido clonados, secuenciados y considerablemente analizados. Su denominacin ms extendida para ellos es dsz. Los genes dszA, dszB y dszC se localizan en un opern sencillo en un gran plsmido en Rhodococcus erythropolis IGTS8 y otras cepas relacionadas. El promotor ha sido caracterizado y parece ser afectado por la presencia de aminocidos azufrados, y los resultados parecen confirmar un mecanismo de represin. La evidencia de una induccin por parte del DBT no resulta convincente. 2

Fig. 2. Diagrama conceptual de algunos de los pasos de la desulfurizacin del combustible diesel. No est claro como los distintos pasos separados estn implicados en la transferencia de las molculas de CxDBT (dibenzotiofeno) desde el combustible hasta el primer enzima. Resultados experimentales sugieren que la transferencia de masa no est limitada por un paso intermedio combustibleagua o aguaclula. Tampoco est claro cmo CxHPB o CxHPBS salen de la clula. DBTO = sulfxido de dibenzotiofeno, DBTO2 = dibenzotiofenil sulfona, DBTMO = dibenzotiofeno monooxigenasa. Ahora bien, la enzimtica no es el nico factor importante en la biodesulfurizacin; existen otros pasos potencialmente limitantes en este proceso, como ilustra la figura 2: El primer paso (y algunas veces el que limita la tasa) de la metabolizacin del CxDBT es la transferencia de los heterociclos poliaromticos azufrados desde el combustible hasta la clula. No hay evidencias de que se produzca un transporte activo al interior celular. Una vez dentro de la clula, las molculas de CxDBT son sujeto de una serie de oxidaciones, las primeras dos de las cuales son catalizadas por la misma enzima, la DBT monooxigenasa, que requiere FMN reducido para su actividad. Esta actividad la provee la enzima NADH:FMN oxidorreductasa. Ambas actividades no estn fuertemente relacionadas ni parece haber necesidad de su contacto fsico, e incluso se ha descrito el uso con xito de otro enzima regenerador de FMNH2 para mantener la actividad tanto in vivo como in vitro. La oxidacin de la dibenzofenil sulfona (DBTO2) hasta sulfonato de hidroxifenil benceno (HPBS) por parte de la siguiente monooxigenasa es una reaccin mucho ms inusual e interesante. Tambin requiere FMN reducido y oxgeno molecular. El paso final en el metabolismo especfico de los CxDBTs es la liberacin del azufre inorgnico por parte de una enzima desulfinasa. sta es tambin una reaccin inusual y genera una molcula aromtica e 3

hidrofbica, el hidroxibifenil (HBP), y sulfito. El HBP encuentra la forma de volver a la fraccin de petrleo, conservndose as el valor combustible del mismo. No est claro si existe algn sistema de transporte activo desde la clula, pero esta idea no sera descabellada dado que el HBP es un potente biocida industrial. 3 Desarrollo de biorreactores para desulfurizacin Como es fcil deducir, es necesario el contacto y mezcla de combustible, clulas y agua para una buena transferencia de masa. Desafortunadamente, esto conduce a la formacin de una fuerte emulsin que debe romperse para recuperar el combustible desulfurizado, reciclar las clulas y separar los subproductos. Un mtodo econmico y efectivo para esto implica el uso de hidrociclones, tubos cnicos que al girar separan la emulsin en distintas fases.

Fig. 3. Diagrama conceptual de flujo del proceso de biodesulfurizacin. Como se observa en la figura 3, son necesarios tres biorreactores para alcanzar muy bajas concentraciones de azufre en el combustible producto, debido a la relativamente alta KM del sistema enzimtico Dsz. En este trasfondo ,las clulas crecen y son revitalizadas durante el proceso, lo que constituye un paso necesario para alcanzar los amplios tiempos de residencia cataltica que requiere un proceso comercial. Los pasos de separacin pueden llevarse a cabo mediante el uso de hidrociclones o mediante una combinacin de stos con otros mtodos de centrifugacin de bajo coste. Como ya se ha comentado, el sulfonato de hidroxifenil benceno (HPBS), penltimo producto de la ruta 4S, para producir biopetroqumicos. Usando una biocatalisis especialmente desarrollada en la que el gen dszB (responsable de la ltima transformacin de la ruta 4S, ver Fig. 1) ha sido eliminado, pueden obtenerse grandes cantidades de CxHPBS como subproducto de la biodesulfurizacin o, usando un combustible sustrato adecuado, como un producto en s mismo.

