Guia (1)

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA DE CS. DE LA NUTRICIÓN
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PATOLOGÍA
GUÍA DE PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA
Docentes:
Dra. Blanca R. Mayorca P.
Mg. Daniel Valdivia M.
Mg. Jorge Ballón E.
Dr. José Fernández R.
Dra. Irmia Paz Torres
Dr. Ricardo León V.
Mg. Fernando Segovia
Alumna(o):
2023
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Complete el nombre de las partes del Microscopio

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NORMAS GENERALES Y RECOMENDACIONES PARA EL DESARROLLO DE

LAS PRÁCTICAS
1. La asistencia a prácticas es obligatoria, si falta a alguna de ellas, no tendrá la

oportunidad de recuperarla ni dar el Quiz y su nota será 0.
2. El uso del mandil es indispensable para realizar la práctica, debe estar limpio y
marcado con su nombre o llevar una placa para la identificación del alumno.
Además, es obligatorio el uso de máscara, gorro y guantes para el trabajo
dentro del laboratorio, para protegerse de cualquier contaminación.
3. El estudiante debe ser puntual y traerá consigo su material de trabajo
necesario: Guía de prácticas, lápices de colores. En forma individual o por
grupo, deben tener en cada mesa, un lápiz de cera para marcar en vidrio, una
caja de fósforos o encendedor, un lienzo pequeño (“campo”), para limpiar
láminas, toalla y jabón para lavarse las manos después de realizar su trabajo.
4. Deberán guardar sus pertenencias (libros, cuadernos, mochilas, bolsos, ropa)
en los roperos que tienen en cada lado de las mesas de trabajo, para que no
se contaminen y constituyan luego un peligro para usted o su familia.
5. Está prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
6. Manipular el material de trabajo con cuidado. Si ocurre algún accidente
(volcadura de un fluido o contacto directo con un espécimen contaminado) u
otro incidente, informar inmediatamente al profesor.
7. Tener cuidado al manipular los mecheros a gas o alcohol, encenderlos antes
de colocarse los guantes de goma (látex), puede ocasionar un accidente.
8. Maneje los microscopios con cuidado. Si no los está usando, apague las
lámparas (focos); su tiempo de “vida” es corto.
9. Para observar las láminas con el objetivo de inmersión (100x) utilizar sólo una
pequeña gota de aceite de cedro (de inmersión). NO ES NECESARIO “bañar”
la lámina en el aceite.
10. El asa bacteriológica o de Kolle, debe esterilizarse a la llama antes y después
de cada contacto con el material contaminado. Flamearla en posición vertical o
inclinada, formando un ángulo de 45°, evitar la proyección de partículas sobre
la mesa.
11. El material usado: Bajalenguas, torundas, etc. que estén contaminados, NO
deben dejarse sobre la mesa, depositarlos en los recipientes
correspondientes; así también los trozos de papel, algodón o palos de
fósforos, NO arrojarlos a los lavatorios, hacerlo en los depósitos para basura.
12. Todo material roto o extraviado, durante la práctica, será de responsabilidad

de todos los integrantes del grupo (mesa).
13. Al concluir la práctica: Dejar las láminas utilizadas fuera del microscopio, en un
lugar para ser descartadas; las preparadas por la Cátedra, NO mezclarlas con
las anteriores, colocarlas separadas o en las gradillas portaláminas
14. Lea cuidadosamente la guía de prácticas; realice los esquemas, anote sus
observaciones, resuelva el cuestionario correspondiente.
15. Lavarse SIEMPRE las manos antes de abandonar la sala de prácticas.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE MEDICINA
SECCIÓN MICROBIOLOGÍA
ESCUELA DE CS. DE LA NUTRICIÓN
PRACTICA N°1
MICROSCOPIA
EXAMEN EN FRESCO
1. Introducción:
Las bacterias son seres microscópicos, cuyo tamaño oscila entre los 3 a 5
micrómetros (), no pueden ser observados a simple vista, son incoloras, pero
algunas poseen flagelos que les permiten movilizarse. Esta propiedad es
importante para diferenciarlas y clasificarlas de acuerdo a ello.
Para observarlas requerimos de un instrumento muy importante que es el

microscopio óptico o de luz, que facilita su observación porque aumenta su tamaño
en cientos de veces. Este instrumento fue ideado por un investigador danés Sir
Antonie Van Leeuwenhoek en el año 1674, consiste en un sistema de lentes que se
superponen unos a otros y ha ido perfeccionándose, el M/O puede aumentar el
tamaño de los objetos hasta más de mil veces. Existen otros tipos de microscopios,
como el electrónico, el de contraste de fases, de luz UV, etc. con otras
características y otras funciones.
Con relación al microscopio óptico sus componentes y fundamento, ha sido motivo
de cursos anteriores (Biología, Histología u otros), por lo que los profesores de
cada grupo evaluarán a los alumnos al respecto para recordar algunos conceptos.
2. Objetivos:
Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:
- Recordar puntualmente y reforzar conceptos sobre microscopia óptica

adquiridos anteriormente.
- Reconocer algunos materiales o instrumentos que deberá usar en lo sucesivo
- Realizar el preparado de una muestra en fresco para ver bacterias.
- Observar la movilidad de bacterias vivas y otros elementos que suelen
acompañarlas en una muestra de sedimento urinario.
- Reconocer su morfología, calcular y comparar su tamaño con otros elementos
3. Materiales:
- Láminas portaobjetos
- Láminas cubreobjetos
- Muestra de sedimento de orina
- Muestra de agua estancada o de florero
- Mechero Bunsen o de alcohol
- Pipetas de plástico o pipetas Pasteur
- Asa bacteriológica
- Microscopio óptico
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4. Procedimiento
1. Estando con los guantes calzados y otros implementos de protección en

uso, tomar una lámina portaobjeto (p.o), por los bordes; colocar con la pipeta
de plástico una o dos gotas del sedimento de orina (hacer lo mismo con el
agua estancada), en el centro de la lámina, con cuidado tomar una laminilla
cubreobjeto (c.o) y colocarla sobre la gota, formando un ángulo de 45° y
dejarla caer, evitando la formación de burbujas.
2. Colocar la lámina con el preparado en la platina del microscopio.
3. Enfocar la lámina empezando con el objetivo panorámico e ir cambiando a
los de mayor aumento, llegar SÓLO HASTA EL OBJETIVO SECO DE 40x,
¡PROHIBIDO! tocar la lámina con el objetivo de inmersión.
4. Observar la morfología y el movimiento de las bacterias, ubicar otros
elementos y comparar su tamaño.
5. Informe y Registro:
1. Revisar y describir las características de otros tipos de microscopios
2. Calcular cuántas veces está aumentado el tamaño de las bacterias que ve

Respuesta:
En el sedimento: ...........................................................................................
En el agua estancada: ..................................................................................
3. Hacer un esquema de lo observado. PONER NOMBRE A TODO LO QUE

DIBUJE, esto también es VÁLIDO para TODAS las prácticas siguientes, aún
sean fotografías de los experimentos, deben poner nombres. ¡OJO!
EXAMEN EN FRESCO
Agua estancada Sedimento urinario
Aumento: 40x Aumento: 40x
BRMP/
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ESC. DE CS. DE LA NUTRICIÓN
PRACTICA N° 2
CARACTERES MORFOESTRUCTURALES DE LAS BACTERIAS
Coloraciones: AZUL DE METILENO

GRAM
1. Introducción: Las bacterias tienen tres formas básicas: cocos, bacilos y

espirilos. Su tamaño es variable, pero el rango de sus dimensiones está en el
orden de los micrómetros m (“micras”), es por eso que deben ser observadas
con ayuda del microscopio. Todas las bacterias son incoloras y deben ser
teñidas para poder observar su morfología y su agrupación. En algunos casos
se utilizan coloraciones especiales porque muchas de ellas presentan
características especiales en su pared celular o para poder observar algunas
de sus estructuras como esporas, cápsula, flagelos, etc.
Existen dos tipos de coloraciones:
Simples: Utilizan un colorante y se realiza en un solo tiempo, ejemplo: Azul de

Metileno.
Compuestas: Utilizan dos o más colorantes y se realizan en varios tiempos,

ejemplo: Gram, Ziehl-Neelsen, Wirtz-Coklin.
Coloración de Azul de Metileno: Es una coloración simple y sirve para

observar la morfología y agrupaciones de bacterias solamente.
Coloración de Gram: Fue ideada por el científico danés, Christian Gram en

1884; es una coloración compuesta y a la vez diferencial, la más importante en
bacteriología, que clasifica a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, fundamentalmente por la composición de su pared celular.
2. Objetivos: Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
- Diferenciar una coloración simple de una compuesta.

- Dada una muestra problema, (líquida o sólida), de productos patológicos o
de cultivos, o cualquier otra, preparar correctamente un frotis o extendido.
- Realizar en forma ordenada y completa los pasos de la coloración de Azul
de metileno y de Gram.
- Utilizando el microscopio reconocer la forma y los diferentes tipos de
agrupación de las bacterias coloreadas por ellos mismos y las
proporcionadas por la cátedra.
- Reconocer y diferenciar una bacteria Gram positiva de una Gram negativa.
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3. Materiales:
Para todas las coloraciones:

- Aceite de inmersión
Coloración de Azul de metileno y Gram:
- Suspensión de bacterias en un caldo de cultivo.

- Placa de Petri con cultivo de bacterias.
- Láminas portaobjetos limpias.
- Asa bacteriológica o de Kolle.
- Mechero de alcohol o Bunsen (de gas).
- Varillas de vidrio para soporte de láminas.
- Colorante de Azul de metileno al 1%.
- Batería para coloración de Gram.
- Gradilla
- Láminas coloreadas de stock
4. Procedimiento:
Preparación de un frotis o extendido, para todos los casos:
1. Utilizar una lámina portaobjetos limpia y sin grasa, para ello utilizar su
campo de franela y cogerla por los bordes para no mancharla, si es
necesario, pasarla por el mechero.
2. Marcarla con un lápiz de cera en uno de sus extremos para identificarla.
3. Si se trata de una muestra líquida o un caldo, tomar una gota con el asa de
Kolle, previamente esterilizada y extenderla en el centro de la lámina, en un
área aproximada de 1-2 cm de diámetro; los frotis no deben ser ni muy
gruesos, ni muy delgados. Si se trata de un cultivo o una muestra
semisólida, se colocará previamente una gota de agua destilada o de caño
en la lámina p.o, luego tomar una pequeña porción de la muestra o de la
colonia a examinar (sólo tocarla), emulsionarla en el líquido y extenderla de
igual forma que la anterior; dejar que seque al medio ambiente, NO
calentar al mechero.
4. Fijar el frotis al calor suave, pasándolo por la llama del mechero una o dos
veces. Probar que no esté muy caliente con el dorso de la mano.
5. Colocarlo en el soporte para ser coloreado sobre el lavatorio.
Coloración de AZUL DE METILENO:
- Cubrir el frotis con la solución acuosa de Azul de metileno al 1%, durante 2

minutos.
- Lavar con agua corriente de caño y dejar secar.
- Observar con el objetivo de inmersión (100x).
Lectura: Tanto las bacterias como otros elementos del frotis se observan de
color azul celeste.
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Coloración de GRAM:
- Cubrir el frotis con Violeta de genciana (solución acuosa al 1%), dejar

actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.
- Cubrir con lugol durante 2 minutos. Lavar.
- Decolorar con alcohol al 95% durante 20 a 30 segundos
aproximadamente. Lavar.
- Teñir con safranina (solución acuosa al 0,75%) durante 30 a 40 segundos.
Lavar.
- Dejar secar y observar con el objetivo de inmersión.
Lectura: Las Gram positivas se observan de color violeta o azul y las Gram
negativas de color rojo.
AZUL DE METILENO GRAM
Medio líquido / Medio sólido Medio líquido / Medio sólido
5. Informe y registro:
Realizar todos los procedimientos de la práctica; en su guía, realizar los

esquemas y anotar todo lo observado.
Investigue y ponga ejemplos (nombres científicos) de 4 bacterias Gram

positivas y de 4 Gram negativas
Gram positivas: Gram negativas
1. .................................................... 1. .................................................
2. .................................................... 2. .................................................
3. .................................................... 3. .................................................
4. .................................................... 4. .................................................
BRMP/
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PRACTICA N° 3
Coloraciones especiales: ZIEHL - NEELSEN (B.A.A.R)

