PRÁCTICA No.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

1. OBJETIVOS.
1.1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas.
1.2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación cuantitativa de
compuestos coloreados.
1.3. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita comprender el manejo
del mismo.
1.4. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino como
proteína patrón para cada una de los métodos colorimétricos del Biuret y de Lowry.
1.5. Establecer el desarrollo de los métodos determinando la linealidad, la sensibilidad, el
límite de detección y el rango de cada uno de los métodos ensayados.
1.6. Determinar el contenido de proteína en muestras problema por el método de Biuret y el
método de Lowry

2. INTRODUCCIÓN
Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en
las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en
solución.
Los métodos más usuales son:
- Reacción del Biuret.
- Método de Lowry.
- Método de Bradford.
- Método del ácido Bicincónico.
- Absorción en el ultravioleta.
- Métodos inmunológicos.
Nota: Para ampliar la información ver archivo anexo.
En la práctica se van a ensayar los dos primeros métodos colorimétricos de Biuret y
Lowry.
2.1. Fundamento del método de Biuret
Como se vio en la práctica anterior, el nombre de la reacción del Biuret procede del
compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con
eliminación de amoníaco.

H2 N CO NH2 Q
H 2N CO NH CO NH2
H 2N CO NH2
Urea Biuret
 Reacción del Biuret

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO 4) se añade a una solución
de proteína se forma un complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con
aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a
540 nm.Los compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul
al púrpura cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El compuesto más sencillo
que da la reacción es el biuret. El ensayo es bastante específico para proteínas, pero
poco sensible, requiriendo de 1 a 10 mg de proteína. El reactivo de biuret no contienen
urea.
Las características más importantes de la reacción son:

A. La reacción del Biuret se aplica y es positiva a partir de tetrapéptidos, y proteínas.

B. Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/mL.
C. No depende de la composición de aminoácidos.
D. De acuerdo a la práctica anterior, se sabe que algunos compuestos (NH 4+, Tris, etc.) dan
la reacción.

O C C O
NH HN
RC H H CR
Cu2+
O C C O
NH HN
RCH H CR

Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)

2.2. Fundamento del método de Lowry

Para aumentar la sensibilidad en el orden de 0,1-1 mg/mL respecto de la reacción del
biuret, el complejo proteína-Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo denominado de
Folin-Ciocalteuau, dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm.
Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a
azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos
tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que
forman el complejo con el Cu2+.

Las características del método son:

La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína.
Es más sensible que el ensayo de biuret. El rango es de 0,1-1 mg/mL.
Presenta muchas interferencias.

Complejo Complejo
2+ 2+
Proteína-Cu Proteína-Cu
AA red. AA oxid.

ReactivoFolin ReactivoFolin

oxidado. reducido.

AMARILLO AZUL

Esquema de la reacción de Lowry

2.3. Fundamento del método de Bradford

Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los
residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante azul Coomassie.
Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estándar).
La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.

2.4. Fundamento del método del ácido Bicincónico.

Está basado en la reducción en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en medio alcalino y la
formación de un complejo ácido bicincónico: Cu(I), con un máximo de absorbancia a
562 nm.
El rango de concentración de proteína es de 0,5-30 mg/ml.
Más rápido que el método de Lowry.
Altamente preciso y sensible.

2.5. Fundamento del método de Absorción en el ultravioleta:

Las proteínas poseen una banda de absorción a 280 nm como consecuencia de la
absorción de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta región del espectro.
Es un método no destructivo.
El rango de concentración que se puede determinar depende del contenido de los
aminoácidos Tir y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
 La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

2.6. Protocolo a utilizar para determinar la concentración de proteína de una

muestra desconocida
Una vez obtenida la recta de calibrado, si se deseara conocer la concentración de
proteína de una muestra problema, se debe seguir el mismo procedimiento para cada
uno de los métodos, pero tomando 2 mL de la muestra problema en el caso del
método del Biuret, ó 1 mL para el método de Lowry y se mide la absorbancia.
Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método seleccionado,
mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de
proteína de la disolución problema.
Si la absorbancia es mayor al límite superior del rango de medida, siempre se puede realizar
la dilución correspondiente para introducirla en el rango del método. Pero si es
inferior al límite de cuantificación del método seleccionado, hay que emplear un
método más sensible.

3. PRELABORATORIO

a. Indique otras técnicas analíticas diferentes a UV-Vis que permitan reconocer y

cuantificar proteínas en una muestra.
b. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita comprender el
manejo del mismo. Haga un esquema del mismo.
c. ¿Con base en la guía y lo investigado, que prueba es más sensible para reconocer
proteínas, método colorimétrico de Biuret o método colorimétrico de Lowry?
d. ¿Por qué es importante conocer que el máximo de absorción en la región visible del
espectro sea para el método de Biuret de 540 nm y para el método de Lowry de 650
nm?