Fig. 4. Conversin del intermediario de la desulfurizacin CxHPBS a surfactantes. Los anillos pueden ser alquilados directamente o varios steres pueden sintetizarse en el grupo hidroxilo. La longitud de la cadena lateral puede variar para producir detergentes solubles o no en agua. 4 Microorganismos potencialmente tiles en desulfurizacin Rhodococcus Sin duda el gnero ms estudiado en relacin con este tema es Rhodococcus. Se han realizado multitud de estudios con distintas especies y estirpes del mismo (como por ejemplo las estirpes de Rhodococcus erythropolis D1, KA251, IMPSO2, H2, SY1 y P32C1). De hecho, la ruta de desulfurizacin anteriormente descrita se caracteriz en dicho gnero (Rhodococcus sp. IGTS8). Una importante ventaja que posee este gnero frente a otros es su naturaleza hidrofbica, que hace que, en un sistema aceiteagua, la bacteria se adhiera a la interfase aceite agua, no apareciendo suspendida en la fase acuosa. Esto hace que las cepas de Rhodococcus puedan captar las muy hidrofbicas molculas de CxDBTs directamente del aceite, lo que aumenta la eficacia del sistema. Pseudomonas Se han realizado algunos estudios con cepas de Pseudomonas delafieldii (por ejemplo con la estirpe R8). Las bacterias de este gnero emplean una ruta de desulfurizacin distinta de la llamada 4S, basada en la ruptura de los anillos aromticos por parte de enzimas similares a la naftaleno dioxigenasa. Esta ruta se denomina Ruta Kodama. Frente a Rhodococcus, este gnero permanece suspendido en el agua en los sistemas aceiteagua, lo que hace ms inaccesible para la bacteria las molculas de CxDBTs; an as, las tasas de desulfurizacin que muestra lo hacen un gnero interesante para su utilizacin en los procesos de biodesulfurizacin. Bacillus Los estudios realizados con representantes de este gnero (por ejemplo con Bacillus subtilis WUS2B) demuestran cierta ventaja por parte de estas bacterias moderadamente termoflicas, consistente precisamente en la capacidad de realizar desulfurizacin a alta temperatura (alrededor de los 50 C) con una gran eficacia.

Fig.5. Efecto de la temperatura en la desulfurizacin del DBT por parte de clulas de B. Subtilis WUS2B en crecimiento durante 120 horas; , DBT consumido; , 2HBP producido. Dado que los procesos de hidrodesulfurizacin de combustibles diesel se producen a alta temperatura, su naturaleza termoflica representa una ventaja para este gnero, al poder acoplar mejor ambos procesos; adems, el hecho de realizar la desulfurizacin a alta temperatura reduce las probabilidades de contaminacin por parte de bacterias indeseables. Gordona sp. CYKS1 y Nocardia sp. CYKS2 Se han realizado estudios usando suspensiones de clulas inmovilizadas de ambas estirpes obtenindose resultados esperanzadores, aunque no concluyentes, sobre la posible futura aplicacin industrial de estas cepas. Paenibacillus Se han purificado al menos dos de los enzimas que participan en la desulfurizacin del DBT (TdsA y TdsB) en la bacteria Paenibacillus sp. A112. Esta bacteria termoflica muestra mayor actividad en estos enzimas a temperaturas altas, como puede verse en la figura 6. Esto representa las ventajas enumeradas anteriormente.