WIRTZ - CONKLIN (Endosporas)
Baciloscopia: Tinción de láminas de esputo con ZIEHL-NEELSEN
1. Introducción
Mycobacterium tuberculosis, bacilo fino, muy delgado, aerobio estricto, no se tiñe

con Gram, es difícil de teñirlo, para hacerlo se utiliza una coloración especial:
Ziehl-Neelsen, pero una vez teñido es difícil decolorarlo con una mezcla de
alcohol-ácido, es por eso que se les conoce como Bacilos Alcohol Acido
Resistentes (B.A.A.R); crece muy lentamente, su tiempo de generación es de 12
a 18 horas; crece en medios de cultivo especiales, contienen yema y albúmina de
huevo, almidón o fécula de papa, como el de Lowestein-Jensen o el Ogawa que
contiene asparragina; forma colonias a las 3 semanas de incubación, éstas son
secas y duras, de color crema, difíciles de disgregar. Resisten a los ácidos y
álcalis, son sensibles a las R.U.V.
Es el agente etiológico de la tuberculosis pulmonar, la forma más frecuente de la
enfermedad; a partir de aquí se disemina a otros órganos y puede reactivarse
cuando los mecanismos defensivos están venidos a menos como consecuencia
de una desnutrición, crecimiento rápido o una enfermedad anergizante
(sarampión p.e), dando las llamadas formas extra pulmonares.
Los síntomas más característicos son: tos seca al inicio que luego se hace
productiva con expectoración mucopurulenta y es crónica, por más de 15 días.
Bacterias esporuladas: Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium son

capaces de formar endosporas y sobrevivir ante las condiciones adversas que se
presentan en su medio, como son la falta de humedad (sequedad), altas
temperaturas (calor), falta de nutrientes y otras situaciones difíciles que podrían
destruirlas, pero sufren un proceso de esporulación que les permite continuar
viables en un estado de latencia, pudiendo vivir así durante miles de años.
Cuando encuentran nuevamente condiciones adecuadas, vuelven a reproducirse
adoptando la forma vegetativa y así pueden mantenerse por mucho tiempo.
Coloración de Ziehl-Neelsen: Es una coloración compuesta que sirve para teñir

Bacilos Alcohol Acido Resistentes (B.A.A.R), como el bacilo que produce la
tuberculosis; esta característica es debida a la gran cantidad de lípidos que
presenta su pared celular y no se tiñen fácilmente con la coloración de Gram y
una vez teñidas con la fucsina, se resisten a ser decoloradas.
Coloración de Wirtz Conklin: es una coloración especial para teñir endosporas de

bacterias. Existen dos géneros de bacterias que esporulan cuando no encuentran
las condiciones adecuadas para su desarrollo y son: Bacillus (aerobios) y
Clostridium (anaerobios).
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2. Objetivos
- Realizar en forma correcta la coloración de Ziehl-Neelsen y la de Wirtz

Conklin. Hacer la lectura correcta de los frotis en ambos casos.
- Explicar en forma breve y concisa, de qué tipo son y para qué se utilizan las
coloraciones de Ziehl-Neelsen y Wirtz Conklin.
- Aplicar el método bacteriológico a una muestra de esputo para el diagnóstico
de tuberculosis pulmonar
- Practicar las medidas de bioseguridad para el manejo de algunas muestras.
3. Material
Coloración de Ziehl-Neelsen:
- Láminas con frotises de muestras patológicas (esputo) ya preparadas.

- Colorante de Ziehl-Neelsen (fucsina fenicada).
- Alcohol ácido (alcohol al 95% + ác. clorhídrico 3%)
- Colorante de Azul de metileno al 1%
- Láminas coloreadas de BK de stock
Coloración de Wirtz Conklin:
- Placas Petri con cultivo de Bacillus subtillis en agar tryptosa.

- Láminas portaobjeto limpias
- Solución acuosa de verde de malaquita.
- Solución acuosa de Safranina al 0,75%
Para ambas
- Asa de Kolle
- Mechero Bunsen o de alcohol
4. Procedimiento
Para el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar, debe tomarse una muestra de

esputo o secreción bronquial, la primera de la mañana, en un frasco limpio de
boca ancha, no necesariamente estéril, el paciente debe previamente enjuagarse
la boca y luego de un esfuerzo de tos, eliminar la secreción en el frasco y llevarla
al laboratorio lo antes posible.
Debe prepararse un frotis del esputo con ayuda de un palito que luego será
descartado en el frasco desinfectante, el frotis no debe ser muy delgado ni muy
grueso, debe abarcar las 2/3 partes de la lámina p.o. NO fijarla al calor.
Para seguridad de los alumnos, las láminas se les proporcionarán ya listas para
colorear y se procederá a realizar la coloración de Ziehl-Neelsen como se
describe a continuación:
Coloración de Ziehl-Neelsen:
- Colocar la lámina en el soporte sobre el lavatorio.

- Cubrir TODA la lámina con el colorante de Ziehl.
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- Con el mechero de alcohol, aplicar calor por debajo de la lámina hasta la

emisión de vapores blancos; retirar el fuego; calentar el p.o. nuevamente.
Repetir esta operación en forma intermitente durante 5 minutos. No dejar que
hierva ni que se seque, restituir el colorante si fuera necesario. Enfriar y
eliminar el colorante.
- Lavar la lámina con agua corriente.
- Decolorar con alcohol ácido hasta que quede con un tenue color rosado.
- Lavar nuevamente con agua corriente.
- Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto. Lavar.
- Dejar secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Lectura: Los B.A.A.R se ven de color rojo brillante y los demás elementos que
hay en el frotis (células, bacterias, etc.,) se ven de color azul celeste.
Coloración de Wirtz Conklin:
Observar los caracteres culturales del cultivo de Bacillus subtilis, Preparar un

frotis según la técnica ya conocida y realizar la coloración de Wirtz Conklin de
acuerdo al protocolo que se detalla a continuación:
Observar además las láminas coloreadas proporcionadas por la Cátedra.
- Cubrir TODA la lámina con la solución acuosa de Verde de malaquita al 5%.

- Calentar con el mechero hasta la emisión de vapores blancos en forma
intermitente durante 5 minutos, restituyendo el colorante si es necesario, no
dejar que se seque.
- Lavar con agua corriente.
- Cubrir el frotis con solución acuosa de safranina al 0,75% durante 1 minuto.
- Lavar nuevamente
- Observar con el objetivo de inmersión.
Lectura: Las esporas se observan de color verde y el cuerpo bacteriano

(bacilo) de color rojo.
Anotar sus observaciones y realizar los esquemas de lo que observó al M/O con
objetivo de inmersión en su guía.
Observación microscópica: Observe y realice los esquemas correspondientes
BRMP/
12
PRÁCTICA N° 3
COLORACIÓN DE ZIEHL - NEELSEN
Muestra de esputo Lámina de stock

100x 100x
COLORACIÓN DE WIRTZ COKLIN
Muestra: Cultivo de Bacillus subtilis Lámina de stock

100x 100x
BRMP/
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PRACTICA N° 4
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
1. Introducción: El control de los microorganismos es muy importante no sólo en

microbiología si no en la industria y control de calidad de alimentos y tiene los
siguientes FINES:
1. Prevenir la transmisión de la infección y enfermedades entre hombres,

animales y plantas.
2. Prevenir la contaminación y descomposición de los alimentos
3. Evitar la interferencia de m.o contaminantes en procesos industriales:
producción de alimentos (lácteos, bebidas gasificadas, licores, conservas,
embutidos, etc.), industria farmacéutica.
4. Prevenir la contaminación de materiales usados en el laboratorio de
diagnóstico o investigación
2. Objetivos:
- Reconocer, enumerar y describir los diferentes métodos para el control de

microorganismos.
ESTERILIZACIÓN
Según el reglamento de Enfermedades Transmisibles de los Estados Unidos

"esterilizar", es la destrucción completa o la separación total de los
microorganismos patógenos y saprofitos que se encuentran en el interior o en la
superficie de objetos y substancias.
Los procedimientos de esterilización y/o control de microorganismos, se
clasifican en: Métodos Físicos y Métodos Químicos.
METODOS FISICOS:
I. Esterilización por el calor: La acción esterilizante del calor depende más
que nada de las condiciones en que actúa: Intensidad, tiempo, humedad y
sobre todo susceptibilidad especial de cada microorganismo.
1. Esterilización por calor seco:

a) Esterilización por llama directa: Produce la carbonización de !os
microorganismos y sus esporas ; se le usa para esterilizar el asa de
platino (asa de Ko!!e), boca de tubos, matraces, pipetas, etc. utilizando la
!lama de gas producida por un mechero.
b) Esterilización por aire caliente: (Estufa de esterilización, horno).
El calor actúa como aire caliente a la temperatura de 165 – 180ºC
durante media hora. Sirve para esterilizar objetos sólidos, resistentes al
14
calor, como cristalería, porcelana, instrumentos de metal etc., aplicando

la conocida Estufa de Esterilización; cuyo esquema se encuentra a
continuación
2. Esterilización por calor húmedo:
a) Esterilización por ebullición: Utilizando agua en ebullición. No

elimina las esporas. Se aplica en la esterilización limitada de algún
instrumental de cirugía menor, pinzas, tijeras, etc. (NO
RECOMENDABLE).
b) Esterilización por vapor fluente: (Thyndalización). Consiste en un
calentamiento por vapor de agua discontinuo) a 80 – 100ºC, y
refrigerando después, por tres veces con intervalos de 24 horas.
Elimina gérmenes y esporas, Sirve para esterilizar medios que se
descomponen por el calor a más de 80 – 100ºC como: Carbohidratos,
gelatina, leche, suero, etc. Suprime la hidrólisis por calentamiento.
c) Esterilización por vapor de agua a presión: (Autoclave). Es el
método ideal para el campo bacteriológico. Se basa en que el vapor de
agua a presión es más caliente que el agua en ebullición o el vapor
libre. Cuánto más alta es la presión del vapor, mayor es la temperatura
resultante. El vapor penetra por ósmosis provocando la coagulación del
protoplasma en las bacterias y esporas.
Las condiciones de esterilización son: 121ºC a 15 libras de presión
por pulgada cuadrada por un tiempo de 15 minutos, utilizando el
aparato llamado "Autoclave" cuyo esquema se encuentra a
continuación. En él se esterilizan objetos y substancias que resisten
temperaturas mayores a 100ºC, tales como: Medios de Cultivo en
general, solución salina, agua destilada. Sirve también para esterilizar
material desechable como: Cultivos usados, medios contaminados, etc.
II. Esterilización por filtración: Este método se basa en fenómenos físico-

químicos, entre los microorganismos en suspensión y un cuerpo poroso
(filtro) semipermeable; así se separan gérmenes y micelas orgánicas de los
líquidos que las contienen. Se emplea para eliminación de bacterias de
sueros, líquido ascítico, extractos de hígado, etc. La filtración en
Bacteriología se efectúa en aparatos llamados "filtros", cuya parte principal
es un elemento poroso (porcelana, tierra de infusorios, asbesto, etc.). Los
líquidos filtrados deben atravesar por presión o aspiración porosidades de
diverso diámetro. Al tratar de pasar los gérmenes son retenidos por
adsorción.
Los filtros usados son aquellos cuyo elemento poroso tiene la forma de bujía
o de disco: Bujías de Chamberland, Bekerfield, Mandler y discos filtros de
Seitz.
III. Esterilización por radiación: Los rayos ultravioleta del espectro de una
longitud de onda comprendida entre 200 y 265 nm. poseen un alto poder
germicida, sin embargo escaso poder de penetración; su acción se ejerce
sobre la superficie de los cuerpos expuestos a la radiación, por ello se usan
poco en la esterilización de laboratorio. Su empleo es mayor en el campo de
la Medicina e higiene para esterilizar instrumental, aire, suelo, paredes, etc.,
destrucción de gérmenes y virus en las gotitas de flugge, etc.
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IV. Esterilización por centrifugación: Este método separa gérmenes del

líquido en que se encuentran suspendidos, no es seguro y sólo se le emplea
como procedimiento previo de clarificación en la esterilización y la ultra
centrifugación para purificación y concentración de virus.
METODOS QUIMICOS:
I. Esterilización por agentes químicos: En este procedimiento la muerte de

Ios gérmenes se consigue por substancias químicas que actúan coagulando
el protoplasma o interfiriendo el metabolismo bacteriano.
Algunos desjnfectantes y antisépticos de mayor uso: Desde el punto de vista

práctico se les agrupa en:
a) Halógenos y compuestos halogenados: F, Cl, Br, I.
b) Fenol y derivados.
c) Alcoholes: Etílico 40 a 70%. Isopropílico
d) Colorantes: Violeta de genciana, azul de metileno, verde de malaquita.
e) Sales de metales pesados: Nitrato de plata, bicloruro de mercurio, sulfato
de cobre
f) Ácidos y álcalis: Ácido clorhídrico (creso), ácido sulfúrico, hidróxido de Na
g) Detergentes aniónicos, catiónicos y compuestos amónicos cuaternarios.
h) Quimioesterilizadores. Gases microbicidas.
3. Materiales y procedimiento
Los equipos usados en el laboratorio serán observados en su lugar o presentados

en la sala de prácticas
4. Informe y registro: Realizar los procedimientos de la práctica. Revisar

bibliografía al respecto para completar el logro de los objetivos, en especial sobre
antisepsia y desinfección.
BRMP/
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PRACTICA N° 5
LABORATORIO DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS
LABORATORIO DE VIRUS: Virus de la Rabia. Rotavirus
1. Introducción
Los hongos filamentosos contaminantes, son microorganismos multicelulares,

saprofitos que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, tierra,
vegetales, agua, alimentos, excretas, etc. Algunos son frecuentemente
contaminantes de laboratorio y otros son importantes como productores de
antibióticos, u otros productos en la industria, tenemos por ejemplo a Penicillium,
Aspergillus, y Rhizopus.
Algunas especies están relacionadas con enfermedades del oído, bronquios y

pulmones, como las de los géneros Aspergillus y Mucor
Por otro lado, las levaduras, pertenecen al orden de los Eumicetos, son
unicelulares y existen los que forman parte de la flora normal de nuestro
organismo, como Candida albicans, que se encuentra en el tracto digestivo, tracto
genital y piel o puede comportarse como un patógeno oportunista, en personas con
inmunodeficiencias y produce las llamadas candidiasis, oral, vaginal etc.
Penicllium:
Es el hongo más común entre todos los contaminantes del laboratorio y el medio
ambiente, lo cual de tenerse en cuenta en la preparación y conservación de los
alimentos.
Se desarrollan en agar Sabouraud entre 4 a 6 días y crecen bien entre 4 y 45° C.

