Está en la página 1de 15

 

FUNCIÓN DE REACTIVOS
Medio de Sypher y Strauss
• Medio mínimo y sintético.

Regulador de fosfatos 50mM de pH 7.3


• Ayuda a mantener un pH óptimo para
para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa.
Deshidrogenasa.

2,6-diclorofenol
2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) 1.53mM en regulador de fosfatos
• Indi
Indica
cado
dorr de reac
reacci
ción
ón óx
óxid
ido-
o- redu
reducc
cció
ión
n qu
que
e va a actu
actuar
ar como
como acep
aceptotorr arti
artific
ficial
ial fina
finall de ele
elect
ctro
rone
ness al

térm
rmin
ino
o de la ca
cade
dena
na ar
arti
tifi
fici
cial
al cr
crea
eada
da por
por medi
medioo del
del méto
método
do de Ells
Ells..
• Oxida
Oxidado
do (azul)
(azul)
• Redu
Reducido
cido (incolor
(incoloro)
o)

Metosulfato
Metosulf
•Es util
utiliz
ato
izad
ado
demo
o co
fenazi
fenazina
como tr
tran
naorta
ansp
0.6mg/mL
sportado
dorr de el
entron
elec
regulador
ectrones
de fosf
es,, ya que
fosfatos
que se ac
atos
acop
opla
larrá a la cade
cadena
na tran
transp
spor
orta
tado
dorra de
electro
electrones
nes entre
entre la re
reduc
ducció
ción
n de nucleó
nucleótid
tidos
os de piridi
piridina
na y 2,6
2,6-di
-diclo
cloro
rofe
fenol
nol indof
indofeno
enol.
l.

NADH 0.3mM en regulador de fosfatos 0.3mM


• Nicotin adenin dinucleótido
• Para la determinación del efecto del amital o quinacrina en la actividad de
de la NADH DH
 

KCN 0.1M (pH 3, disuelto en KH2PO4 mM)


• Inhibidor de la enzima oxidasa terminal (complejo IV) que permite que el 2,6-diclorofenol
indofenol sea el aceptor final de electrones.

Amital o quinacrina 45mM en regulador de fosfatos


• Inhibidor de la cadena de transporte de electrones, bloquean la cadena de transporte de
electrones entre la NADH deshidrogenasa (Complejo I) y la CoQ.

Glucosa al 50%
• Fuente de carbono adicionada para la solución de trabajo del medio de Sypher y Strauss.

Succinato de sodio al 25%


• Fuente de carbono adicionada para la solución de trabajo del medio de Sypher y Strauss.
St rauss.

Succinato de sodio 120mM


•Dona
Donador
dor de electrone
electroness para llevar
llevar a cabo la cadena
cadena artificial
artificial de tran
transport
sporte
e por el método de Ells.
Ells.
 

a) Obtención de la 1suspensión celular


• 50 mL
mL Sypher
Sypher y Straus
Strausss
con succina
succinato
to 0.5% • Incubar a 37˚C
agitación por 12 hrs
Inocular
2 • 50 mL
mL Sypher
Sypher y Straus
Strausss
con Glc 1.0%
1.0%

1 1

•Lavar 2 veces • Cosechar células


• Resuspender
Resuspend er a 10 mL con regulador de por centrifugación
con el mismo regulador 2 fosfatos estéril
2
 

a) Obtención de la suspensión celular


1
• 50 mL de
1 succinato
succinato 0.5%
Con alícuotas
Inocular de 4 mL leer
leer
1 mL 2 •
  de lo
50 mL de 600
600 
matarce
mat arcess 1,2,3
Gl
Glcc 1.0%
1.0%   ó
E. coli y succin
succinato
ato 0.5% y 4 Usando
como blanco
medio de
cultivo sin
inoculo
3 • 50 mL de
(succinat
(succ inatoo 0.5%
2 succinato
succinato 0.5%
y Glc
Glc 1.0%)
1.0%)
Inocular