4. MATERIALES Y REACTIVOS
20 tubos de ensayo, gradilla, pipetas de 1 y 5 ml. Estufa, 1 probeta de 10 y de 5 mL.,
espátula, 2 baños de agua calefactor, 5 pinzas para tubos de ensayo, jeringa desechable.
Disolución de albúmina bovina (5 ó 10 mg/mL), tampón fosfato pH 7, 10 mM, reactivo de
Biuret, reactivos A, B y C de Lowry, suero sanguíneo (5 ml por grupo) para obtener
disolución de proteínas problema (plasma diluido en agua destilada 1:20), huevo de
gallina

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Extracción de la ovoalbúmina.
 De una clara de huevo de gallina, tome entre 1-2 g con la ayuda de una espátula o una
pipeta Pasteur. De esa cantidad, el 10% aprox. es ovoalbúmina, la proteína más
abundante en la clara. Diluya 20 veces con tampón fosfato (añadiendo 19 a 38 ml de
tampón según el peso de clara obtenido). Agite hasta obtener una disolución
homogénea. En caso de que existan flóculos, elimínelos mediante centrifugación a 4000
rpm durante 5 min.

5.2. Determinación del contenido de proteína (albumina) por el método de Biuret

A partir de la disolución de albumina de suero bovino patrón y de acuerdo al protocolo

presentado en el archivo soporte, determine la absorbancia para los 8 primeros tubos
que aparecen en el siguiente cuadro.

Tome 2 mL de disolución de concentración desconocida de albúmina de clara de huevo

y determine la absorbancia (Densidad óptica, correspondiente al tubo 9).

Concentración Absorbancia de Concentración

Albúmina de curva Disolución de los tubos patrón de solución Agua Reactivo de
Tubo (5 ó10 mg/mL) patrón concentración y sustancia desconocida (mL) Biuret(mL)
Vol. (mL) desconocida (mL) problema

1 0 - - 2,0 3
2 0,2 - - 1,8 3
3 0,4 - - 1,6 3
4 0,6 - - 1,4 3
5 0,8 - - 1,2 3
6 1,0 - - 1,0 3
7 1,2 - - 0,8 3
8 1,4 - - 0,6 3
9 - - 2,0 ? - 3

Si no da color violeta a temperatura ambiente, introduzca el tubo en el baño de agua

termostatizado a 37 ºC, dejando que se desarrolle el color durante15 min. Recuerde que
para todos lo tubos se debe medir absorbancia a 540 nm.
Represente gráficamente las absorbancias frente a las concentraciones. Obtenga la recta
patrón y deduzca la concentración de proteínas (mg/mL) de la disolución problema.
5.3. Determinación del contenido de proteína (albumina) por el método de Lowry

Prepare 5 mL de otra disolución de albúmina de clara de huevo problema a partir de la

disolución desconocida anterior. Para eso, tome 0,2 mL de esa solución y adicione 4,8
mL de agua destilada. De esa solución tome 1 mL que será la disolución de
concentración desconocida y complemente el protocolo dado para construir una recta
patrón.

Concentración Absorbancia
de la Curva de los
Disolución de
BSA 1,0 patrón y de la Agua Reactivo Reactivo Reactivo tubos
Tubos concentración
mg/mL solución (mL) A (mL) B (mL) C (mL) patrón y
desconocida
desconocida sustancia
problema
1 0 - 1,0 0,9 0,1 3,0
0
2 0,2 - 0,8 0,9 0,1 3,0
0,033
3 0,3 - 0,7 0,9 0,1 3,0
0,061
4 0,4 - 0,6 0,9 0,1 3,0
0,088
5 0,6 - 0,4 0,9 0,1 3,0
0,136
6 0,8 - 0,2 0,9 0,1 3,0
0,166
7 0,9 - 0,1 0,9 0,1 3,0
0,185
8 - 1,0 - 0,9 0,1 3,0 0,05
 Vea las instrucciones dadas para la curva de calibración en cuanto a temperaturas.
Mida absorbancia a 650 nm. Represente gráficamente las absorbancias frente a las
concentraciones. Obtenga la recta patrón y deduzca la concentración de proteínas
(mg/mL) de la disolución problema.