Inicialmente es una colonia blanca que se torna verde azulada o verde amarillo al
fructificar; pero existen especies de otros colores. La superficie es aterciopelada o
lanosa, estriada o lisa con reverso incoloro a amrillento, conidióforo hialino de
pared lisa o rugosa, simples o ramificados.
Aspergillus níger:
Conocido también como contaminante frecuente en el medio ambiente, es también
agente causal de enfermedad en pacientes debilitados (otitis, oftalmitis,
aspergillosis pulmonar invasiva, etc.)
Las colonias presentan aspecto lanoso de color blanco o amarillo en el comienzo y
posteriormente de color negro. El reverso de la colonia es de color blanco o
amarillo. Los conidióforos tienen forma radiada, las vesículas son globosas o
subglobosas. Las fiálides nacen sobre métulas hialinas.
Rhyzopus:
Suele encontrarse también contaminando alimentos de ahí su nombre, “hongo del
pan”. Es un hongo invasor, en el cultivo el micelio aéreo es de crecimiento rápido,
algodonoso, inicialmente blanco, que va ennegreciendo en forma paulatina, por la
maduración de los esporangios. El reverso de la colonia es incoloro.
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Cultivo: Los hongos filamentosos desarrollan bien en agar maltosado o glucosado

de Sabouraud, a temperatura ambiente y en la oscuridad.
Levaduras:
Candida albicans es la especie más frecuente encontrada en la flora normal del
hombre, existen otros géneros importantes en la industria alimentaria, como
Sacharomyces cerevisiae, que es usado en la producción de la mayor parte de
bebidas fermentadas, cerveza, vino, chicha de diferentes tipos, etc.
Cultivo:
Se emplea también el medio agar Sabouraud. Una vez obtenida la muestra se
pone una pequeña porción en un extremo del agar, luego con el asa de siembra
dispersarla en toda la placa. Se incuba a 37° C por 24 a 48 horas.
2. Objetivos
o Observar y reconocer cultivos de hongos filamentosos contaminantes
o Preparar y colorear una muestra de dichos hongos con Azul de lactofenol
o Observar y reconocer los caracteres de cultivos de levaduras
o Preparar y colorear una muestra de estos cultivos y teñirlos con Gram
o Observar frotis de levaduras coloreadas con Gram
3. Materiales
- Placas de cultivo con hongos contaminantes

- Placas con cultivo de Candida albicans y Sacharomyces cerevisiae
- Laminillas cubreobjetos
- Escuadra y asa de Kolle
- Mechero Bunsen, encendedor
- Colorante azul de lactofenol
- Batería para coloración de Gram
- Láminas de levaduras coloreadas con Gram
4. Procedimiento
- Observar los caracteres culturales de los cultivos de hongos contaminantes.

- Tener cuidado de NO VOLTEAR LAS PLACAS NI DEJARLAS DESTAPADAS.
- Preparar un montaje del cultivo de hongos contaminantes para lo cual se seguirán
los siguientes pasos: Colocar en una lámina p.o dos gotas del colorante azul de
lactofenol. Cortar con la escuadra de Kolle esterilizada previamente en el mechero,
un trozo pequeño de agar con cultivo de los hongos y colocarlo sobre el colorante,
colocar una laminilla cubreobjetos; pasar la lámina por el mechero al calor suave
para derretir el agar y presionar con el mango de la escuadra para que se haga
más delgado.
- Observar al microscopio con objetivo de 40x. Hacer esquemas.
- Preparar frotis de levaduras como si fueran de bacterias y colorearlos con Gram
- Observar éstos al microscopio con objetivo de inmersión 100x
- Observar las láminas proporcionadas por la cátedra también con objetivo de mayor
aumento y hacer los esquemas correspondientes
5. Informe y registro
18
HONGOS FILAMENTOSOS COTAMINANTES
Coloración de Azul de lactofenol
Penicillium sp Aspergillus sp
40x 40x
Rhizopus sp
40x
HONGOS LEVADURIFORMES
Coloración Gram Coloración Gram

Candida albicans Sacharomyces cerevisiae
100x 100x
BRMP/
19
Virus de la rabia
La rabia es la zoonosis viral más antigua conocida, cuya importancia radica en una
letalidad cercana al 100%. El virus pertenece a la familia Rhabdoviridae, género
Lyssavirus tipo 1, tiene forma de bala, mide 130 a 240 por 65 a 80nm, su genoma
posee una sola cadena de RNA, su envoltura está constituida por una capa de
lípidos cuya superficie contiene cinco proteínas estructurales. La rabia se transmite
a través de la mordedura o contacto directo de mucosas o heridas con la saliva de
animales infectados; también se ha documentado su transmisión por transplante de
córnea de un donante muerto infectado y no diagnosticado, o por aerosoles en
cuevas donde habitan y hay heces de murciélagos, también puede ser transmitido
en personal de laboratorio durante el trabajo en forma accidental.
Los corpúsculos de inclusión llamados corpúsculos de Negri, contienen unidades

infectivas de virus y otros elementos celulares, son cuerpos esféricos, ovalados o
alargados, eosinofílicos, con 2 a 10 micrómetros de diámetro; se encuentran en las
células piramidales del hipocampo y en las células de Purkinge del cerebelo.
1. Objetivos
- Identificar corpúsculos de Negri en láminas preparadas por la cátedra
2. Materiales
- Láminas de stock de improntas cerebrales coloreadas con Seller y Mallory

- Aceite de inmersión
3. Procedimiento
- Observar las láminas de los corpúsculos de Negri coloreadas por la cátedra

- Hacer los esquemas correspondientes en su guía de prácticas
CORPÚSCULOS DE NEGRI
COLORACIÓN DE SELLER COLORACIÓN DE MALLORY

100x 100x
BRMP/
20
Prueba rápida para Rotavirus (Demostrativa)
1. Introducción
Las EDAs son causadas también por virus, uno de ellos es el Rotavirus, que
afecta a lactantes y niños pequeños con más frecuencia, hasta los 2 años; el
período de diarrea puede llevar al infante a una desnutrición aguda, que en
algunos casos es difícil de recuperar.
En nuestros laboratorios locales, de mediana complejidad es posible hacer

pruebas de diagnóstico rápido usando la Inmunocromatografía, que es una de las
técnicas más modernas, cuyas principales ventajas son la sencillez y la rapidez
del test. Cada vez son más las aplicaciones de esta técnica y también en el
campo agroalimentario como test de campo, debido a que no es necesario
reactivos ni instrumentación adicional. (1Tomado de la guía de prácticas de Inmunología
2015 del Departamento de Microbiología y Patología, Sección Microbiología e Inmunología de la
Facultad de Medicina de la UNSA)
Resultados de la prueba
1.
2. Objetivo
Realizar una prueba rápida diagnóstica de Rotavirus
3. Materiales
1.1 Dispositivos o tiras reactivas de inmunocromatografía para Rotavirus
1.2 Muestra de heces de lactante o niño
1.3 Pipetas Pasteur
4. Procedimiento
4.1 Leer bien el inserto de la prueba que vamos a realizar y seguir las
instrucciones respectivas
4.2 Hacer la lectura de las tiras reactivas.
4.3 Comparar resultados
21

PRACTICA N° 7
METODO BACTERIOLOGICO I: Obtención de muestras.

Cultivo. Técnicas de siembra.
1. Introducción:
El método bacteriológico comprende una secuencia ordenada de pasos con la

finalidad de llegar a la identificación de un microorganismo a partir de una muestra
problema que puede ser por ejemplo de agua, de alimentos, (leche, carne de
diferentes especies: vacuno, pollo, pescado, etc. o platos preparados), muestras
patológicas (orina, heces, sangre, esputo, secreciones).
Esta secuencia puede ser representada en forma de flujograma o diagrama de

flujo, que es aplicable a la generalidad de muestras y que variará de acuerdo al
tipo de muestra y es el siguiente:
OBTENCION DE MUESTRA
Coloración de Gram (opcional)
CULTIVO EN MEDIO ADECUADO
Incubación a 37°C por 18 a 24 horas
OBSERVACION DE CARACTERES CULTURALES
CULTIVO PARA IDENTIFICACION BIOQUIMICA
Incubación a 37°C por 18 a 24 horas
LECTURA Y DIAGNOSTICO
INFORME FINAL
22
2. Objetivos:
Al término de la práctica el alumno será capaz de:
- Enunciar y explicar cuál es la característica más importante de una muestra.

- Reconocer el material adecuado para obtener muestras de diferentes tipos.
- Obtener correctamente una muestra de cualquier tipo, sea de productos
patológicos, de alimentos o cualquier otra.
- Realizar en forma correcta el cultivo de diferentes tipos de muestra,
teniendo en cuenta las medidas de asepsia y bioseguridad.
1. Obtención de muestra:
Es el primer paso del Método bacteriológico (M.B) y uno de los más

importantes ya que de éste depende que logremos aislar e identificar las
bacterias que se encuentren en una muestra.
La muestra, como su nombre lo dice constituye una parte de todo el conjunto

de material que está causando el problema, motivo de nuestro estudio, que
puede ser la orina de un paciente con infección del tracto urinario (ITU), las
heces de un niño con diarrea, la secreción del oído de un lactante o de una
herida de la mano de un cocinero y así tantos otros ejemplos que podemos
mencionar. Entonces la característica más importante que debe tener es que
debe ser REPRESENTATIVA, es decir que sea tomada de un lugar adecuado,
la cantidad suficiente, además debe ser obtenida en condiciones estériles o de
asepsia rigurosa, en el recipiente o medio de transporte adecuado y ser
transportada en el menor tiempo al laboratorio para su procesamiento. Todas
estas medidas serán necesarias para garantizar el éxito de nuestro propósito.
2. Cultivo y aislamiento:
En la mayoría de casos el paso siguiente del M.B es el cultivo, éste se hace en

un medio adecuado (agar o caldo), pero dependiendo de la muestra que estemos
procesando, se deben realizar otros procedimientos previos al cultivo, el examen
del sedimento por ejemplo como en el caso del urocultivo o en forma opcional
otros, como la coloración de Gram.
La finalidad de cultivar o sembrar una muestra es conseguir que los

microorganismos que se encuentran en ella se multipliquen y formen colonias en
los medios semisólidos o desarrollen en un caldo según sea el caso.
PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS: Una vez que una muestra para cultivo ha sido recibida,
deben tomarse las siguientes decisiones clave para recuperar e identificar los microorganismos
que puedan estar presentes:
1. Seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de muestra en particular.