1 mL 4 50 1.0%
Glc mL
1.0%de
• E. coli y Glc 1.
Glc 1.0%
0%
 

A OBTENCIÓN DE LA SUSPENSI
SUSPENSIÓN
ÓN CELULAR
1
1 2 3 4

2

Incubar
37˚C, a
5 hrs porCosechar células
centrifugación
y volver a
leer en el   ó
espectrofo

3 tómetro
  
  1 2 3 4

4 •

Lavar 2 veces con regulador de


fosfatos y ajustar a una 
una  

 
de 0.8
 

B EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA


ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA
Agregar
• 0.25
0.2 5 mL de 2,6-di
2,6-diclo
cloro
rofe
fenol
nol indof
indofeno
enol.
l. • Sellar con parafilm
• 0.6 mL de KCN. y mezclar por inversión
• 3.
3.25
25 mL de regu
regula
lado
dorr de
fosfatos. lo mas rápido posible.
• 1 mL de succ
succin
ina
ato de sosoddio.
io.
• 0.
0.4
4 mL de meto
metosusulf
lfat
ato
o de fe
fena
nazi
zina
na..
• 0.
0.5
5 mL de su
susp
spen
ensi
sión
ón ce
celu
lula
larr.

• Registrar
Registrar lecturas
lecturas • Leer el %T a 600 nm
cada 30 seg por con un blanco de
5 min.
rfosfatos.
egulador de
 

C EFECTO DEL AMITAL O QUINACRINA SOBRE


LA ACTIVIDAD DEL SUCCINATO DH Y NADH DH
1

Añadir cantidad Incubar


Trasferir 10mL
Pequeña de lisozima

4 T 37°C
15 min
 

TRATAMIENTO TÉRMICO

Repetir hasta obtener suspensión altamente viscosa

Descongelación
Adicionar pequeña porción de DNasa
Congelación
Baño María
Hielo seco-etanol
37°C
Homogeneizar por agitación

Hasta viscosidad
desaparición de

¡MANTENER EN BAÑO DE HIELOS!


 

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


SERIE 1 1
+1 mL de amita
amitall
o quinacrina
0.5 mL en c/tubo Succinato
Succinato DHasa
del extracto de
2
Célula crecida en
SUCCINATO
Preincubar

T amb
3
5 min
+1 mL de amita
amitall
o quinacrina

NADH DHasa
4
+1mL de regulador
de fosfatos
 

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


SERIE 2
5
+1 mL de amita
amitall
0.5 mL en c/tubo
0.5 o quinacrina
Succinato
Succinato DHasa
del extracto de
Célula crecida en 6
GLUCOSA
Preincubar

T amb
7
5 min
+1 mL de amita
amitall
o quinacrina
NADH DHasa
8
+1mL de regulador
de fosfatos
 

MEDICIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


4
3
1 2

• 0.5 mL
mL de DCFIF
DCFIF
• 0.6 mL KCN
KCN
• 1.6 mL de regulador
regulador de
de
Fosfatos. +1 mL de
Succinato +1 mL de
• 0.8 mL de metosulf
metosulfato
ato NADH + H+
de sodio
de Fenazina
 

Medición de actividad enzimática

• Registrar lecturas
• Sellar con parafilm
• 600 nm con un blanco
Leer el %T a 600 cada 30 seg
seg por
y mezclar por inversión
de regulador de fosfatos 5 min
lo mas rápido posible
 

CADENA DE TRANSPORTE
TRANSPORTE DE ELECTRONES
 

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES


PARA ENTEROBACTERIAS
ENTEROBACTERIAS
 

Tomada de: Cadena respiratoria terminal, Capítulo 8. Documento pdf, página 7.


http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/termodinamica
http://www.ibt.unam.mx/computo/p dfs/termodinamica biologic
biologica/cadenarespir
a/cadenarespiratoriaterminal.pdf
atoriaterminal.pdf

También podría gustarte