Fig. 6. Efecto de la temperatura sobre la actividad (A y B) y la estabilidad (C y D) de TdsA y TdsB Corynebacterium Estudios con la cepa Corynebacterium sp. P32C1 muestran que esta bacteria presenta mayor capacidad en la biodesulfurizacin que la conocida cepa Rhodococcus erythropolis IGTS8, como se observa en la figura 7.

Fig. 7. Crecimiento (A), degradacin de DBT (B), formacin de 2HBP (C) y cambio de HBPS (D). Mycobacterium Se han realizado estudios con la cepa Mycobacterium phlei WUF1. La principal ventaja de esta bacteria consiste en que muestra actividad en un amplio intervalo de temperatura, lo que la hace muy verstil a la hora del acoplamiento industrial de la biodesulfurizacin con otros procedimientos de desulfurizacin convencionales. Sphingomonas Se ha patentado alguna estirpe de este gnero para su uso industrial en biodesulfurizacin. 5 Conclusiones Nuestro conocimiento de cmo las bacterias metabolizan los heterociclos azufrados esta lejos de ser completo. Es necesaria una mejor comprensin de sus aspectos fundamentales para transformar esta interesante ruta microbiana en un autntico proceso industrial. Hemos aprendido cmo Rhodococcus trata con estos compuestos disueltos en combustible y cmo esto podra engranarse tecnolgicamente. Trabajos recientes han aportado una serie de conocimientos que podran resultar tiles en este proceso de adaptacin a la industria: Los enzimas y genes del sistema pueden ser manipulados fructferamente. Los genes que codifican enzimas similares a dsz se han encontrado en bacterias tanto Gram+ como Gram. Aunque solo muestran un 70% de homologa, las protenas catalizan reacciones similares.La especificidad y la preferencia por el sustrato vara incluso entre cepas cercanamente emparentadas.Los genes pueden ser barajados para crear genes hbridos con mejores tasas de desulfurizacin. Las propiedades fsicas de las clulas son importantes para una transferencia de masa ptima, separacin efectiva y recuperacin del producto. 8