2. Determinar la temperatura y la atmósfera de incubación, para recuperar todos los
microorganismos potencialmente significativos
3. Determinar cuál de los aislamientos recuperados en el medio primario requiere una
caracterización posterior
4. Determinar si se requieren pruebas de susceptibilidad ante microbianos, una vez que se ha
identificado al organismo.
23
Para ello debemos aprender algunas técnicas de siembra:
a) Siembra en medio líquido (caldo)

b) Siembra en medio sólido (agar)
- En tubo . Por puntura

. Estrías en superficie
- En placa . Por agotamiento

. Por dispersión: *En cuadrantes
*En toda la placa
TÉCNICAS PARA EL CULTIVO DE MUESTRAS :

La inoculación primaria puede ser realizada con un asa o un hisopo. A continuación el inóculo es
estriado en cada cuadrante con un movimiento de adelante hacia atrás, girando la placa en ángulo
de 90º. La finalidad de esta técnica es diluir suficientemente el inóculo en la superficie del medio
agarizado, de manera que se puedan obtener colonias de bacterias bien aisladas, denominadas
unidades formadoras de colonias (UFC).
Método por Agotamiento:

El inóculo se coloca sobre una pequeña zona cualquiera del agar en un extremo. Trazar
líneas paralelas por toda la superficie de la placa hasta agotamiento total de la siembra
en el asa. Incubar en la estufa a 37º C por 24 horas.
(Ver esquema en técnicas para cultivo de muestras)
Método por Dispersión:

Con el asa cargada de material, colocar el inóculo en un extremo de la placa y hacer
estrías paralelas. Esterilizar el asa sin tomar nuevo inóculo, trazar otra serie de estrías
rotando la placa en ángulo de 90º empezando desde la última estría, repetir esta
operación.
(Ver esquema en técnicas para cultivo de muestras)
Inoculación Agotamiento Dispersión
El medio en los tubos puede ser líquido, semisólido (agar del 0.3 al 0.5%) o sólido (agar 1 al 2%).
El agar semisólido es conveniente para las pruebas de movilidad. Los caldos de cultivo en un tubo
pueden ser inoculados por el método siguiente:
24
Punto de
inoculación
Los picos de flauta de medio agarizado se inoculan primero por una punción en profundidad del
agar, seguido por un estriado del pico de flauta desde el fondo a la parte superior con un
movimiento en S a medida que se retira el asa.
A B
3. Materiales:
- Mechero Bunsen
- Asa de Kolle
- Tubo de prueba con torunda estéril
- Bajalenguas
- Frascos estériles de boca ancha
- Muestra de heces en medio de Cary Blair
- Pinza metálica
- Placa de agar Desoxicolato citrato (D.C)
4. Procedimiento:
Obtención de muestra
Los alumnos harán una lectura previa sobre el tema en su guía y además será
explicado por su profesor de práctica.
Tomar nota de lo explicado y realizar la obtención de muestra de secreción

faríngea de uno de sus compañeros, sembrarla en la placa de agar sangre.
25
Sembrar la muestra de heces en los medios de cultivo respectivos.

Rotular las placas con el número de su mesa y llevarlas a la incubadora.
Mostramos aquí un esquema, (flujograma de cómo se procesa una muestra de

heces, para un coprocultivo)
COPROCULTIVO
Obtención de la muestra
(Transporte en Cary Blair)
Siembra en Agar D.C Siembra en caldo Selenito
Incubación a 37º C, 24 horas
Observación de caracteres culturales
Siembra en medios para identificación Siembra en Agar S,S

Bioquímica (T.S.I, L.I.A, Indol) (Salmonella-Shigella)
Incubación a 37° C, 24 horas
Lectura de Pbs. Bioquímicas Crecimiento
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO No Sí
Pbs. Bioquímicas
Incubación
Lectura
DIAGNÓSTICO FINAL
BRMP/brmp
26

PRACTICA N° 8
MÉTODO BACTERIOLÓGICO II: Observación de caracteres culturales

Siembra para pruebas bioquímicas
1. Introducción:
La secuencia del método bacteriológico en esta segunda parte, luego del período de
Incubación por el tiempo adecuado, comprende la observación de los caracteres
culturales de las bacterias, es decir, cómo han desarrollado en el medio de cultivo
(agar) formando colonias, tomando algunos parámetros de referencia para
diferenciarlos de otros.
Una vez caracterizados, muchas veces no es posible dar un diagnóstico, porque

algunas bacterias son parecidas entre ellas y es necesario recurrir a otras pruebas
más sutiles que permitan diferenciarlas con más precisión y se tienen que hacer
pruebas metabólicas, de tipo bioquímico y es lo que haremos a continuación e
inclusive pueden hacerse pruebas inmunológicas o de tipificación por bacteriófagos,
esto más que todo con fines de investigación.
En algunos casos debe continuarse con el método e implica la siembra en otros

medios de reaislamiento a partir de medios de enriquecimiento como el caldo
Selenito del coprocultivo.
2. Objetivos:
- Observar, reconocer, diferenciar y enumerar todos los caracteres culturales de

las bacterias sembradas anteriormente.
- Dar ejemplos de las bacterias de acuerdo con sus caracteres culturales.
- Hacer la siembra para el reaislamiento de los cultivos que sean necesarios,
(coprocultivo)
- Sembrar en medios de cultivo para pruebas de identificación bioquímica.
3. Materiales
- Mechero Bunsen
- Placas con cultivos de la práctica anterior.
- Estereoscopio
- Tubos con caldo Selenito sembrados anteriormente
- Asa y aguja de Kolle
- Agar SS (Salmonella-shigella)
- Tripletes con medios de cultivo para pruebas bioquímicas (T.S.I, L.I.A y caldo
peptonado para la prueba de Indol).
4. Procedimiento:
A) Reconocimiento de caracteres culturales:

27
INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOS: La interpretación de los cultivos primarios se realiza

luego de una incubación de 24 a 48 horas evaluando el crecimiento de las colonias para decidir
si son necesarios procedimientos adicionales. Esta valoración es realizada anotando las
características y el numero relativo de cada tipo de colonia recuperada en el medio agarizado,
reacción frente a la coloración de Gram y morfología de las bacterias en cada tipo de colonia, y
por la observación de los cambios en el medio que rodea a la colonia, el cual refleja las
actividades metabólicas específicas de las bacterias recuperadas.
Características Culturales más Notorias: Las placas de cultivo estándar son de 100mm de
diámetro y se pueden sostener en una mano para observar la superficie del agar y detectar el
crecimiento bacteriano. Durante el examen las placas deben ser viradas en distintas
direcciones bajo una iluminación brillante y directa, de modo que la luz se refleje desde
distintos ángulos. Las placas de agar sangre también deben ser examinadas por
transiluminación de una luz brillante desde detrás de la placa, para detectar las reacciones
hemolíticas en el agar.
De acuerdo si fue urocultivo o coprocultivo, lo que correspondió realizar, tome la

placa sembrada y cerca al mechero y si es posible con ayuda de un estereoscopio
observe las colonias que hayan quedado completamente aisladas, verifique si son
de un sólo tipo o de varios; en todo caso anote las siguientes características:
1. Tamaño: Es variable, pequeñas desde colonias puntiformes hasta varios

milímetros, 5 a 7 mm. o más; en algunos casos, depende si están
aglomeradas en un solo lugar.
2. Forma: Puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide, festoneada, etc.
3. Color: Dependerá si se debe a la producción de un pigmento característico

de la bacteria, por ejemplo de color amarillo dorado de Staphylococcus
aureus, o verde azulado de Pseudomona aeruginosa, a diferencia de un
color adoptado a partir del medio de cultivo, debido al efecto sobre el mismo,
ejemplo las enterobacterias fermentadoras de lactosa toman un color rosado
debido al indicador de pH (rojo neutro) contenido en el agar MacConkey o en
el D.C (Desoxicolato citrato)
4. Borde: Entero, ondulado, lobulado, filamentoso, rizoide.
5. Elevación: Plana, convexa, acuminada, crateriforme, umbilicada.
6. Superficie: Lisa, rugosa, mate, brillante, húmeda, seca.
7. Aspecto: Opaco, transparente.
8. Consistencia: Cremosa, pastosa, viscosa, mucoide, seca, compacta,

membranosa.
9. Hemólisis: Sólo se observará si el medio de cultivo es agar sangre y puede

ser de tres tipos: parcial (alfa), total (beta) o ausente (gama).
10. Los olores producidos por la acción de ciertas bacterias en medio de agar y
en medio líquido pueden ser muy útiles para la identificación tentativa de los
microorganismos involucrados.
Compare las características culturales de los cultivos que le tocó procesar en su

mesa de trabajo.
28
Las siguientes ilustraciones nos ayudan a describir algunas características de las

colonias:
CARACTERES CULTURALES
Plana
Puntiforme Entero
Elevada
Circular Ondulado
Filamentosa Umbilicada
Filamentoso
Rizoide Lacerado Convexa
Irregular Enrulado Acuminada
Forma Borde Elevación
Luego de esta evaluación, si se trata de bacterias entéricas, debe procederse a la

identificación bioquímica, para lo cual debe elegirse una colonia representativa y
que esté aislada completamente, marcarla encerrándola en un círculo para
proceder a la siembra de la siguiente manera:
B) Inoculación del T.S.I, L.I.A, y caldo peptonado:
1. Siempre trabajar frente al mechero encendido; marcar los tubos para su

identificación, tomar la aguja de Kolle, esterilizarla, esperar un momento o
enfriarla en una parte del agar de la placa donde no haya cultivo, picar
(tocar) la colonia elegida, sólo en la superficie, no tocar el fondo.
2. Tomar el tubo de TSI, con cuidado introducir la aguja por el centro hasta
unos milímetros antes del fondo, no tocarlo; retirar por el mismo lugar y al
salir estriar en zigzag en la superficie inclinada.
3. Sin esterilizar la aguja, es decir con el mismo inóculo introducirla en el medio

LIA, pero en tres puntos diferentes, como formando un triángulo, retirar con
cuidado y estriar también en la superficie.
4. Finalmente inocular lo queda en el caldo peptonado.
5. Llevar a la incubadora a 37°C durante 18 a 24 horas, luego proceder a la

lectura con la ayuda de las tablas para este fin e interpretar los resultados.
29
C) Siembra en agar S.S a partir del caldo selenito:
1. Marcar la placa de agar S.S
2. Esterilizar el asa bacteriológica, enfriar y tomar una gota del caldo selenito
previamente incubado y sembrar por dispersión en cuadrantes en el agar
S.S.
3. Colocarlo en la incubadora a 37°C durante 18 a 24 horas.
4. Transcurrido este tiempo observar los caracteres culturales de las nuevas

colonias y si es necesario realizar nuevas pruebas de identificación
bioquímica
Realice los frotis, coloree con Gram y esquematice las bacterias encontradas en
las colonias de las placas de agar.
COLORACION DE GRAM
Agar sangre Agar McConkey o DC

100x 100x
BRMP/
30

PRACTICA N° 8
MÉTODO BACTERIOLÓGICO II (Continuación)
 Observación de las propiedades metabólicas de las enterobacterias

(Pruebas bioquímicas)
 Prueba de sensibilidad antimicrobiana: ANTIBIOGRAMA
1. Introducción:
Las bacterias tienen la capacidad de metabolizar una serie de sustratos, lo que nos
va a permitir diferenciarlas. Las enterobacterias son un modelo que usaremos para
ejemplificar este fenómeno tan importante, como veremos a continuación.
T.S.I (Triple azúcar hierro) Se observará la degradación de los carbohidratos:

glucosa, sacarosa o lactosa, que van a producir ácido y ocurre un cambio de pH
que el indicador rojo de fenol hace que vire a color amarillo en el medio y se
simboliza como A (ácido), si no hay fermentación quedará de color rojo que se
simboliza como K (alcalino). También debe observarse la producción de gas (CO 2)
a partir de la glucosa que se verá como burbujas o espacios en medio del agar,
pueden desplazar todo el medio, la cantidad se calificará con cruces, si no se
produce será negativo. Por último, se observará la producción de H2S (ácido
sulfhídrico) por el metabolismo de algunas bacterias que reducen el tiosulfato de
Na, produciendo una coloración negruzca en medio del agar por la formación de
sulfuro de Fe que sí es posible observar, si no hay es negativo y si existe se califica
la cantidad con cruces.
L.I.A (Agar Lisina hierro) La lisina es una aminoácido que puede ser
descarboxilado, desaminado o no sufrir ningún efecto por las enterobacterias
La descarboxilación se observará de color violeta por el indicador de pH, púrpura
de bromocresol que intensifica el color inicial del medio, se simboliza como K/K; la
desaminación se observará con un cambio de color amarillo en el fondo y rojo
vinoso en el bisel se simboliza como R/A, las cepas de Proteus y Providencia son
las representativas de esta reacción. Algunas como la Shigella, no descarboxilan ni
desaminan la lisina, el color se observa amarillo en el fondo y violeta en el bisel, se
simboliza como K/A. Algunas bacterias pueden producir H2S que aparecerá como
una coloración negruzca ene el tubo, no se simboliza.
Indol La degradación del aminoácido triptofano por las bacterias que poseen la
enzima triptofanasa será evidenciada por la producción de indol que es una
sustancia volátil, para lo cual será necesario añadir unas gotas del reactivo de
Kovac por las paredes del tubo, se producirá una respuesta casi instantánea
formándose un anillo rojo grosella en la superficie del caldo, si es positivo y si no,
se formará un anillo amarillo o anaranjado, que se interpreta como negativo.
Finalmente realizaremos la prueba de sensibilidad frente a antibióticos, esto es una

vez aislado un microorganismo es necesario averiguar con qué droga eliminarlo del
organismo cuando se trata de un patógeno específicamente.
2. Objetivos:
31
- Realizar la lectura e interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas.

