TRABAJO PRÁCTICO III:
Cinética Enzimática
Grupo 2
Alumnos
● Azcue, Juan Martín
● Butti, Ezequiel
Objetivos
● Conocer cómo se puede estudiar la cinética básica de una enzima
y cómo se calculan sus parámetros Michaelianos.
● Estudiar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la cinética de una
enzima.
Introducción
Las enzimas Michaelianas son aquellas con cinética hiperbólica. Al
graficar velocidad inicial V0 en función de concentración de sustrato S
para una cierta concentración de enzima, la curva que se forma sigue la
ecuación:
𝑉𝑚𝑎𝑥 . [𝑆]
𝑉0 = 𝐾𝑀 + [𝑆]
(1)
¿Qué significa cada término?
La velocidad inicial se refiere a la velocidad en el momento exacto en el
que mezclo enzima y sustrato. Se tiene en cuenta que la concentración
de sustrato es aproximadamente la misma que se agregó inicialmente.
En la grafica hiperbolica, a medida que aumenta el sustrato, la función
presenta comportamiento asintótico. A ese valor, en el que aumentar la
concentración de sustrato ya no mejora la velocidad, se lo llama
velocidad máxima Vmax.
Además, se define KM como la concentración inicial de sustrato a la que
se registra la mitad de la velocidad máxima.
Para estudiar la cinética de una enzima es importante conocer los
parámetros de la función. Estos pueden ser obtenidos a partir de, por
ejemplo, la función doble recíproca de Lineweaver-Burk, una
linealización de la ecuación (1):
1 1 𝐾𝑀 1
𝑉0
= 𝑉𝑚𝑎𝑥
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥
. [𝑆]
(2)
Variando sustrato para cada velocidad inicial (conociendo ambos),
graficando las inversas y haciendo una regresión lineal, pueden
𝐾𝑀 1
despejarse pendiente ( ) y ordenada al origen ( ).
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥
La concentración de sustrato es fácil de determinar, ya que uno mismo
la agrega. En cambio, V0 se obtiene a partir de otra regresión lineal. Si
graficamos concentración de producto P en función del tiempo para una
cierta concentración de enzima y sustrato (conocidas), obtenemos un
gráfico aproximadamente hiperbólico. Estas curvas tienen la
particularidad de ser aproximadamente lineales al principio. Sabemos
que la velocidad se define como:
𝑑[𝑃]
𝑑𝑡
(3)
La pendiente en este rango temporal será igual a la velocidad inicial.
Ahora bien, la enzima se trató en condiciones óptimas, pero puede estar
inhibida. Para estos casos, la concentración de inhibidor I y su constante
de equilibrio asociada Ki deben ser consideradas en el planteo de la
ecuación (1). Dependiendo de la naturaleza del inhibidor y su
interacción con la enzima, el efecto que produzca modificara los
parámetros aparentes de la enzima, pudiendo variar los KM y/o Vmax que
se obtienen a partir de la doble recíproca.
Metodología
Primera parte
Utilizando el simulador se obtuvo una serie de datos de cantidad de
producto en función del tiempo a partir de la selección de concentración
de sustrato. Se eligieron distintas concentraciones de sustrato a partir
de lo que se obtuvieron varias series de datos, las cuales fueron
graficadas en la figura 1.
Figura 1: Producto en función del tiempo para distintas concentraciones de sustrato. Las rectas
observadas corresponden a la regresión lineal aplicada a cada concentración de sustrato, lo cual da
una idea del rango de linealidad.
A partir de la figura 1, se eligió t=11 minutos para realizar lo que sigue en el
procedimiento ya que es un buen tiempo para todas las concentraciones debido a
que se encuentra en el rango lineal.
Segunda parte
Utilizando un tiempo de corrida de 11 minutos, se corrió el experimento para
conseguir la doble recíproca.
Figura 2: Doble recíproca para una concentración inicial de sustrato de [0,2] M. En azul claro se ve la
regresión lineal.
A partir de los parámetros de la recta se obtuvo:
𝐾𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
= 7. 19398 𝑛𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝐾𝑀 = 𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
= 0. 13165 𝑀
Luego se realizó el mismo experimento añadiendo inhibidor A en una concentración
de 0,1 M. Se gráfico comparando esta situación con la anterior.
Figura 3: Comparación entre las dobles recíprocas para concentración de sustrato inicial de 0,2 M.
Se prolongan las rectas hasta la intersección con el eje x.
A simple vista puede verse la variación en la pendiente. Realizando los cálculos
sobre los parámetros de la recta se obtuvo:
𝑉𝑚𝑎𝑥´ = 7. 518796992 𝑛𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑀´ = 0. 2654135338𝑀
Se realizó el mismo análisis gráfico para diferentes concentraciones del inhibidor A y
concentraciones iniciales de sustrato de 0,2 M.
Figura 4: Gráfica de Lineweaver-Burk para diferentes concentraciones de inhibidor.
A partir de las regresiones lineales, se obtuvo la pendiente y se utilizó dicho valor
para realizar un nuevo gráfico, comparando la pendiente de la regresión con la
concentración de inhibidor utilizada.