a. Como puede relacionar la concentración de la solución desconocida o problema con la

curva patrón para cualquiera de los dos métodos?
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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b. Que absorbancia esperaría Ud. obtener al analizar soluciones desconocida de 0,85 y 4,38
mg/mL? ¿Qué método emplearía para determinar sus concentraciones?
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
c.En que se basa Ud. para predecir los resultados anteriores?
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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5.4. Determinación de las proteínas séricas por el metodo de Biuret
Nota: Es indispensable el uso de guantes ya que se maneja materialbiológico
Obtención de la muestra de sangre y de plasma
En un tubo de ensayo traiga 5 mL de sangre,centrifuguela durante 10 minutos a 2500
r.p.m. Retire los tubos de la centrifuga de cada grupo, espere 10 min para que se
consuman los factores de coagulación del plasma y solo se obtenga el suero
sobrenadante (los factores y el hematocrito quedarán en el fondo). Realice una
dilución de suero sanguieno1:20. Será la disolución problema.
Se disponen 9 tubos de ensayo con las cantidades (mL.) indicadas en la siguiente tabla y
realiceun procedimiento igual al empleado para la determinación de proteína de
albúmina de huevopatron(ver apéndices 6 y 7).

La disolución de concentración desconocida será la disolución de suero sanguineo1:20

Albúmina patrón(5ó 10 mg/mL. )

Albúmina Concentración Concentración

de curva Disolución de de solución
(5 ó 10 Agua Reactivo de
Tubo patrón concentración desconocida
mg/mL) (mL) Biuret(mL)
desconocida (mL)
Vol. (mL)
1 0 - 2,0 3
2 0,2 - 1,8 3
3 0,4 - 1,6 3
4 0,6 - 1,4 3
5 0,8 - 1,2 3
6 1,0 - 1,0 3
7 1,2 - 0,8 3
8 1,4 - 0,6 3
9 - - 2,0 - 3

De acuerdo al cuadro anterior, los tubos patrónvan a contener distintas cantidades

conocidas de proteína, con los que se puede trazar la recta patrón.
El tuboblanco no contendrá nada de proteína y se utilizará para poner el punto cero de la
recta patrón.
El tubo problematendrá una concentración desconocida de proteínas que se deduce por
interpolación en la recta patrón obtenida.
Si no dan color violeta a temperatura ambiente, se introducen en elbaño de agua
termostatizado a 37 ºC, dejándo que se desarrolle el color durante15 min.

a. Represente gráficamente las absorbancias frente a las concentraciones. Obtener la recta

patrón y deducir la concentración de proteínas de la disolución problema.

b. Calcule la concentración de proteínas del suero en mg/ml.

c. Qué concentración de proteínas tiene el tubo problema. Explique como lo dedujo?

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d. A qué se le llama Plasma?

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____________________________________________________________
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 ____________________________________________________________
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e.Indique las diferencias principales entre plasma y suero. ¿Cómo se obtiene el suero?
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5.5. Determinación de las proteínas séricas por el método de Lowry.

Obtención de disolución problema:
Realice una dilución de suero sanguieno1:40. Será la disoluciónde concentración
desconocida.
a. Ccomplementeel protocolo dado para construir una recta patrón (ver apéndice).

BSA 1,0 Disolución de Reactivo Reactivo Reactivo

Tubos mg/mL concentración Agua A B C
(mL) desconocida (mL) (mL) (mL) (mL)
(mL)
1 0 - 1,0 0,9 0,1 3,0
2 0,1 - 0,9 0,9 0,1 3,0
3 0,2 - 0,8 0,9 0,1 3,0
4 0,3 - 0,7 0,9 0,1 3,0
5 0,5 - 0,5 0,9 0,1 3,0
6 0,7 - 0,3 0,9 0,1 3,0
7 0,9 - 0,1 0,9 0,1 3,0
8 - 1,0 - 0,9 0,1 3,0

b. Mida absorbancia a 650 nm.

c. Represente gráficamente las absorbancias frente a las concentraciones y deducir la
concentración de proteínas de la disolución problema en mg/ml..
Otro de los metodos mencionados que se utilizan para la determinación de la concentración
de proteínas, corresponde al llamado método de Bradford. De manera alternativa
puede utilizarse. Su metodología aparece en el APENDICE.
a. Por qué puede afirmar que la concentración encontrada corresponde a la muestra
problema? Cómo lo dedujo?
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b. Cuáles son las ventajas y desventajas del uso de los métodos de Biuret y Lowry?
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6. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Grupo de trabajo N°. _______________________________________________________
Integrantes ______________________________________________________________
Fecha de práctica__________________________________________________________
Fecha de entrega de informe_________________________________________________

Enlaces:
https://www.youtube.com/watch?v=jTS8TRuZXWI
https://www.youtube.com/watch?v=eVmFrf4T93A
https://www.youtube.com/watch?v=iNmmkZXgbf0
https://www.youtube.com/watch?v=hdb3s4YHkms
https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU
https://www.youtube.com/watch?v=SAY7THWad9o