- Describir la metodología para realizar la prueba de sensibilidad a antibióticos:
Antibiograma.
- Realizar la lectura e interpretación de un antibiograma.
3. Materiales:
- Mechero Bunsen
- Tripletes con medios de cultivo para pruebas bioquímicas (T.S.I, L.I.A y caldo
peptonado para la prueba de Indol).
- Reactivo de Kovac para la prueba de Indol
- Asa y aguja bacteriológicas
- Tubo con 0.5 mL de caldo peptonado para Antibiograma.

- Hisopo largo de algodón estéril
- Agar Mueller Hinton o tryptosa
4. Procedimiento:
Lectura de las pruebas bioquímicas en T.S.I, L.I.A e Indol en caldo peptonado, para
ello se añadirá unas gotas del reactivo de Kovac, se observarán los cambios
ocurridos en los tubos y serán comparados con las tablas respectivas, haciendo la
identificación final de las enterobacterias más representativas.
Prueba de sensibilidad a antibióticos: ANTIBIOGRAMA:

Utilizaremos el método de Kirby-Bauer, que consiste en lo siguiente:
Una vez identificadas las bacterias, tomar la placa y con el asa previamente
esterilizada y enfriada, hacer un barrido de varias colonias (4 ó 5), inocular en los
0,5 mL de caldo simple o peptonado, homogenizarlas hasta formar una emulsión
que sea comparable con el tubo 0,5 de la Escala de McFarland.
Con un hisopo tomar un inóculo, escurriendo el exceso en las paredes del tubo y
sembrarlo con el mismo hisopo en forma uniforme, dispersándolo en toda la
superficie de la placa de agar triptosa o Mueller Hinton.
Esperar unos minutos para que seque la superficie o colocar la placa semi abierta
en la incubadora, luego con una pinza esterilizada y enfriada cada vez, colocar los
discos de papel filtro que contienen los antibióticos de diferente tipo y
concentración. La elección de los discos será de acuerdo al tipo de bacteria
aislada, sea una Gram + o una Gram -.
Llevar la placa a incubación por 18 a 24 horas a 37°C.
La lectura del antibiograma se hace teniendo en cuenta el efecto que han tenido los
antibióticos sobre el crecimiento bacteriano.
Lo que se observará será la formación de un halo de inhibición, cuyo diámetro

debe ser medido para compararlo con las tablas que existen, pero en líneas
generales se puede considerar tres tipos de respuestas:
SENSIBLE : Halo de inhibición de 15 a 20 mm o más.

32
INTERMEDIO : de 10 a 15 mm
RESISTENTE : < de 10 mm
Conclusión: La observación de estas reacciones producidas por las bacterias en el

laboratorio nos permite llegar a un diagnóstico definitivo, de género y especie con
una precisión de casi 100% quedando en algunos casos por confirmar el mismo
con otras reacciones o pruebas complementarias.
Observar los resultados y realizar los esquemas de las bacterias identificadas,

poner los símbolos o fórmulas correspondientes.
TSI LIA INDOL CITRATO

1. Escherichia coli
2. Shigella sp
3. Salmonella typhi
4. Proteus ..................
ESQUEMATICE RESULTADOS
DEL ANTIBIOGRAMA
TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
EN TSI, LIA E INDOL
GRUPO I HIDROGENO SULFURADO (H2S) POSITIVOS GRUPO II HIDROGENO SULFURADO (H2S) NEGATIVOS
ANAEROGENICOS (GAS NEGATIVO) ANAEROGENICOS (GAS NEGATIVO)
TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA
K/A – +/- ó + K/K – Salmonella typhi K/A – – K/A - ó + Shigella
AEROGENICOS (GAS POSITIVO) A/A ó K/A – – K/K ó K/N + Escherichia
TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA A/A ó K/A – – K/A - ó + Enterobacter
K/A 2+ 4+ K/K – Salmonella A/A – – K/K – Serratia
K/A ó A/A 2+ 4+ K/K – Arizona K/A – – R/A + Proteus
K/A ó A/A 2+ 4+ K/A – Citrobacter K/A – – R/A + Providencia
K/A ó A/A 2+ 4+ R/A - ó + Proteus A/A – – A/A ó K/A - ó + Yersinia
K/A 2+ 4+ K/K + Enwardsiella AEROGENICOS (GAS POSITIVO)
TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA
A/A ó K/A 2+ – K/K ó K/A + Escherichia
K = alcalino A/A 4+ – K/K - ó + Klebsiella
A = ácido A/A ó K/A 3+ – K/K ó K/A – Enterobacter
R = rojo K/A ó A/A 2+ – K/K – Serratia
N = neutro K/A (+) – K/A ó R/A + Proteus
K/A + – K/A ó A/A – Paratyphi A
33
34
35

PRACTICA N° 9
LABORATORIO DE COCOS GAM +

Observación de cultivos y de láminas coloreadas de estafilococos
1. Introducción
Las vías respiratorias superiores albergan bacterias Gram positivas:

Streptococcus viridans, Staphylococcus epidermidis (albus) y Gram negativas
Moraxella catarrhalis, que constituyen la flora normal de este lugar; cumple una
función protectora evitando la invasión de otras bacterias patógenas. En un buen
porcentaje, algunas personas pueden contener una flora transitoria conformada
por Streptococcus pneumoniae (neumococo), o Staphylococcus aureus que son
patógenos, sin presentar ningún síntoma llamándolos portadores “sanos” o
asintomáticos, importante si son manipuladores de alimentos.
Staphylococcus aureus: son cocos Gram positivos agrupados en racimos,

producen beta hemólisis en agar sangre, fermentan el manitol salado y son
coagulasa y catalasa positivos. Son los patógenos más resistentes a las
condiciones adversas entre las bacterias no esporuladas. Son causa
principalmente de infecciones de piel, heridas y quemaduras, también producen
osteomielitis (infección de los huesos) y menos frecuentemente septicemia y
neumonía que son muy graves. Pueden transmitirse por los alimentos y causar
una intoxicación, debida a la toxina que produce cuando desarrolla en medios que
contienen proteínas y carbohidratos.
2. Objetivos
- Reconocer y diferenciar las características culturales, morfológicas y tintoriales

de estafilococos patógenos y no patógenos.
- Realizar algunas pruebas adicionales para su identificación: catalasa,
coagulasa.
- Observar láminas coloradas con Gram proporcionadas por la cátedra.
3. Materiales
- Placas de agar sangre y de agar estafilococo con cultivo de Staphylococcus

epidermidis y Staphylococcus aureus
- Tubos de prueba con plasma de conejo diluido
- Frasco con agua oxigenada
- Asa bacteriológica (Kolle)
- Láminas porta objetos
- Láminas coloreadas de estafilococos
36
4. Procedimiento
Se observarán las características culturales de las colonias de los cultivos

presentados de los dos tipos de estafilococos reconociendo y diferenciando sus
características, tanto de los patógenos como de los no patógenos.
En una lámina p.o realizarán frotis de cada cultivo, numerándolos para

reconocerlos y los teñirán con Gram, para luego observarlos al microscopio y
hacer los esquemas correspondientes.
Observarlos y discutir en grupo para reafirmar los conceptos sobre estas

bacterias.
Revisar bibliografía sobre las propiedades de estas bacterias, las enfermedades

que producen, sus consecuencias y fundamentalmente las medidas de
prevención.
Realizar los esquemas correspondientes en su guía, anotar sus observaciones.
COLORACION DE GRAM
Agar sangre Agar estafilococo

100X 100X
BRMP/brmp
37

PRÁCTICA N° 10
LABORATORIO DE ENTEROBACTERIAS Y VIBRIO
1. Introducción
La familia Enterobacteriaceae comprende más de 20 géneros y aproximadamente

100 especies de bacterias que como su nombre lo dice, la mayoría de ellas son
habitantes normales del intestino del hombre y los animales. Como
características comunes a todas ellas tenemos que son bacilos Gram negativos
aerobios, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de ácido,
reducen los nitratos a nitritos y son oxidasa negativas.
Crecen en medios selectivos y diferenciales que contienen carbohidratos, sales

biliares e indicadores de pH, entre otros ingredientes, como el agar MacConkey
(M.C), Desoxicolato citrato (D.C), Eosina azul de metileno (EMB), donde forman
colonias circulares convexas de bordes definidos; algunas fermentan lactosa
adoptando un color rosado (Lactosa +), diferenciándose de las que no lo hacen,
que no se pigmentan (Lactosa -). También pueden crecer en agar sangre y
algunas son hemolíticas.
Para identificarlas se utilizan algunas pruebas bioquímicas que incluyen patrones

de fermentación de carbohidratos (glucosa, sacarosa, lactosa), donde se evalúa
además la producción de gas a partir de la glucosa y la producción de H2S, para
ello se utiliza el medio de T.S.I; por otro lado, puede evaluarse la descarboxilación
o desaminación de aminoácidos como la lisina, esto en medio L.I.A, finalmente la
producción de Indol a partir del triptofano, en caldo peptonado.
Es importante también considerar algunas características como la presencia de

cápsula, por ejemplo, es muy prominente en Klebsiella, en Enterobacter, pero en
otras especies es poco común; otra es la movilidad por la presencia de flagelos,
casi todas son móviles a excepción de Shigella y Klebsiella por ejemplo.
Escherichia coli es parte de la microbiota normal del intestino, pero cuando sale
de su habitat es la primera causa de Infecciones de Tracto Urinario (I.T.U),
seguido de otras como Klebsiella, Enterobacter, Proteus. Esto ocurre con más
frecuencia en mujeres por sus características anatómicas, pero también se
produce en varones, sobre todo niños si tienen malformaciones congénitas del
sistema urinario o en adultos de la tercera edad con problemas de agrandamiento
de la próstata (Hiperplasia Benigna, HBP) y son cateterizados.
Por otro lado, debe mencionarse la importancia de un grupo de bacterias

llamadas coliformes que junto a Escherichia coli, van a servir como indicadores de
contaminación fecal de alimentos y agua, como veremos más adelante en las
prácticas sobre aquéllos.
38
Existen dos especies patógenas intestinales importantes, las salmonellas, que

son causa de la Fiebre tifoidea, las “fiebres intestinales”, como también las
salmonellosis y las shigellas que causan la disentería bacilar (deposiciones con
moco y sangre), que son adquiridas a través del consumo de alimentos
contaminados con heces de personas enfermas, convalescientes o portadoras
asintomáticas como es el caso de Salmonella typhi, que se aloja en la vesícula.
Existen algunos serotipos de Escherichia coli que también son patógenos

intestinales como E. coli enterotoxigénica (ECET), E.coli enterohemorrágica
(ECEH), E. coli enteropatógena (ECEP) y E. coli enteroadherente (ECEAd) o
enteroagregativa, que son difíciles de diferenciar inclusive bioquímicamente, es
necesario realizar pruebas serológicas especiales.
Aunque no es una enterobacteria vamos a estudiar también a Vibrio cholerae, por

ser un patógeno intestinal importante. Es un bacilo curvo en forma de coma
(vibrio) Gram negativo, móvil, fermentador de glucosa, sacarosa y no de lactosa,
es oxidasa positiva, crece en medio de agar T.C.B.S (Tiosulfato Citrato Bilis
Sacarosa) donde forma colonias pequeñas amarillas, características.
Una prueba importante para su identificación es la “prueba de la cuerda” o del