Figura 5: Relación entre las pendientes obtenidas en el análisis de la figura 4 y sus concentraciones
de inhibidor respectivas.
La raíz de la regresión lineal de la figura 6 se relaciona con Ki siguiendo la ecuación:
−𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 |
𝐾𝑖 = || 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 | = 0, 15167
Conclusión
Si bien para realizar este trabajo práctico se utilizó un simulador, se pueden observar en las
distintas figuras la teoría de un sistema michaeliano de sustrato único, con una cantidad de
enzima fija, vista en las distintas clases. En la primera parte se observó que a medida que
aumenta la concentración de sustrato, aumenta la Vo. Además, se comprobaron los rangos
2
de linealidad a partir de regresiones lineales con 𝑅 altos. Se observaron las distintas
velocidades máximas para distintas [S].
Luego se calculó Vm a partir del método de linealización de Lineweaver-Burk, a partir de la
curva de Michaelis-Menten de V vs S.
En la figura 3 el Km es lo único que varía en los distintos sistemas propuestos (con y sin
inhibidor), ya que la intersección con el eje y es igual para ambas rectas. Esta es una
característica de la inhibición reversible competitiva. En la figura 4 se observa que a medida
que aumenta la concentración del inhibidor, aumenta Km.
El valor de 𝐾𝑖 es bajo, lo que significa que la enzima posee una alta afinidad por el inhibidor.
TP HÚMEDO
ALA 10 Ac. B-me
Ala(mM mM levulinic Ac.Lev 5 200nM Enzima Buffer
Tubos ) (mL) o (mM) mM(ml) (mL) (ml) (mL) A555 A555-B
1 0.05 0.005 0 0 0.1 0.1 0.795 0.263 0.255
2 0.1 0.01 0 0 0.1 0.1 0.79 0.272 0.264
3 0.25 0.025 0 0 0.1 0.1 0.775 0.474 0.466
4 0.5 0.05 0 0 0.1 0.1 0.75 0.505 0.497
5 0.75 0.075 0 0 0.1 0.1 0.725 0.492 0.484
6 1 0.1 0 0 0.1 0.1 0.7 0.624 0.616
7 3 0.3 0 0 0.1 0.1 0.5 0.657 0.649
8 0.05 0.005 0.25 0.05 0.1 0.1 0.745 0.101 0.093
9 0.1 0.01 0.25 0.05 0.1 0.1 0.74 0.235 0.227
10 0.25 0.025 0.25 0.05 0.1 0.1 0.725 0.358 0.350
11 0.5 0.05 0.25 0.05 0.1 0.1 0.7 0.45 0.442
12 0.75 0.075 0.25 0.05 0.1 0.1 0.675 0.332 0.324
13 1 0.1 0.25 0.05 0.1 0.1 0.65 0.303 0.295
14 3 0.3 0.25 0.05 0.1 0.1 0.45 0.334 0.326
Tabla 1: Protocolo para la segunda parte.
Figura 6: UE equivalente a V0 en función de la concentración de ALA (nM). Puede verse que
es una enzima de cinética Michaelianas.
Figura 7: 1/UE vs 1/[ALA]
Cálculos de parámetros cinéticos:
Sin inhibidor
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
= 44, 843 𝑛𝑚𝑜𝑙/ℎ
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝐾𝑚 = 𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
= 73. 273, 542 𝑛𝑚𝑜𝑙
Con inhibidor
𝑉𝑚𝑎𝑥´ = 36, 4963 𝑛𝑚𝑜𝑙/ℎ
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝐾𝑚´ = 𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
= 180036, 4963 𝑛𝑚𝑜𝑙
Cálculo de Ki
[𝐼]
𝐾𝑚´ = 𝐾𝑚 . (1 + 𝐾𝑖
)
𝐾𝑚 . [𝐼]
𝐾𝑖 = 𝐾𝑚´−𝐾𝑚
= 0, 17157 𝑚𝑚𝑜𝑙
Puede decirse que el inhibidor es de tipo COMPETITIVO, ya que varía
significativamente el Km, pero el Vmax no. Aunque realmente si lo hace, puede
deberse a errores de medición.
Donde el blanco:
[ALA]
Tubos
(mM) A555
B enzima 0 0.008
Se determinará la formación enzimática de PBG para siete
concentraciones de sustrato, luego de 30 min de incubación.
En la curva de calibración con una solución estándar de PBG se obtuvo
una pendiente igual a 113.6 ml/mg. Como las unidades de pendiente no
incluyen cm-1 referentes al paso óptico, se estima que la ecuación de la
curva de calibración es:
𝐴𝑏𝑠 = 113, 6 𝑚𝑙/𝑚𝑔 . [𝑃𝐺𝐵]
1 UE= 1 nmol PBG/h
Conclusión
A partir del análisis de los datos se puede observar como disminuye la
actividad de la ALA-D a medida que se incrementa la concentración de
ácido levulínico.Este funciona como inhibidor ya que posee una
estructura similar a la del sustrato, el ácido δ- amino levulínico. El
inhibidor es competitivo, es decir, se une al sitio activo e impide la unión
de este al sustrato.