 La ruta puede ser truncada para producir molculas valiosas. Este proceso resulta rentable en este momento y podra ser la primera aplicacin de esta tecnologa. La comercializacin de esta tecnologa para la desulfurizacin de combustibles diesel u otros combustibles de transporte y para la obtencin de surfactantes basados en el HPBS requiere la resolucin de una serie de problemas crticos. Esto incluye resolver el inconveniente de la transferencia de masa a travs de cambios en el proceso y los aspectos enzimticos mediante un programa de evolucin directa dirigida teniendo como objetivo los pasos enzimticos especficos. Si se quiere tener lista la tecnologa de cara a las nuevas normas reguladoras, contina siendo necesario trabajar para superar los obstculos tanto biolgicos como referentes al proceso industrial. BIBLIOGRAFA Cunshan Song, Xiaoliang Ma (2002) New design approaches to ultraclean diesel fuels by deep desulfurization and deep dearomatization Applied Catalysis B: Environmental, 1267:132. Extensa y rigurosa revisin que trata ampliamente todos los mtodos de desulfurizacin tanto convencionales y de desarrollo reciente. Monticello, Daniel J. (2000) Biodesulfurization and the upgrading of petroleum distillates Current Opinion in Biotechnology, 11:540546.Revisin sencilla y concisa que describe los ltimos estudios en biodesulfurizacin y su posible aplicacin industrial. Muy buenas ilustraciones. Toshimitsu Onaka, Morio Kobayashi, Yoshitaka Ishii, Koichi Okumura, Masanori Suzuki (2000) Application of solidphase extraction to the analysis of the isomers generated in biodesulfurization against methylated dibenzothiophenes Journal of Chromatography A, 903:193202. Interesante artculo que describe un mtodo de separacin de los productos de la biodesulfurizacin y esboza el mecanismo de degradacin de compuestos azufrados por parte de Rhodococcus erythropolis. Maghsoudi, S. , Vossoughi, M. , Kheirolomoom, A. , Emiko Tanaka, Shigeo Katoh (2001) Biodesulfurization of hydrocarbons and diesel fuels by Rhodococcus sp. Strain P32C1 Biochemical Engineering Journal, 8:151156. Artculo que analiza la capacidad de desulfurizacin de una cepa de Rhodococcus. Interesante aunque algo farragoso. Samir AbbadAndaloussi, Claire Lagnel, Michel Warzywoda, Frdric Monot (2003) Multicriteria comparison of resting cell activities of bacterial strains selected for biodesulfurization of petroleum compounds Enzyme and Microbial Technology, 32:446454. En este artculo se evala la actividad desulfurizadora de cinco cepas distintas de Rhodococcus en distintas condiciones. Claro pero algo escaso de figuras. Gladys Castorena, Claudia Surez, Idania Valdez, Guadalupe Amador, Luis Fernndez, Sylvie Le Borgne (2002) Sulfurselective desulfurization of dibenzothiophene and diesel oil by newly isolated Rhodococcus sp. Strains FEMS Microbiology Letters, 215:157161. Este estudio constata la eficacia en desulfurizacin de una cepa de Rhodococcus aislada recientemente. Luo, M.F. , Xing, J.M. , Gou, Z.X. , Li, S. , Liu, H.Z. , Chen, J.Y. (2003) Desulfurization of dibenzothiopheno by lyophilized cells of Pseudomonas delafieldii R8 in the presence of dodecane Biochemical Engineering Journal, 13:16. Artculo sobre las condiciones y capacidades para la desulfurizacin por parte de Pseudomonas delafieldii. Buenas grficas. Je Hwan Chang, Yong Keun Chang, Hee Wook Ryu, Ho Nam Chang (2000) Desulfurization of light gas oil in inmobilicedcell systems of Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 FEMS Microbiology Letters, 182:309312. Trabajo sobre la desulfurizacin llevada a cabo por ambas estirpes. Breve pero un poco complejo; grficas de difcil comprensin. Toshiki Furuya, Tohkaro Kirimura, Kuniki Kuno, Shoji Usami (2001) Thermophilic biodesulfurization of dibenzothiophene and its derivated by Mycobacterium phlei WUF1 FEMS Microbiology Letters, 204:129133. Artculo sobre la biodesulfurizacin de este organismo. Claro y conciso. Tohkaro Kirimura, Toshiki Furuya, Yasuhiro Nishii, Yoshitaka Ishii, Kuniki Kino, Shoji Usami (2001) Biodesulfurization of dibenzothiophene and its derivated through the selective cleavage of carbonsulfur bonds by a moderately thermophilic bacterium Bacillus subtilis WUS2B Journal of 9

Bioscience and Bioengineering, 92,3:262266. Analiza el proceso de desulfurizacin en un organismo tan caracterizado como Bacillus subtilis. Algo escaso en grficas. Toshimitsu Onaka, Jin Konishi, Yoshitaka Ishii, Kenji Maruhashi (2001) Desulfurization characteristics of thermophilic Paenibacillus sp. Strain A112 against asymmetrically alkylated dibenzothiophenes Journal of Bioscience and Bioengineering, 92,2:193196. En este caso se estudia la actividad en desulfurizacin por parte del organismo termfilo Paenibacillus. Interesante. Jin Konishi, Yoshitaka Ishii, Toshimitsu Onaka, Yoshinori Ohta, Masanori Suzuki, Kenji Maruhashi (2000) Purification and characterization of dibenzothiophene sulfone monooxygenase and FMNdependent NADH oxidoreductase from the thermophilic bacterium Paenibacillus sp. strain A112 Journal of Bioscience and Bioengineering, 90,6:607613. Artculo en el que se estudian enzimas fundamentaales en el proceso de biodesulfurizacin. Bastante claro y con magnficas imgenes. Maghsoudi, S. , Kheirolomoom, A. , Vossoughi, M. , Tanaka, E. , Katoh, S. (2000) Selective desulfurization of dibenzothiophene by newly isolated Corynebacterium sp. strain P32C1 Biochemical Engineering Journal, 5:1116. Trata el proceso en otro organismo ms. Breve y claro.

10