“collar” y la prueba de la oxidasa, que es positiva para esta bacteria.
2. Objetivos
- Identificar enterobacterias por sus caracteres culturales y por las pruebas

bioquímicas específicamente para ellas.
- Identificar Vibrio cholerae por caracteres morfológicos, culturales y pruebas
bioquímicas, prueba de la cuerda y de oxidasa si está disponible.
- Reconocer los medios de cultivo que son utilizados en cada caso anterior.
3. Materiales
- Placas con agar M.C, con cultivos de enterobacterias Lactosa + y Lactosa –

para diferenciarlas
- Placas de agar TCBS con Vibrio cholerae si hay cepa disponible
- Tripletes de tubos de identificación bioquímica inoculados con las bacterias
entéricas más representativas (E.coli, Salmonella typhi, Shigella, Proteus).
- Reactivo de Kovac
- Desoxicolato al 0.5% para la prueba de la cuerda
- Asa y aguja de Kolle
- Pinza
4. Procedimiento
Cada profesor hará un repaso del método bacteriológico y hará que los alumnos
deduzcan cómo debe realizarse para cada una de las muestras a estudiar en esta
práctica: orina y heces, seguirán los pasos del flujograma adjunto.
Se observarán las características culturales de los dos tipos de enterobacterias

sembradas en agar M.C, lactosa positivas y lactosas negativas.
39
Se realizará una coloración de Gram de las dos enterobacterias para comparar

sus características morfológicas y tintoriales y para que adquieran más práctica
en la realización de esta coloración.
Se procederá a observar y hacer la lectura de los tubos para identificación

bioquímica, T.S.I, L.I.A y el caldo peptonado para la prueba de indol.
Los estudiantes recordarán la forma como se identifican las enterobacterias por

sus características bioquímicas (usar su tabla). Harán la lectura de los tripletes
que sembraron y los que se les presenten.
Anotar resultados y realizar esquemas de todo lo observado durante la práctica,

que será motivo de la evaluación.
❑ Observación Microscópica:
L+ L-
Cultivo enterobacterias Cultivo de Vibrio cholerae

Coloración Gram Coloración Gram
❑ Escribir las fórmulas y revisar los esquemas de las reacciones bioquímicas de los
diferentes tipos de enterobacterias, realizadas anteriormente.
TSI LIA INDOL CITRATO
Escherichia coli
1. Shigella sp
2. Salmonella typhi
3. Proteus ..................
4. Vibrio cholerae
5.
BRMP/
40

PRACTICA N° 12
MÉTODO BACTERIOLÓGICO PARA EL CONTROL DE AGUA
1. Introducción
El agua es elemento vital para el hombre y los demás seres vivos que habitan
nuestro planeta. Sólo un 3% de la masa acuática corresponde al agua dulce que es
la que consumimos por eso debemos preservarla y proveerla en las mejores
condiciones.
Existen varias fuentes de agua, la que discurre por los ríos, el agua en pozos o
estanques, el agua de la red pública o agua potable. Todas ellas pueden ser
analizadas y es posible aplicar el método bacteriológico a este tipo de muestras
para evaluar su calidad desde este punto de vista. Existen otros análisis desde el
punto de vista físico-químico que no corresponden a nuestro curso, pero que
también deben ser realizados e incluirse en los resultados.
2. Objetivos
- Realizar el examen bacteriológico de una muestra de agua

- Describir la forma de obtener una muestra de los diferentes tipos de agua que
hay (agua potable, agua de pozo, agua de río, etc.)
- Realizar los pasos del análisis cuantitativo y cualitativo de una muestra de agua
problema
- Interpretar los resultados obtenidos.
3. Materiales
Para la obtención de muestra
- Frasco estéril de boca ancha

- Mechero de alcohol
- Fósforos o encendedor
- Lápiz de cera para rotular
- Caja térmica para transportar la muestra
Para el análisis cuantitativo
- Mechero Bunsen
- Lápiz de cera, fósforo o encendedor
- Muestra de agua
- Tubos conteniendo 9 mL de agua destilada o de peptona al 01% para dilución
- Pipetas estériles de 1 mL
- Placas Petri estériles
- Balón o matraz conteniendo agar cuenta colonias (recuento) licuado a 40 -
42°C
41
Para el análisis cualitativo
- Mechero Bunsen
- Lápiz de cera, fósforos o encendedor
- Muestra de agua
- Gradilla y tres tripletes de tubos conteniendo 9 mL de caldo lactosado o Brilla,
cada tubo además debe contener un tubo de Durham en el fondo.
- Pipetas estériles de 10, 5 y 1 mL
4. Procedimiento
a) De agua de caño
1. Cerrar la llave herméticamente

2. Flamear la salida del caño con el mechero de alcohol
3. Abrir la llave totalmente y dejar salir todo el volumen posible durante 2´
4. Graduar la salida del agua hasta el grosor de un lápiz
5. Destapar el frasco sin tocar la boca del mismo con los dedos
6. Tomar el frasco por la base y recibir el agua hasta 2/3 del volumen de su
capacidad.
7. Tapar el frasco de inmediato para evitar ser contaminado.
8. Rotular consignando fecha, lugar, hora, temperatura aproximada al tomar la
muestra.
9. Llevarla al laboratorio en el menor tiempo posible para ser procesada. Si no
es posible, guardarla en refrigeración máximo hasta 2 horas. En caso no sea
posible por la distancia trasladarla en caja térmica.
b) De agua de pozo
1. Ubicar el pozo o estanque

2. Destapar con cuidado el frasco sin contaminarlo con los dedos
3. Tomar el frasco de la base e introducirlo en forma vertical hasta una
profundidad determinada que garantice su representatividad
4. Arrastrar el frasco horizontalmente hacia delante hasta llenarlo y extraerlo
5. Taparlo con cuidado de inmediato, evitando contaminarlo
6. Rotularlo consignando fecha, lugar, hora, temperatura aproximada.
7. Trasladar la muestra al laboratorio lo antes posible para ser procesada
c) De agua de río o acequia
1. Ubicar la fuente de agua (río, acequia), colocarse en la orilla, si es pequeño

o en una embarcación en el centro del mismo.
2. Destapar con cuidado el frasco sin contaminarlo con los dedos
3. Tomar el frasco de la base e introducirlo en forma vertical hasta una
profundidad determinada que garantice su representatividad
4. Colocarlo en contra de la corriente del agua hasta que se llene el frasco
5. Taparlo con cuidado evitando contaminarlo
6. Rotular el frasco con los datos ya referidos
7. Llevar la muestra al laboratorio de inmediato para procesarla
42
Los resultados dependerán de una adecuada toma de muestra y del tiempo que
demore en llegar al laboratorio para su procesamiento.
Procesamiento en el laboratorio
ANÁLISIS CUANTITATIVO
DETERMINACIÓN DE GÉRMENES MESÓFILOS AEROBIOS VIABLES

Método de Recuento Total en placas
Se realizará en varias etapas (días)
Primer día:
1. Agitar bien para homogenizar la muestra, pero con cuidado, unas 25 veces
2. Rotular los tubos, las pipetas, las placas, en el orden correspondiente
3. Medir un mL de la muestra y colocarlo dejándolo caer en el primer tubo, que
corresponderá a la dilución 10-1, no tocar el agua de la dilución.
4. Con otra pipeta homogenizar el contenido del primer tubo y medir un mL,
agregarlo dejando caer el agua de esta dilución al segundo tubo que será la
dilución 10-2.
5. Continuar así con las siguientes diluciones, hasta completar las deseadas,
que serán de acuerdo al grado de contaminación de la muestra, pueden ser
3, 5 o más diluciones, en sus correspondientes tubos. Tener cuidado de NO
contaminar ni confundir las pipetas.
6. Medir de cada una de las diluciones con su pipeta correspondiente una
alícuota de un mL y agregarlo a las placas estériles ya rotuladas.
7. A continuación agregar a cada una de las placas entre 15 a 18 mL de agar
cuenta colonias licuado y temperado a 42 - 44°C. Mezclar la muestra con el
agar haciendo movimientos suaves en forma de 8 sobre la mesa de trabajo,
más o menos unas 10 a 15 veces, cuidando de no volcar el agar fuera de la
placa o que se pegue en la tapa.
8. Esperar que enfríen e invertir las placas, rotular nuevamente por el reverso.
Llevar a la incubadora a 35 o 37°C durante 24 a 48 horas.
Segundo día
1. Observar el crecimiento y hacer el recuento de las unidades formadoras de

colonias (UFC) que desarrollaron dentro y sobre el agar.
2. Considerar únicamente las placas donde el crecimiento no sea menor de 30
ni mayor de 300 colonias, es decir entre 30 y 300 colonias o UFC.
3. Para facilitar el recuento puede dividirse la placa en cuadrantes o más
fracciones, contar las que hay y hacer un promedio y luego multiplicar por el
número de fracciones.
4. Cada cifra obtenida se multiplicará por el inverso de las diluciones para
obtener la cantidad por mL de muestra.
5. Esto se hará en cada una de las placas que fueron consideradas, luego se
sumarán y se sacará la media aritmética obteniéndose el resultado que será
el número de gérmenes mesófilos aerobios viables por mL de muestra de
agua en cuestión.
Ver esquema correspondiente

43
Recomendaciones:
Se trabajará en las más estrictas condiciones de asepsia, frente al mechero,

con guantes y material de trabajo estéril, tener cuidado al usar las pipetas de no
aspirar demasiado, puede contaminarse.
ANÁLISIS CUALITATIVO
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES

TOTALES
Método de Fermentación en tubos múltiples
Se realizará en varias etapas (días)
Primer día:
PRUEBA PRESUNTIVA
1. Rotular los tripletes de tubos en el orden correspondiente: 10, 1 y 0.1 mL

2. Agitar bien la muestra pero con cuidado, unas 25 veces para homogenizarla.
3. Medir 10 mL, 1 mL y 0.1 mL de la muestra con las pipetas respectivas y
agregarlos a cada uno de los tres tubos de los tres tripletes que contienen el
caldo lactosado o Brilla (Caldo lactosa verde brillante), en el orden
correspondiente.
4. Una vez terminada la medición, agitar la gradilla.
5. Incubar a 35 o 37°C durante 24 a 48 horas
Nota: en caso de no tener tubos con la capacidad mencionada se puede reducir

los volúmenes a la mitad, es decir, se tomarán 5, 0.5 y 0.05 mL de muestra de
agua.
Segundo día
PRUEBA CONFIRMATIVA
1. Observar los tubos a las 24 y 48 horas

2. Deberá tenerse en cuenta la formación de burbujas de gas que quedan
atrapadas en el tubito de Durham, muchas veces lo eleva y representa el
CO2 producido por la fermentación de la lactosa y el viraje de color de violeta
a amarillo por la producción de ácido por el mismo fenómeno, esto dado por
el indicador de pH, púrpura de bromocresol.
3. Los tubos que presenten acidez y gas, serán considerados como positivos
es decir confirman la presencia de gérmenes coliformes.
4. De los tubos positivos se tomará una asada (una gota con el asa de Kolle)
del caldo y se sembrarán por agotamiento en agar Eosina Azul de Metileno
(EMB)
5. Incubar a 35 – 37°C durante 24 horas
44
Tercer día
PRUEBA COMPLETA O COMPLEMENTARIA
1. Examinar detenidamente los caracteres culturales de las colonias formadas

en el agar EMB; podrán se típicas si presentan un color brillante verde
metálico, o atípicas si son de color rosado algunas pueden tener un punto
oscuro en el centro que se verá mejor por el anverso de la placa, ambas
corresponden a gérmenes coliformes, las típicas pueden corresponder a
Escherichia coli.
2. De los dos tipos de colonias seleccionar las que estén aisladas y sembrarlas
para su identificación bioquímica en TSI, LIA y caldo peptonado para la
prueba de Indol.
3. Incubar a 35 – 37°C durante 18 a 24 horas.
Cuarto día
1. Realizar la lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas utilizando su

tabla para tal fin.
2. Escribir el informe de los resultados finales
Ver esquema correspondiente
COLIFORMES TERMOTOLERANTES
Para determinar si los gérmenes coliformes son de origen fecal humano, se

sembrará una asada de cada tubo positivo en otra gradilla con tubos conteniendo
caldo lactosado o Brilla con tubos de Durham y se incubará a 44°C durante 24
horas, procediendo a la lectura de la misma manera que la de los coliformes
totales.
Si hay crecimiento se concluirá que son coliformes de origen fecal.
Investigar los valores considerados por el Código Sanitario o la entidad

correspondiente en este caso DIGESA Perú, como los permisibles para calificar
como APTOS a los diferentes tipos de agua, sobre todo el de consumo humano.
Proponer un trabajo de investigación que podría realizar para apoyar a la

comunidad respecto al control bacteriológico del agua, esto serviría para hacer la
Proyección social del curso en el futuro.
BRMP/
DETERMINACIÓN DE GÉRMENES MESÓFILOS AEROBIOS VIABLES
(RECUENTO TOTAL)
Incubar a 37ºC por 24-48 horas

LECTURA
A 40-42ºC (RECUENTO)
45
46
DETERMINACIÓN DEL N.M.P. DE GÉRMENES COLIFORMES TOTALES

Método: Fermentación en Tubos Múltiples
0.05 mL
0.5 mL
5 mL
Incubar
Fecha a 35ºC
Lugar
Hora por 24-48 horas
Temp.
MUESTRA
1º Prueba Presuntiva (1er. Día)
2º Prueba Confirmativa 3º Prueba Completa

(2º Día) (3er. Día)
De los tubos positivos TSI LIA INDOL
EMB
(representan acidez De las colonias típicas
y gas) sembrar una (verde metálico) o
asada del caldo en atípicas (rosadas) picar
agar E.M.B. por y sembrar para su
agotamiento identificación bioquímica
Incubar a 35ºC por Incubar a 37ºC por
24 horas 24 horas
47
CÓMPUTO DE RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
a. Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilución que contenga entre

30 y 300 colonias
b. Tomar la media aritmética de los 2 recuentos y multiplicarlos por el factor de
dilución.
Ejemplo: Dilución 10-2
Placa 1: 72 colonias x 10-2 = 7, 200
Placa 2: 77 colonias x 10-2 = 7, 700
Se promedia: 7,200 + 7,700 = 7,450

2
Se reporta 7,450 UFC/g ó ml
c. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores

que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.
Ejemplo: Dilución 10-2

Nº de colonias contadas: 350
Dilución 10-3
Nº de colonias contadas: 27
Se promedia: 350 x 10-2 = 35,000

27 x 10-3 = 27,000
48
35,000 + 27,000 = 31,000

2
Se reporta 31,000 colonias /g ó mL o 31 x 103 ufc/g o mL
d. Si el número de colonias de colonias de las placas de 2 diluciones

consecutivas están dentro del rango de 30 – 300, computar el recuento
para cada una de las diluciones y establecer la relación de los 2
recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar el promedio de los 2
valores, pero, si el recuento mayor contiene 2 veces o más al menor, en
este caso se reportará el recuento del menor.
Ejemplo 1: Dilución 10-1

N° de colonias contadas: 290
Dilución 10-2
Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos:
3,500 = 1.2
2,900
En este caso se reporta el promedio
2,900 + 3,500 = 3,200 colonias/gr o mL
2
3.2 x 104 ufc/gr o mL
Ejemplo 2: Dilución 10-2

Dilución 10-3
Se relaciona el cómputo de los recuentos:
45,000 = 2,2
17,000
En este caso se reporta el recuento menor, es decir:

17,000 colonias por g ó ml.
49

PRACTICA N° 13
MÉTODO BACTERIOLÓGICO PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LECHE

ENTERA (FRESCA)
1. Introducción
La leche, considerada como uno de los alimentos más completos por su contenido
proteico, de carbohidratos y grasas, que consumen las crías de los mamíferos incluido
el hombre, siendo suficiente durante los primeros meses de vida, es también de por sí
un excelente medio de cultivo para los diferentes microorganismos que pueden
contaminarla. Es por ello que también debe obtenerse en las mejores condiciones de
calidad higiénica, sanitaria y microbiológica, por lo tanto sea APTA PARA EL
CONSUMO HUMANO.
2. Objetivos
- Describir la forma de obtener una muestra de leche fresca.

- Describir con ayuda de un esquema los pasos del examen bacteriológico de
una muestra de leche.
- Realizar correctamente el examen bacteriológico de una muestra de leche
fresca en el laboratorio.
- Describir y realizar la Prueba de la reductasa para leche fresca
- Escribir correctamente el informe de los exámenes realizados.
3. Materiales
Para análisis cuantitativo y cualitativo
- Muestra de leche fresca

- Tubos con agua de peptona al 0.1% para diluciones
- Gradilla con tubos conteniendo caldo Lactosa Verde Bilis Brillante (Brilla)
- Pipetas estériles de 10, 5 y 1mL
- Agar cuenta colonias
- Incubadora a 37°C
Para prueba de la reducción del azul de metileno (reductasa)
- Muestra de leche fresca

- Tubos de 18 x 100 con tapa rosca
- Agua destilada estéril
- Solución de azul de metileno
- Baño María hirviente
- Incubadora a 37°C
50
4. Procedimiento
Se tomará en cuenta las mismas recomendaciones que para las muestras de agua
o de alimentos, es decir que sea representativa, usar un recipiente estéril (frasco de
boca ancha) transportar la muestra lo antes posible al laboratorio para su
procesamiento, en caso contrario refrigerar por 2 horas máximo y otras que estén
relacionadas a evitar la contaminación de la misma por el examinador.
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS AEROBIOS VIABLES
NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus COAGULASA POSITIVO
Se seguirán los mismos pasos de la muestra de alimentos, en este caso por ser
una muestra líquida se medirá un volumen de 10 mL para preparar las diluciones.
Ver esquema.
PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO O REDUCTASA
La frescura de la leche va a estar dada por el tiempo desde que fue obtenida,
siendo un alimento que contiene bacterias, éstas van a reproducirse en grandes
cantidades lo cual va a producir la acidificación de la misma y su descomposición.
Cuanto más vieja va a contener mayor cantidad de bacterias lo que la hace de
mala calidad.
La presencia de bacterias va a ser determinada por la reducción del azul de

metileno, la enzima responsable de este fenómeno es al xantino oxidasa o xantino
dehidrasa. Estructuralmente la enzima es una flavoproteína rica en hierro y
molibdeno, que actúa como una deshidrogenasa.
El método de reducción del azul de metileno, mide en términos de intervalo de

tiempo, la decoloración de una mezcla de colorante-leche de color azul hasta el
blanco, desde el comienzo de la incubación. El tiempo de reducción es
inversamente proporcional al contenido bacteriano de la muestra de leche.
Seguir la secuencia indicada en el esquema respectivo.
TABLA DE CALIFICACIÓN DE LA LECHE CRUDA O ENTERA (FRESCA)
Calidad de la leche Tiempo de reducción Recuento en placas Conservación

Muy buena De 6 hrs. a más Hasta 200 000 Más de 32 horas
Buena De 4 a 5.40 hrs. De 200 mil a 700 mil De 22 a 32 horas
Mala De 2 a 3.30 hrs. De 700 mil a 5 millones De 15 a 22 horas
Muy mala De 0.5 a 1 hr. De 5 millones a más De 14 a menos horas
Para muestras de otros derivados de la leche como yogurt, helados etc. se

seguirán los mismos pasos, es decir el análisis cuantitativo y cualitativo, sólo se
cambiará la temperatura de incubación en el caso de los helados y habrá que
determinar además el número de enterococos, porque son indicadores de
contaminación fecal en alimentos congelados. La prueba de la reductasa sólo es
para leche fresca
BRMP/
51
DETERMINACIÓN DEL NMP DE GÉRMENES COLIFORMES

TOTALES PARA LECHE
Diluciones 10 mL 1 mL 1 mL
Fecha
Lugar
Hora
Temp. 90ml 9ml 9ml
H2O H2O H2O
Destilada Destilada Destilada
-1 -2 -3
LECHE 10 10 10
1 mL c/u 1 mL c/u 1 mL c/u

Prueba
Presuntiva
9 mL 9 mL 9 mL
Caldo Caldo Caldo
LVBB LVBB LVBB
Prueba Confirmativa Prueba Completa
De las colonias típicas y atípicas

De los tubos positivos sembrar picar y sembrar para su identificación
una asada del caldo en agar EMB bioquímica
por agotamiento
TSI LIA INDOL

EMB
Incubar a 37ºC por 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas

52
PRUEBA DE REDUCCIÓN DE AZUL DE METILENO

(REDUCTASA)
Fecha 10 mL 10 mL 10 mL
Lugar
Hora
Temp.
LECHE
1 mL Azul 1 mL H2O 1 mL Azul
de Metileno 10 mL destilada 10 mL de Metileno 10 mL
Leche Leche Leche
Mezclar Mezclar Mezclar
1 Luego llevar los 3 tubos a incubar a 37oC,

controlar cada 30 minutos, mezclar
invirtiendo los tubos con cuidado, 2 a 3
veces después de cada control.
Registrar los resultados en una tabla,
consignando el tiempo y si se produce
cambio de color: Reducción del Azul de
metileno
Hervir 3´
en Baño María
Resultados
Clasificación de la Calidad Higiénica de la
1 2 3
Leche Cruda
Menor de 30 minutos Muy mala
De 2 a 3.30 hrs Mala
De 4 a 5.40 hrs Buena
De 6 hrs a más Muy buena
53

PRACTICA N° 14
MÉTODO BACTERIOLÓGICO PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS

ALIMENTOS
1. Introducción
Los alimentos son la fuente energética de los humanos. Siendo de vital importancia e
imprescindibles para su existencia, es necesario que sean producidos, en las mejores
condiciones de calidad higiénica, sanitaria y microbiológica, por lo tanto, sean APTOS
PARA EL CONSUMO HUMANO.
2. Objetivos
- Describir la forma de obtener una muestra de cualquier alimento.

- Describir con ayuda de un esquema los pasos del examen bacteriológico de
una muestra de cualquier alimento.
- Realizar correctamente el examen bacteriológico de una muestra de diferentes
tipos de alimentos.
- Escribir correctamente el informe del examen.
3. Material
- Balanza y pesas, licuadora

- Muestra de carne molida (alimento modelo)
- Espátulas de madera, pinzas y papel cortado estériles
- Agua peptonada al 0.1% para diluciones
- Gradilla con tubos conteniendo caldo Lactosa Verde Bilis Brillante (Brilla)
- Pipetas estériles de 10, 5 y 1mL
- Agar cuenta colonias
4. Procedimiento
El profesor hará una breve explicación de la forma como debe obtenerse una
muestra de un alimento, los alumnos harán un ejercicio deduciendo como tomar
muestras de otros alimentos diferentes.
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS AEROBIOS VIABLES
Preparación de las diluciones y siembra. (Ver esquema).

1. En condiciones asépticas, cerca al mechero, usando barbijo y guantes;
pesar 10 gramos de la muestra problema, con ayuda de las espátulas, pinza
y/o tijeras evitando en todo momento la posibilidad de contaminarla en ese
momento.
54
2. Transferirlos a un frasco con 90 mL de diluyente (agua peptonada al 0.1 %),

homogenizarla o licuarla en un recipiente estéril si el alimento es sólido, esta
corresponderá a la dilución 10-1Con una nueva pipeta homogenizar el
contenido del tubo con la dilución 10-1, aspirando y dejando caer el líquido
hasta 15 veces y tomar un mL de esta dilución; transferirlo dejándolo caer a
otro tubo que contenga 9 mL del diluyente, esta será la dilución 10-2.
3. Repetir este proceso para preparar las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, o las que
sean necesarias.
4. De cada dilución medir un mL y transferirlo a cada una de las placas Petri
estériles ya rotuladas con su correspondiente dilución, agregarles agar
recuento licuado y temperado a 44°C tapar y mezclar con cuidado moviendo
las placas en forma de 8 sobre la mesa de trabajo. Dejar enfriar, invertir las
placas y rotularlas de nuevo por el anverso.
5. Llevar las placas a la incubadora a 37°C durante 24 horas.
6. Hacer el recuento escribir los resultados como corresponde. Seguir el
modelo de la muestra de agua.
Para el control de calidad de algunos alimentos pueden hacerse otras pruebas,

siguiendo la misma metodología sólo se cambia el agar que será especial para
cada tipo de bacteria o para hongos filamentosos o levaduriformes
A partir de la muestra de alimento (carne molida u otro), preparar las diluciones

como se indicó anteriormente, de cada una agregar alícuotas de 1 mL a cada placa
Petri rotulada con la correspondiente dilución y tipo de recuento.
Añadir 15 a 20 mL de agar Chapman a 44°C, mezclar con cuidado, dejar enfriar e

incubar a 35 o 37°C por 36 horas.
Transcurrido este tiempo hacer el recuento como se indicó anteriormente,
observando la presencia de colonias de color amarillo dentro o en la superficie del
agar que es rojizo.
Anotar los resultados relacionando siempre a 1 mL o a 1gr de muestra, según sea
el caso.
Para RECUENTO DE HONGOS se prepararán 2 juegos de placas a partir de las

mismas diluciones; en este caso se usará el agar Sabouraud y se colocará las
placas a 22°C (ambiente) para hongos filamentosos y a 37°C para los
levaduriformes.
NUMERACIÓN DEL NMP BACTERIAS COLIFORMES TOTALES por el método

de FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES
Se seguirá la misma metodología que para una muestra de agua, con la única
diferencia que se añadirá a cada triplete 1 mL de cada dilución 10-1, 10-2 y 10-3
Prueba presuntiva
Prueba confirmativa
Prueba complementaria
Todo lo demás sigue el mismo esquema.

55
EXAMEN BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS
Diluciones 10 mL 1 mL 1 mL
Fecha
Lugar
Hora
Temp. 90ml 9ml 9ml
Agua de Agua Agua
Peptona de de
-1 Peptona Peptona
ALIMENTO 10
10
-2
10
-3
1 mL 1 mL
1 mL
Numeración de
mesófilos aerobios
viables
Agar recuento
44oC
1 mL 1 mL 1 mL
Numeración de
Staphylococcus
aureus
Agar Chapman
44oC
1 mL c/u 1 mL c/u 1 mL c/u
9mL 9mL 9mL

Caldo Caldo Caldo
Numeración de LVBB LVBB LVBB
coliformes
totales
(NMP)
Incubar a 37oC x 24 a 48 hrs.
Prueba Confirmativa Prueba Completa
TSI LIA INDOL

EMB
Incubar a 35ºC por 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas

56

PRACTICA N° 15
1. Introducción
Staphylococcus aureus, es una bacteria patógena y su presencia en los alimentos

es considerada como peligrosa porque puede causar intoxicaciones en los
consumidores
2. Objetivos
- Describir con ayuda de un esquema, los pasos para la determinación de
Staphylococcus aureus en una muestra de leche fresca, puede usarse también
para otros alimentos.
- Realizar correctamente el examen bacteriológico para la numeración de
Staphylococcus aureus de una muestra de leche fresca en el laboratorio.
3. Materiales
Para el análisis cuantitativo y cualitativo
- Muestra de leche fresca o carne molida
- Frasco con 90 mL y tubos con 9 mL agua de peptona al 0.1% para diluciones
- Pipetas estériles de 10, 5 y 1 mL
- Balanza, pesas, paletas y pinzas estériles
- Agar Chapman o estafilococo
- Incubadora a 37° C
4. Metodología
Primer día:
1. Rotular los tubos, las pipetas, las placas, en el orden correspondiente
2. Agitar bien, pero con cuidado, para homogenizar la muestra, unas 25 veces
3. Medir 10 mL o pesar 10 g de la muestra y colocarlo dejándolo caer en el frasco,
que corresponderá a la dilución 10-1, no tocar el agua de dilución.
4. Con otra pipeta, homogenizar el contenido del frasco y medir un mL, agregarlo,
dejando caer el contenido de esta primera dilución a un primer tubo, que será la
dilución 10-2.
5. Continuar así con las siguientes diluciones, hasta completar por lo menos 3
diluciones en sus correspondientes tubos. Tener cuidado de no contaminar ni
confundir las pipetas. (Ver esquema de práctica anterior)
6. Medir de cada una de las diluciones con su pipeta correspondiente, una
alícuota de un mL y agregarlo a las placas estériles ya rotuladas.
7. Añadir 15 a 20 mL de agar Chapman a 44° C, mezclar con cuidado, con
movimientos suaves en ocho, dejar enfriar e incubar a 35 o 37° C por 36 horas.
Segundo día
Transcurrido el tiempo, hacer el recuento como se indicó anteriormente,
observando la presencia de colonias de color amarillo, dentro de la superficie del
agar.
Anotar los resultados relacionando siempre a 1 mL o a 1 gr, según sea el caso.
57
MÉTODO DE DETECCIÓN DE SALMONELLAS
1. Introducción
Las salmonellas están comprendidas en el grupo de las Enterobacterias; la tribu
Salmonella consta de un sólo género: Salmonella, sin embargo son más de 2200
serotipos. La transmisión es vía fecal-oral. Son bacilos Gram negativos, sensibles
a los jugos gástricos, de modo que es necesario ingerir una dosis elevada de 10 6
a 107 microorganismos para que la infección declarada se establezca. No
fermentan la lactosa, son indol negativos y producen ácido sulfhídrico
GASTROENTERITIS (Salmonellosis): la enfermedad se caracteriza por náuseas,

vómitos, dolor abdominal, fiebre y diarrea; se inicia de 8 a 24 horas luego de haber
ingerido alimentos o bebidas contaminadas con Salmonella; dura de 4 a 5 días
FIEBRE ENTÉRICA (Tifoidea): Luego de 7 a 14 días de haber ingerido Salmonella

typhi, se inician los signos y síntomas, que incluyen anorexia, letargo, cefalea frontal
moderada, dolor abdominal, estreñimiento y la temperatura aumenta en forma
constante, hasta 40° C, siendo más frecuente por las tardes.
El origen último de las salmonellas, son las personas y los animales de sangre
caliente. Los microorganismos llegan a la mayoría de alimentos, desde los
manipuladores de los mismos, que contaminan los huevos, la carne o la leche,
siendo los alimentos más frecuentemente implicados, las carnes y sus productos,
(como los como las empanadas, salchichas, carnes curadas, etc.).
Los huevos, la leche y los productos lácteos. La enfermedad causada por alimentos,
va asociada a huevos crudos, la mayonesa, el ponche, los merengues, los pasteles
con crema.
Los alimentos debidamente cocinados son seguros, si se comen de inmediato o si se

almacenan a temperaturas de 4° C o menos, sin embargo, los alimentos cocinados o
enlatados que se contaminan a través de un manipulador de alimentos, infectado,
antes de ser consumido, permite el crecimiento de salmonella si se mantienen
durante largos periodos de tiempo, especialmente sin refrigerar. La infección es más
común en verano que en invierno.
2. Objetivo
Aislar e identificar Salmonella de muestras de alimentos.
3. Material
Placas Petri estériles Estufa
Tubos de ensayo Baño María a 44° C
Matraz Termómetro
Medios de cultivo Pipetas de 10, 5 y 1 mL
Mechero de bunsen Batería para coloración de Gram
Cocina eléctrica Láminas
Microscopio
Balanza
4. Procedimiento
1) Enriquecimiento NO selectivo: Pesar 25 g de muestra, añadirlo a 225 mL

de caldo lactosado. Incubar a 37° C por 18 a 24 horas. Observar el viraje
de color púrpura a amarillo, indica una reacción positiva.
58
2) Enriquecimiento Selectivo: Sembrar en tubos de ensayo que contengan 9

mL de caldo selenito, 1 mL del caldo lactosado positivo, incubar a 44° C
durante 24 horas.
3) Aislamiento selectivo: De los medios de cultivo (caldo selenito) incubados,
sembrar por agotamiento en agar salmonella-Shigella (SS) y agar Sulfito
bismuto, durante 24 horas a 37° C. Las colonias de salmonella en agar SS
son incoloras, rosa pálido, opacas y translúcidas, algunas colonias tienen
una pigmentación negra en el centro. En agar Sulfito bismuto, son pardas,
grises y negras y a veces presentan brillo metálico.
4) Pruebas bioquímicas Las colonias sospechosas de ser salmonella, se
siembran en TSI, LIA y caldo peptonado para la prueba de indol, se incuba
a 37° C durante 24 horas.
ESQUEMA DE TRABAJO
PRE ENRIQUECIMIENTO 25gr de muestra
225 m l Caldo lactosado

Fecha 37ºC por 24 hrs.
Lugar
Muestra Hora
Temp.
ALIMENTO
1 ml
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
10 m l Caldo Selenito
Inc ubar 44ºC por 24 hrs.
AISLAMIENTO Sembrar con asa de Kolle
Agar SS Agar Sulfito Bismuto

IDENTIFICACIÓN
Sembrar en tubos
TSI LIA INDOL

59

PRACTICA N° 16
MICROBIOLOGÍA DE PRODUCTOS ARTESANALES E INDUSTRIALES
1. Introducción
La Microbiología industrial es una rama importante de esta ciencia, porque va
creciendo cada vez más, sobre todo aplicada a los alimentos, es por eso que
hemos incluido una práctica sólo demostrativa de la observación de
microrganismos que participan en la producción de algunos alimentos, en este
caso, yogurt y una bebida fermentada, la chicha de jora.
2. Objetivos
- Observar y reconocer los microorganismos participantes en la producción de
yogurt y de chicha de jora, a través de una coloración de Gram.
- Preparar un frotis de cada uno de los alimentos y diferenciar el tipo de
microorganismo en cada uno de ellos.
3. Material
- Un frasco pequeño de yogurt de marca conocida de su preferencia o en su
defecto, de yogurt preparado en casa o de marca no reconocida en la
comunidad
- En un frasco limpio, no necesariamente estéril, traer una porción de chicha de
jora u otra bebida fermentada.
- Laminas portaobjeto
- Batería de Gram
- Asa bacteriológica
- Mechero Bunsen
4. Metodología
- Preparar frotis de cada una de las muestras en una misma lámina
- Colorearlo con Gram
- Observar con microscopio óptico con objetivo de 100x
- Realizar esquemas de lo observado
5. Resultados y registro
Yogurt Chicha
60

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA DE CS. DE LA NUTRICIÓN

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PATOLOGÍA

Complete el nombre de las partes del Microscopio

NORMAS GENERALES Y RECOMENDACIONES PARA EL DESARROLLO DE

1. La asistencia a prácticas es obligatoria, si falta a alguna de ellas, no tendrá la

12. Todo material roto o extraviado, durante la práctica, será de responsabilidad

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

Para observarlas requerimos de un instrumento muy importante que es el

Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

- Recordar puntualmente y reforzar conceptos sobre microscopia óptica

1. Estando con los guantes calzados y otros implementos de protección en

1. Revisar y describir las características de otros tipos de microscopios

2. Calcular cuántas veces está aumentado el tamaño de las bacterias que ve

3. Hacer un esquema de lo observado. PONER NOMBRE A TODO LO QUE

Agua estancada Sedimento urinario

Aumento: 40x Aumento: 40x

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

CARACTERES MORFOESTRUCTURALES DE LAS BACTERIAS

Coloraciones: AZUL DE METILENO

1. Introducción: Las bacterias tienen tres formas básicas: cocos, bacilos y

Existen dos tipos de coloraciones:

Simples: Utilizan un colorante y se realiza en un solo tiempo, ejemplo: Azul de

Compuestas: Utilizan dos o más colorantes y se realizan en varios tiempos,

Coloración de Azul de Metileno: Es una coloración simple y sirve para

Coloración de Gram: Fue ideada por el científico danés, Christian Gram en

2. Objetivos: Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

- Diferenciar una coloración simple de una compuesta.

Para todas las coloraciones:

Coloración de Azul de metileno y Gram:

- Suspensión de bacterias en un caldo de cultivo.

Preparación de un frotis o extendido, para todos los casos:

Coloración de AZUL DE METILENO:

- Cubrir el frotis con la solución acuosa de Azul de metileno al 1%, durante 2

- Cubrir el frotis con Violeta de genciana (solución acuosa al 1%), dejar

AZUL DE METILENO GRAM

Medio líquido / Medio sólido Medio líquido / Medio sólido

Aumento: 100x Aumento: 100x

Realizar todos los procedimientos de la práctica; en su guía, realizar los

Investigue y ponga ejemplos (nombres científicos) de 4 bacterias Gram

Gram positivas: Gram negativas

Coloraciones especiales: ZIEHL - NEELSEN (B.A.A.R)

Mycobacterium tuberculosis, bacilo fino, muy delgado, aerobio estricto, no se tiñe

Bacterias esporuladas: Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium son

Coloración de Ziehl-Neelsen: Es una coloración compuesta que sirve para teñir

Coloración de Wirtz Conklin: es una coloración especial para teñir endosporas de

- Realizar en forma correcta la coloración de Ziehl-Neelsen y la de Wirtz

- Láminas con frotises de muestras patológicas (esputo) ya preparadas.

Coloración de Wirtz Conklin:

- Placas Petri con cultivo de Bacillus subtillis en agar tryptosa.

Para el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar, debe tomarse una muestra de

- Colocar la lámina en el soporte sobre el lavatorio.

- Con el mechero de alcohol, aplicar calor por debajo de la lámina hasta la

Coloración de Wirtz Conklin:

Observar los caracteres culturales del cultivo de Bacillus subtilis, Preparar un

- Cubrir TODA la lámina con la solución acuosa de Verde de malaquita al 5%.

Lectura: Las esporas se observan de color verde y el cuerpo bacteriano

Observación microscópica: Observe y realice los esquemas correspondientes

COLORACIÓN DE ZIEHL - NEELSEN

Muestra de esputo Lámina de stock

COLORACIÓN DE WIRTZ COKLIN

Muestra: Cultivo de Bacillus subtilis Lámina de stock

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN