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TEMA 5: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
ACTIVIDADES IMÁGENES UD 5 (TÉCNICAS FISH Y CISH).

Técnica: FISH
Tipo de muestra: cromosoma en metafase
Tipo de sonda: sonda de secuencia única con marcado verde en
la sonda control y con marcado rojo para el locus específico que
vamos a analizar.
Anomalías detectadas: No se detectan anomalías ya que
encontramos dos puntos verdes y dos puntos rojos que marcan
locus específicos sin determinar ninguna anomalía numérica,
como trisomías o monosomías, y tampoco síndrome de Digeorge
(microdeleción en la región zzq.11.2). Si el paciente presentase el
síndrome de Digeorge se debería presentar un solo punto rojo.
Cromosoma 22 para el locus zzq.11.2

Técnica: FISH
Tipo de muestra: núcleo en interfase
Tipo de sonda: centromérica (CEP) Y → Amarilla
centromérica (CEP) 13 → Rojo
centromérica (CEP) 18 → Azul claro
centromérica (CEP) X → Azul oscuro
centromérica (CEP) 21 → Verde
Anomalías detectadas:
• CEP 13 → hay dos puntos rojos por lo que no se detectan
anomalías.
• CEP 18 → hay tres puntos azul claro por lo que indica una
trisomía.
• CEP 21 → hay dos puntos verdes por lo que no se
detectan anomalías.
• El paciente presenta un cromosoma X y dos cromosomas
Y, por lo que presenta síndrome de Jacobs.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: pintado cromosómico en color rojo
Anomalías detectadas: no se detectan anomalías, ya que no hay
material adicional ni deleciones.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: telomérica (TEL) de color verde del cromosoma 11
Anomalías detectadas: deleción terminal, se deberían ver dos
puntos verdes porque el cromosoma tiene los brazos juntos, y
solo se ve un punto que indica la deleción del telómero del
cromosoma 11. Debería haber otro punto para que no hubiese
anomalía.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: centromérica con diferentes marcados
fluorescentes para los distintos cromosomas.
• Imagen 1 → No se detecta anomalía, ya que se distinguen
dos puntos rojos y dos verdes del mismo color y tamaño.
• Imagen 2 → No se detecta anomalía, ya que se distinguen
dos puntos azules del mismo tamaño y un punto rojo
correspondiente al cromosoma Y y un punto verde
correspondiente al cromosoma X, esto indica que el
Imagen 1 C.21, C.13 Imagen 2C.18, C.Y, C.X paciente es un hombre.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: sondas centroméricas (CEP)
• Imagen 1 → Trisomía del 21 (Síndrome de Down), ya que
se distinguen tres puntos rojos correspondientes al
cromosoma 21, frente a los dos puntos verdes
observados en la muestra control.
• Imagen 2 → No se detectan anomalías, ya que
observamos dos puntos verdes correspondientes al
cromosoma 18 y dos puntos azules correspondientes al
Imagen 1 Imagen 2 cromosoma X, por lo que se trata de una mujer
C.21, C.13 C.X, C.18 “normal”.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: sondas centroméricas (CEP)
• Muestra A → no se detecta anomalía, se trata de un
hombre normal.
• Muestra B → trisomía 21 (Síndrome de Down). Ya que se
observan tres puntos verdes correspondientes al
cromosoma 21.
• Muestra C → El cromosoma 18 está normal, pero
observamos que el paciente presenta dos cromosomas X
y un cromosoma Y, por lo que presenta síndrome de
Klinefelter (XXY).
• Muestra D → Se trata de un hombre, ya que se observa
un cromosoma X y un cromosoma Y, que presenta
trisomía del cromosoma 18 (Síndrome de Edwards).
Técnica: FISH
Tipo de sonda: centromérica (CEP) X verde
telomérica (TELxp), porque va contra el brazo
largo.
• Si se trata de un hombre, no se detecta ninguna
anomalía.
• Si se tratase de una mujer se detecta una monosomía del
cromosoma X, por lo que se diagnostica Síndrome de
Turner. Para que no hubiese anomalía debería de haber
dos cromosomas X.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: sonda de fusión verde para el cromosoma 22 y
sonda de fusión roja para el cromosoma 9.
Anomalías detectadas: Leucemia linfocítica crónica, ya que se
han formado dos puntos amarillos como fusión de los puntos rojo
C. 22 y verde. Se observan dos puntos amarillos correspondientes a la
C. 9 traslocación de los cromosomas 9 y 22.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: cariotipo espectral con sonda de pintado
cromosómico entero.
Anomalías detectadas: Se observan traslocaciones que afectan a
los cromosomas 1, 2, 3, 5, 7, 8 y 19.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: cariotipo espectral con sonda de pintado
cromosómico entero
Anomalías detectadas: Se observan diferentes trisomías (trisomía
del cromosoma 8, trisomía del cromosoma 19 y trisomía del
cromosoma 20). Además, se observa una traslocación entre el
cromosoma 6 y el 8, otra entre el cromosoma 6 y el 17 y una
última traslocación entre el cromosoma 6 y el 18. Por último, se
ha producido una trisomía del cromosoma 8, ya que se observan
tres cromosomas en vez de dos.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: bandeo cromosómico multicolor.
Anomalías detectadas: El cromosoma de la izquierda es más
grande que el otro, por lo que ha ganado material genético en el
telómero y en la banda central.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: sonda de fusión con marcado verde para el
cromosoma 17 y rojo para el cromosoma 7.
Anomalías detectadas: se ha producido una traslocación entre el
cromosoma 7 y el 18, ya que hay dos puntos rojos y uno verde.
Esta traslocación hace que se forme el punto amarillento.
Todas muestran lo mismo: 2 puntos rojos

(c.7), 1 punto verde (c.17) y 1 amarillo.
Técnica: FISH
Tipo de sonda: sonda de fusión.
Anomalías detectadas: se observa que el cromosoma de la
izquierda es más pequeño, por lo que se entiende que ha perdido
material genético, esto corresponde entonces a una deleción del
telómero y de la zona verde clarito de la parte superior.
ACTIVIDADES DE REPASO DEL TEMA.
1. Nombra las tres clases de técnicas de hibridación que existen según la localización física en que se
forma el híbrido sonda/secuencia diana y explica la diferencia que hay entre ellas.
- Hibridación sobre soporte sólido: una de las dos moléculas implicadas en la hibridación se fija a
un soporte sólido y la hibridación se realiza sobre él.
- Hibridación en medio líquido: la hibridación se produce en una solución líquida.
- Hibridación in situ: la hibridación se produce en las mismas estructuras celulares que contienen
los ácidos nucleicos, sin necesidad de extracción previa.
2. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones:
a. El dot blot permite detectar secuencias específicas de ADN y ARN y además aporta
información sobre el tamaño de la secuencia diana.
Falsa, el dot blot permite detectar secuencias específicas de ADN y ARN, pero no
proporciona información sobre el tamaño de la secuencia diana. El tamaño de la secuencia
se determina mediante técnicas adicionales.
b. El Southern blot se utiliza para detectar secuencias de ARN y el Nothern blot para
detectar sondas de ADN.
Falsa, el Southern Blot se utiliza para detectar secuencias de ADN, mientas que el Northern
Blot se utiliza para detectar secuencias de ARN.
c. En el dot blot hay que desnaturalizar la muestra antes de aplicarla a la membrana.
Verdadera.
d. En las técnicas de hibridación sobre membrana, antes de la hibridación hay que anclar los
ácidos nucleicos de la muestra a la membrana de la muestra membrana.
Verdadera.
e. En las técnicas de hibridación en membrana, ésta se puede rehibridar varias veces,
independientemente del marcador utilizado en las sondas.
Falsa, en las técnicas de hibridación en membrana la rehibridación múltiple puede conducir
a una disminución en la señal detectada debido al desgaste de las sondas y la competencia
con las secuencias previamente hibridadas. La posibilidad de rehibridación depende del
tipo de sonda y de las condiciones de hibridación.
3. A continuación, se muestra el resultado obtenido con una técnica de ASO dot blot para estudiar
tres variantes alélicas de un gen (normal o WT, variante 1 o V1 y variante 2 o V2) en diez
individuos. Explica el resultado obtenido en cada individuo.
- Homocigotos normales: individuos 2, 3 y 5.

- Homocigoto variante 1: individuo 6.
- Homocigoto variante 2: individuo 9.
- Heterocigotos variante 1: individuos 4, 8 y 10.
- Heterocigoto variante 2: individuo 7.
- Heterocigoto variante 1 y 2: individuo 1.
4. A continuación, tienes una lista de algunas operaciones que se ejecutan en las técnicas de Suthern
Blot y Nothern Blot. Construye en tu cuaderno una tabla con tres columnas siguiendo el ejemplo
de abajo. En la columna de la izquierda coloca las operaciones que solo se realicen en el Southern
Blot, en la columna central las operaciones comunes a ambas técnicas y en la Columba de la
derecha las operaciones exclusivas del Nothern Blot. Además, ordena las operaciones de cada
columna por el orden en que se ejecutan en cada técnica.
• Autorradiografía.
• Desnaturalización alcalina.
• Hibridación con sonda marcada.
• Electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes.
• Anclaje de ADN/ARN a la membrana mediante calor o UV.
• Incubación con solución de prehibridación.
• Digestión enzimática.
• Transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
• Lavado poshibridación.
• Electroforesis en gel en condiciones estándar.
SOUTHERN BLOT COMUNES NOTHERN BLOT
Digestión enzimática
Electroforesis en gel en Electroforesisi en gel en
condiciones estándar condiciones desnaturalizantes
Desnaturalización alcalina
Transferencia desde el gel a
una membrana de
nitrocelulosa o nailon
Anclaje de ADN/ARN a la
membrana mediante calor o
UV
Incubación con solución de
prehibridación
Hibridación con sonda
marcada
Lavado posthibridación
Autorradiografía
5. Respecto de la hibridación genómica comparada (CGH) di si son verdaderas o falsas las siguientes
afirmaciones. Razona en el caso de las afirmaciones falsas.
a. En los estudios de CGH se compara el ADN de una muestra problema con un ADN de
referencia.
Verdadera.
b. La CGH permite detectar todo tipo de anomalías genéticas, tanto estructurales
(traslocaciones e inversiones), como cuantitativas (deleciones y duplicaciones).
Falsa, la CGH compara las secuencias de ADN presentes en la muestra problema con las
secuencias presentes en el ADN de referencia y por ello soo permite detectar pérdidas o
ganancias de material genético.
c. Para su realización se marcan el ADN problema y el ADN de referencia con fluorocromos
diferentes.
Verdadera.
d. La hibridación se puede realizar sobre cromosomas en metafase o sobre microrrays.
Verdadera.
6. Señala varias similitudes y diferencias entre los dos principales métodos de hibridación en medio
líquido: captura de híbrido y ADN ramificado.
Similitudes:
- En ambas se utilizan sondas sin marcar.
- La detección del híbrido se realiza en pocillos de placa microtiter.
- La detección del híbrido se realiza por quimioluminiscencia.
Diferencias:
- En la captura de híbrido se utiliza una única sonda específica, mientras que en el ADN
ramificado se utilizan dos sondas específicas (sonda para captura y sonda de extensión).
- La captura de híbrido se realiza con un anticuerpo anti-ARN/ADN, mientras que en la técnica de
ADN ramificado se realiza con un oligonucleótido de captura.
- En la captura de híbrido la detección del híbrido se realiza con un anticuerpo marcado con
enzima, mientras que en el ADN ramificado se utilizan secuencialmente varios oligonucleótidos
de amplificación.
7. En un estudio de expresión génica sobre un microrray, el ADNc de una población de células
tumorales se marca con un fluorocromo verde y un ADNc de una población de células normales
de referencia se marca con un fluorocromo rojo. A continuación, se representan los resultados de
fluorescencia observados en cinco puntos de la matriz del microrray que contienen sondas para
detectar los ADNc correspondientes a ARNm específicos de cinco genes concretos (genes 1-5).
Asocia cada fluorescencia (cada gen) con uno de los grados de expresión génica relacionados a la
derecha (letra) y razona la respuesta.
- Gen 1 – B (infraexpresión)
La fluorescencia naranja indica que en ese punto ha hibridado un numero mayor de moléculas
de ADNc de referencia (roja) que del ADNc de la muestra problema (verde). Esto quiere decir
que hay una infraexpresión del gen en las células tumorales.
- Gen 2 – D (expresión de un gen normalmente reprimido)
La fluorescencia verde indica que en ese punto solo han hibridado moléculas de ADNc de la
muestra problema. Esto significa que en las células normales este gen no se expresa.
- Gen 3 – A (expresión normal)
La fluorescencia amarilla indica que en ese punto han hibridado ambos ADNc en la misma
proporción, por lo que ese gen se expresa en las células tumorales de manera normal.
- Gen 4 – E (represión de un gen normalmente expresado)
La fluorescencia roja indica que en ese punto sólo han hibridado moléculas de ADNc de
referencia, lo que significa que ese gen está reprimido en las células tumorales y, por tanto, no
se expresa.
- Gen 5 – C (sobreexpresión)
La fluorescencia amarillo-verdosa indica que en ese punto ha hibridado un número mayor de
moléculas de ADNc de referencia, lo que se interpreta como una sobreexpresión de ese gen en
las células tumorales.
TEMA 6: LAS TÉCNICAS DE PCR.
PRIMERAS ACTIVIDADES DE REPASO DEL TEMA.

1. Representa la formación de una horquilla y dimerización de los siguientes cebadores:
CEBADOR F: 5´-TACGGGTGCATGCACCCGAT-3´
CEBADOR R: 5´-GCCCCCACGTACGGCGGCCC-3´
2. Si tenemos la siguiente cadena de ADN y estos supuestos cebadores para una PCR, escribe la
cadena molde complementaria, indica qué cebador es R y cuál es F y cuál sería la secuencia diana:
5’-ATGGAGTGTCCGACTTCTACGAGGCGGAGCCGCGGCCCCCGATGAGCAGCTAG-3’
CEBADOR 1: 5’-AGTGTCCGA-3’
CEBADOR 2: 5’-GCTCATCGGG-3’
Cadena molde complementaria:
3´-TACCTCAACAGGCTGAAGATGCTCCGCCTCGGCGCCGGGGGCTACTCGTCGATC-5´
Cebador R: AGTGTCCGA
Cebador F: GCTCATCGGG
Secuencia diana:
5´-AGTGTCCGACTTCTACGAGGCGGAGCCGCGGCCCCCGATGAGCAGCTAG-3´
3. Indica cuáles serían unos cebadores adecuados, y por qué, para una PCR si se desea amplificar el
tramo comprendido señalado. Para poder diseñar ambos cebadores primero escribe la cadena
molde complementaria:
5’CAAATCGTAAACAACTAAAAAATGTTTGCCGGTCGTTTGATGGTCCGTTCGATCGTTGGTCGGGCA
TGCTTGGCCACCATGGGCAGGTGGTCAAAGCCCCAAGCACACGCCAGCCAAGT- 3’
Cebador F: 5’-CAAATCGTAAACAACTAAA-3’
Cebador R: 5’-CTTGGCTGGCGTGTGCTT-3’
4. Sobre las ADN polimerasas termoestables:
a. Indica las dos características principales que debe tener una ADN polimerasa para que se
pueda utilizar en PCR y explica por qué.
o Temperatura óptima de polimerización (entre 70 y 75ºC). Esto permite realizar la
hibridación de los cebadores al ADN molde en condiciones de alta rigurosidad,
aumentando la especificidad de la PCR.
o Estabilidad durante tiempos prolongados a 94ºC, por lo que mantiene su actividad
después de las fases de desnaturalización.
b. Explica la diferencia entre ADN polimerasa con actividad correctora y otra sin actividad
correctora.
Las ADN polimerasas con actividad correctora tienen actividad exonucleasa 3´ - 5´, por lo que
puede eliminar nucleótidos incorporados erróneamente durante la polimerización. Mientras
que las ADN polimerasas sin actividad correctora no tienen actividad exonucleasa 3´- 5´, por lo
que no pueden corregir los errores producidos durante la polimerización.
c. Una ADN polimerasa tiene una temperatura óptima de polimerización de 42ºC y mantiene su
actividad tras dos horas a 100ºC ¿Puede usarse esta enzima en PCR? Razona la respuesta.
No podrá usarse, puesto que la fase de extensión habría que realizar la a 42ºC y a esa
temperatura los cebadores hibridarán inespecíficamente y darán lugar a productos
inespecíficos. La temperatura de extensión ha de ser siempre superior a la temperatura de
hibridación de los cebadores para poder evitar este problema.
5. Indica la temperatura de hibridación usando las dos fórmulas para los cebadores:
𝐹ó𝑟𝑚𝑢𝑙𝑎 1: 𝑇𝑚 = 4 × (𝐶 + 𝐺) + 2 × (𝐴 + 𝑇) = 4 × (3 + 7) + 2 × (6 + 4) = 60º𝐶
675
𝐹ó𝑟𝑚𝑢𝑙𝑎 2: 𝑇𝑚 = 81,5 + (0,41 × %𝐺𝐶) − = 68,25º𝐶
20
6. Indica los productos de amplificación que se obtienen en una PCR tras:
a) 28 ciclos → 228 = 268435456 productos
b) 17 ciclos → 217 = 131072 productos
c) 37 ciclos → 237 = 137438953472 productos
d) 38 ciclos → 238 = 274877906944 productos
7. Haz una lista con los componentes de una mezcla estándar de PCR y explica la función de cada
uno de ellos en la reacción.
- Tampón de reacción: aporta la concentración salina adecuada y establece el pH óptimo para la
actividad de la ADN polimerasa.
- MgCl2: El Mg+2 es el cofactor imprescindible para que la ADN polimerasa tenga actividad.
- dNTPs: han de estar libres en la solución para que la ADN polimerasa puede ir incorporándolos
a la cadena que está en crecimiento.
- Cebadores: al hibridar con sus respectivas secuencias diana forman cortas regiones en doble
hélice a las que se une la ADN polimerasa para elongarlos. Delimitan el fragmento que se va a
amplificar.
- ADN polimerasa termoestable: responsable de la síntesis de amplicones, existiendo los
cebadores mediante la incorporación de dNPTs que hay en la solución y copiando el ADN
molde.
- Agua de grado de PCR: completa el volumen de reacción para que todos los componentes se
encuentren a la concentración deseada.
8. Calcula la cantidad de cada reactivo que necesitamos para preparar una mezcla para realizar una
PCR con un volumen total de mezcla de 50µl
9. Queremos reproducir las siguientes condiciones de una PCR que hemos leído en una publicación
científica:
- Volumen final de la mezcla de reacción para una PCR: 25 µl.
- Concentración final de MgCl2: 1,5 mM.
- Concentración final de dNTPs: 200 µM cada uno.
- Concentración final de cada cebador (F y R): 400nM/L
- Taq ADN polimerasa: 1 U/25 µl.
- Tampón de reacción 1X
Para ello tenemos un kit de PCR que consta de los siguientes reactivos:
- Tampón de reacción 10x.
- MgCl2 25 mM.
- Solución de dNTPs con una concentración total de 10 mM.
- Cebadores F y R con una concentración de 10 pmol/µl cada uno.
- Taq ADN polimerasa con una concentración de 2 U/µl.
Calcula las cantidades de cada componente para preparar una mezcla de reacción para 10 PCR
teniendo en cuenta que en cada PCR se añadirá 1 µl de ADN molde.
Tampón de reacción → 25 x 1/10=2,5

MgCl2 → 25 x 1,5/25=1,5
dNTPs → 25=200/10 x 1/1000=05*4=2
Cebadores → 25 x 400/1 x 1/10 x 1/106 x 103/1=1
Taq → 25 x 14/25/24=0,5
Vf-Vmezcla=25-(8,5+1)=15,5 µl
Vt mezcla máster= 13x24=312 µl
10. Indica la finalidad de cada tipo de variante de PCR.
- PCR Convencional (PCR estándar):
• Amplificación específica de un fragmento de ADN.
• Clonación de genes.
• Secuenciación de ADN.
• Diagnóstico molecular.
- PCR en Tiempo Real (PCR en tiempo real o qPCR):
• Cuantificación precisa de la cantidad inicial de ADN o ARN.
• Detección y cuantificación de expresión génica.
• Análisis de la cinética de amplificación.
- PCR Múltiple (Multiplex PCR):
• Amplificación simultánea de múltiples fragmentos de ADN en un solo tubo de reacción.
• Análisis de múltiples marcadores genéticos.
• Aumento de la eficiencia y economía del proceso.
- PCR de Transcriptasa Inversa (RT-PCR):
• Amplificación de ARN en ADN complementario (cDNA).
• Análisis de la expresión génica.
• Estudio de la actividad transcripcional.
- PCR Anidada (Nested PCR):
• Aumenta la especificidad y sensibilidad de la PCR convencional.
• Útil cuando el objetivo de PCR es raro o está en baja concentración.
- PCR Degenerada (Degenerate PCR):
• Amplificación de secuencias de ADN que son altamente conservadas, pero con variaciones
en ciertas regiones.
• Identificación y clonación de genes homólogos de diferentes especies.
11. Se analizan seis muestras mediante una PCR para detectar la presencia de citomegalovirus. La
PCR se realiza con cebadores específicos para amplificar un fragmento de 250 pb del genoma
viral, junto con cebadores específicos para amplificar un fragmento de 400 pb del gen de la ß-
globina como control positivo. Finalizada la reacción, se realiza una electroforesis en gel de
agarosa al 2% de los productos de cada reacción (líneas 2 a 7), junto con un marcador de tamaños
en la línea 1. Indica el resultado obtenido en cada muestra y razona las respuestas.
- Línea 1: marcador de tamaños.
- Línea 2: resultado positivo, se observa la banda de 250pb específica del fragmento amplificado
del genoma de CMV y la banda de 400pb del control positivo.
- Línea 3: resultado positivo con productos de amplificación inespecíficos. Esto lo sabemos
porque aparece una banda inespecífica de menos de 100pb.
- Línea 4: PCR no válida, ya que solo se han amplificado productos inespecíficos. Se deberá
repetir la PCR modificando las condiciones e intentar conseguir una mayor especificidad.
- Línea 5: no ha habido amplificación, probablemente por presencia de inhinidores de PCR en la
muestra. Se deberá repetir a partir de una nueva muestra o intentar purificar la muestra
original mejor.
- Línea 6: resultado negativo, no hay banda específica de CMV, pero sí hay banda de control
positivo.
- Línea 7: PCR no válida, ya que, aunque hay banda específica de CMV no hay banda de control
positivo. Además, aparece una banda inespecífica de menos de 100pb, por lo que no se puede
saber si la banda de 250pb es específica o es un producto no deseado. Habría que reperirla
mejorando las condiciones de especificidad.
SEGUNDAS ACTIVIDADES DE REPASO DEL TEMA.

1. Empareja en tu cuaderno cada tupo o variantede PCR con las enzimas o cebadores que se utilizan
en ellas.
1. PCR múltiple: Varias parejas de cebadores en la misma PCR.
2. PCR de grandes fragmentos: ADN polimerasa sin actividad correctora + ADN polimerasa con
actividad correctora.
3. PCR anidada (nested-PCR): Dos cebadores externos y dos cebadores internos en dos PCR
consecutivas.
4. Hot Start PCR: ADN polimerasa inactiva hasta que se alcanza la temperatura de
desnaturalización por primera vez.
5. RT-PCR: Transcriptasa inversa + ADN polimerasa termoestable.
6. PCR de alta afidelidad: ADN polimerasa con actividad correctora.
2. A partir de una molécula de ARNm, dibuja un esquema de la transcripción inversa y los tres
primeros ciclos de PCR de una RT-PCR, en la que se usa un cebador poli-T para obtener ADNc.
¿Cuántos amplicones de ADNc bicatenario específicos se obtienen al final del tercer ciclo?
3. Completa en tu cuaderno las siguientes afirmaciones sobre la PCR a tiempo real, tachando lo que
no proceda.
a. Cuando se usan agentes intercalantes:
➢ La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/extensión de cada ciclo.
➢ La fluorescencia aumenta/disminuye con el número de ciclos.
b. Cuando se utilizan sondas de hidrólisis o sondas TaqMan:
➢ La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/extensión de cada ciclo.
c. Cuando se utilizan balizas moleculares:
➢ Se excita el notificador/quencher y se mide la fluorescencia emitida por el
notificador/quencher.
d. Cuando se utilizan sondas FRET:
➢ Se excita el notificador/quencher y se mide la fluorescencia emitida por el notificador
quencher.
4. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones. Razona la respuesta en las falsas.
a. En la qPCR el punto de corte (Cp) es el ciclo en el que se pasa de la zona de ruido a la zona de
crecimiento exponencial en la curva de amplificación.
Verdadero.
b. El Cp de una muestra es directamente proporcional a la concentración inicial de la molécula
diana en la muestra. A mayor concentración inicial mayor Cp.
Falso, la relación entre el Cp y la concentración inicial de la molécula diana en la muestra es
inversamente proporcional. A mayor concentración inicial de la molécula menor será el Cp, por
lo que se necesitan menos ciclos de amplificación para obtener una cantidad de amplicón
superior al límite de detección del termociclador.
c. En la curva de picos de fusión por un termociclador a tiempo real se observan tantos picos
como productos amplificadores con distintas Tm (específicos y no específicos) se hayan
sintetizado durante la PCR.
Falso, la cuerva de fusión se realiza con agentes intercalantes, que emiten un máximo de
fluorescencia cuando todo el ADN está en doble hélice y va disminuyendo a medida que el ADN
se desnaturaliza.
TEMA 7: CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
1. ¿Qué es la clonación molecular? Enumera sus ventajas como técnica de amplificación de ADN.
¿Qué tres elementos son imprescindibles para clonar una molécula de ADN?
La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de
ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante.
Ventajas de la técnica:
- Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de una secuencia concreta.
- Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño.
- Posibilita la obtención de bibliotecas genómicas, cromosómicas o de ADNc.
- La secuencia amplificada puede traducirse a proteína si se utilizan vectores de expresión.
2. Define los siguientes conceptos:
a) Vector de clonación: molécula de ADN que puede replicarse autónomamente en una célula
hospedadora y que permite la inserción de ADN extraño sin perder esa capacidad de
replicación autónoma.
b) Vector recombinante: tipo de vector de clonación que contiene un inserto de ADN extraño.
c) Inserto: ADN exógeno que se une a un vector en el interior de una célula hospedadora durante
la clonación.
d) Célula hospedadora: célula en la que se introduce el vector de clonación para su amplificación
mediante replicación.
3. Empareja cada vector de clonación con su característica correspondiente.
1. Cósmidos: vector híbrido que contiene parte de un plásmido y las secuencias COS del fago λ.
2. BC: es un vector basado en un plásmido natural de E Coli llamado Factor F.
3. Fago λ: vector lineal en el que se puede sustituir la región central por un inserto de ADN
extraño.
4. Plásmido: molécula circular de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano.
5. YAC: contienen un centrómero y sendas secuencias teloméricas en los extremos.
6. Fagémido: vector híbrido que contiene parte de un plásmido y el origen de replicación del fago
M13.
4. Dibuja un esquema de un vector de clonación plasmídico y del fago λ con sus componentes
principales y explica la función de cada uno de ellos.
- Origen de replación: necesario para la replicación autónoma del plásmido en el interior de la
bacteria huésped.
- Marcador de selección: permite seleccionar las bacterias transformadas con el vector de las no
transformadas.
- Marcador de identificación: permite identificar las bacterias transformadas con el vector
recombinante.
- Polylinker: agrupa múltiples dianas de restricción únicas para poder insertar moléculas de ADN
extraño.
5. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones. Justifica la respuesta:
a) Mediante el proceso denominado transformación, cualquier bacteria puede captar e
internalizar moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo.
Falso, cualquier bacteria no puede ser transformada, sólo van a poder las moléculas
competentes.
b) La transfección es un método para introducir vectores recombinantes en bacterias
infectándolas con un virus.
Falso, la transfección consiste en la introducción de vectores recombinante en células
eucariotas por métodos que no implican virus, fundamentalmente por métodos químicos.
c) La introducción de vectores recombinantes en células hospedadoras mediante virus se
denomina transducción.
Verdadero.
d) En la electroporación, la introducción de vectores recombinantes en bacterias se consigue
mediante un láser que produce nanoporos en la pared y en la membrana plasmática.
Falso, la electroporación se realiza aplicando pulsos eléctricos de alto voltaje.
6. Explica las diferencias que hay entre una biblioteca genómica, una biblioteca cromosómica y una
biblioteca de ADNc.
Biblioteca genómica: contiene el genoma completo de un organismo, incluyendo tanto las
secuencias codificantes como las no codificantes.
Biblioteca cromosómica: sólo contiene todas las secuencias presentes en un único cromosoma o
fracción cromosómica.
Biblioteca de ADNc: contiene el ADNc correspondiente a todos los ARNm presentes en una
población celular en un momento concreto y por lo tanto es un fiel reflejo de todos los genes que se
están expresando en ese momento. Solo contienen las secuencias codificantes de cada gen, sin
intrones.
7. Una suspensión de E. coli sensible a la ampicilina, la tetraciclina, el cloranfenicol y la lactosa
negativa se transforma con un vector recombinante, obteniéndose una mezcla de bacterias no
transformadas y transformadas con el vector recombinante o con el vector no recombinante.
Explica cómo realizarías la selección e identificación de los clones recombinantes en los siguientes
supuestos:
a) El vector es un plásmido con un gen de resistencia a la ampicilina, un gen de resistencia a la
tetraciclina y un polylinker en el centro del gen de resistencia a la ampicilina.
b) El vector es un BAC con un gen de resistencia al cloranfenicol, un gen letal para la bacteria y
un polylinker en el centro del gen letal.
c) El vector es un cósmido con un gen de resistencia a la tetraciclina, un gen LacZ y un polylinker
en el centro del gen LacZ.
d) El vector es un plásmido con un gen de resistencia a la ampicilina, el gen que codifica para la
GFP y un polylinker en el centro del gen GFP.
8. El siguiente dibujo representa un esquema del proceso de clonación de una molécula de ADN
utilizando un plásmido como vector. Suponiendo que el plásmido contiene un gen de resistencia a
la ampicilina y el gen LacZ con una diana de restricción en su interior, completa el dibujo con las
siguientes palabras:
Ligasa
Escherichia coli
Enzima de restricción
Ampicilina
Plásmido recombinante
Fragmentos de ADN con extremos cohesivos
Bacterias transformadas
Colonias con vector recombinante
Colonias con vector no recombinante
X-gal (sustrato cromogénico)
Plásmido linearizado con extremos cohesivos
A la izquierda del esquema hay cuatro recuadros para indicar las fases del proceso de clonación
que se indican a continuación desordenadas: transformación, digestión, selección e identificación,
ligación.
Enzima de restricción
Digestión
Plásmido lineralizado con Fragmentos de ADN con
extremos cohesivos extremos cohesivos
Ligasa
Ligación
Plásmido recombinante Escherichia Coli
Transformación
Bacterias transformadas
Selección e identificación Ampicilina

X-gal
Colonias con vector
recombinante Colonias con vector no recombinante
TEMA 8: MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

1. Respecto del método químico de secuenciación de Maxam y Gilbert, responde si son verdaderas o
falsas las siguientes afirmaciones. Justifica las afirmaciones que te parezcan falsas.
a) Se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas
específicas.
Verdadero.
b) Es un método que requiere marcaje radiactivo con 32P. El marcaje se introduce en cada base
nitrogenada durante la reacción química de modificación.
Falso, en el primer paso se marca uno de los extremos, normalmente 5´. Para ello se eliminará
el fosfato del nucleótico 5´ con una fosfatasa alcalina y se vuelve a fosforilar con ATP marcado
con P32 y un polinucleótido.
c) La muestra se divide en cuatro tubos y en cada uno de ellos se realiza una reacción química
específica que modifica una de las cuatro bases.
Falso, solo dos reacciones modifican una base concreta, las otras dos reacciones existentes
modifican las bases púricas y las pirimidínicas.
d) Las reacciones químicas generan fragmentos de distintas longitudes que se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Los productos de las
cuatro reacciones químicas se corren en paralelo en calles adyacentes del mismo gel.
Verdadero.
e) La lectura del gel se realiza iluminándolo con luz UV y obteniendo una fotografía.
Falso, se realiza una autorradiografía.
2. En la secuenciación química de un oligonucleótido de ADN se ha obtenido la siguiente imagen
autorradiográfica. ¿Cuál es la secuencia del oligonucleótido?
3´
T
C
C
A
G
A
C
T
T
A
G
A
G
G
T
A
C
C
G
T
5´
3. De todos los reactivos que se listan a continuación, ¿cuáles utilizarías para realizar la reacción de
polimerización en el tubo correspondiente a las adeninas según el método original de
secuenciación de Sanger?
- Hebra de ADN molde bicatenaria - dCTP
- Hebra de ADN molde monocatenaria - dGTP
- Cebador marcado con 32P - dTTP
- Cebador marcado con fluoróforo - ddATP
- Cebador sin marcar - ddCTP
- ADN polimerasa convencional - ddTTP
- Taq polimerasa - ddGTP
- dATP
¿Cuál es la diferencia con los tubos correspondientes a guanina, citosina y timina?
Utilizaría: hebra de ADN molde monocatenaria, cebador macado con P32, ADN polimerasa
convencional, dATP, dCTP, dGTP, dTTP y ddATP.
La diferencia con los otros tubos es el ddNTP usado en cada uno de ellos, Todos los reactivos son
comunes excepto el ddNTO, que para el tubo de adenina es ddATP, para el tubo de citosina es
ddCTP, para el tubo de guanina ddGTO y para el tubo de timina es ddTTP.
4. Mediante secuenciación enzimática por el método original de Sanger de un oligonucleótido de
ADN se ha obtenido la siguiente imagen autorradiográfica. ¿Cuál es la secuencia del
oligonucleótido?
3´
C
G
A
C
G
A
G
G
T
T
G
C
A
C
C
G
T
C
G
A
5´
5. Haz un esquema de los geles de secuenciación por el método de Maxam y Gilbert y por el método
de Sanger del siguiente oligonucleótido:
5’ - AGCTTCGAAC - 3’
G A+G T+C C
6. Se han secuenciado dos oligonucleótidos con métodos de 1ª generación. Descifra la secuencia de

ambos a partir de los respectivos electroferogramas, teniendo en cuenta que en el caso a) se
utilizó un cebador forward y en el caso b) un cebador reverse. La interpretación de los colores es
negro - G, azul - C, verde - A y rojo - T.
a) 5'-GTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAA-3´
b) 5'-ACGGAAAATTTTTTAACAAATTGTT-3´
7. Realiza una tabla con las técnicas de secuenciación de segunda generación indicando los métodos
de amplificación y secuenciación utilizados en cada uno.
Técnica de Secuenciación Método de Amplificación Método de Secuenciación

Secuenciación por Síntesis PCR emulsionada (emPCR) o Secuenciación por síntesis fluorescente
(SBS) amplificación puente (fluorescent base incorporation)
Secuenciación por Ligación Secuenciación por ligación (ligation-based
(SBL) Amplificación en clúster sequencing)
Secuenciación por Híbridos Amplificación puente o Secuenciación por síntesis fluorescente o
(SBS o SBL) amplificación en clúster secuenciación por ligación
Secuenciación por Secuenciación por complementación
Complementación (CSS) Amplificación en clúster (complementary strand sequencing)
8. Describe con una frase en qué se basan los métodos de tercera generación que hemos visto. Indica
las ventajas e inconvenientes de cada una.
s
9. Elabora una tabla con todos los métodos de secuenciación que hemos visto y compara los tamaños
máximos del AN a secuenciar y la velocidad de secuenciación.
Característica 1ª Generación 2ª Generación
No es necesario fragmentar el ADN El ADN se fragmenta al azar y se unen
Fragmentación para secuenciar un fragmento adaptadores universales a los extremos de los
del ADN concreto. fragmentos.
Se utilizan cebadores específicos del Se utiliza sólo un par de cebadores
Cebadores fragmento que se quiere secuenciar. universales.
Fijación del ADN El ADN molde que se va a secuenciar Los fragmentos de ADN molde se fijan a
molde no se fija a ningún soporte sólido. soportes sólidos.
Las reacciones de secuenciación son Se realizan múltiples (cientos de miles o
Reacciones de individuales, es decir, se secuencia un millones) de reacciones de secuenciación
secuenciación único fragmento en cada proceso. simultáneas.
Ambas metodologías son enzimáticas
basadas en reacciones de
polimerización catalizadas por ADN
Metodología polimerasa.
IMÁGENES UT 5 HIBRIDACIÓN IN SITU
SONDAS CENTROMÉRICAS
Técnica: FISH
Tipo de muestra:
cromosoma en
Técnica: FISH
metafase y núcleo en
Tipo de muestra:
interfase.
cromosoma en
Tipo de sonda:
metafase
Centromérica
Tipo de sonda:
Anomalía detectada:
Centromérica o de ADN
S de Down, presenta
satélite (CEP21 color
una triploidía del
rojo y CEP13 color
cromosoma 21.
verde)
Anomalía detectada:
Triploidía 69, XXY (se
observan tres copias
del cromosoma 21 (S
de Down) y tres copias
del cromosoma 14 (S
de Patau) en verde.
También podría ser una
doble trisomía).
SONDAS DE PINTADO CROMOSÓMICO
Técnica: FISH
Tipo de muestra:
cromosomas en
metafase
Tipo de sonda:
pintado
cromosómico,
color rojo, para el
cromosoma X
Anomalía
detectada: Xq+
(material
adicional en el
brazo largo del
cromosoma X
que conlleva
infertilidad. Se
observa el
cromosoma X
pintado de rojo y
una región
adicional en gris
sin marcar).
Núcleo en interfase
SONDAS DE SECUENCIA ÚNICA Cromosoma en metafase
Se observan dos señales

verdes correspondientes a
PACIENTE CON SÍNDROME DE WILLIAMS: la región 7q31, una en cada
microdeleción intersticial en el brazo largo del cromosoma y una señal roja
cromosoma 7 en el locus q11.23. para 7q11.23. Esto es
Se observan dos señales verdes de la sonda característico del S de
control y una sola señal roja de la copia única de la Williams.
región ELN, propia del síndrome de Williams. Técnica: FISH
Técnica: FISH Tipo de muestra: núcleo en interfase y cromosoma en
Tipo de muestra: Núcleo en interfase metafase.
Tipo de sonda: sondas de secuencia únicas o Tipo de sonda: sondas de secuencia única o
específicas de locus (LSI) rojo específicas de locus (LSI) rojo para el locus 7q11.23 y
Anomalía detectada: Síndrome de Williams sondas de secuencia única p específicas de locus (LSI)
(deleción en la región q11.23 del cromosoma 7. verde para el locus 7q31 (control).
Se deberían ver dos copias de la LSI y solo se ve Anomalía detectada: S de Williams (microdelección
una debido a la delección. Se ven dos copias de intersticial del brazo largo del cromosoma 7 en el locus
la sonda control). q11.23, una sola copia del gen ELN codifica para la
prot elastina, lo que provoca anormalidades del tejido
conjuntivo y trastornos cardiovasculares).
SONDAS TELOMÉRICAS
Técnica: FISH
Tipo de sonda: centromérica CEP rojo para todos los cromosomas
Telomérica TELp y TELq para todos los cromosomas verde.
Anomalía detectada: no se detecta anomalía.
RESUMEN DE TODAS LAS SONDAS VISTAS HASTA AHORA

ESTRATEGIAS PARA IDENTIFICAR TRASLOCACIONES
SONDAS DE SEPARACION/ Split / brak-apart
Se emplean para detectar translocaciones:
-Uno de los cromosomas implicados es
siempre el mismo.
-El otro puede variar.
La hibridación se realiza con un juego de
dos sondas marcadas en verde y rojo que
hibridan a ambos lados del punto de rotura
en el cromosoma que está siempre
implicado en la translocación.
Si NO existe translocación:
al hibridar tan próximas las
sondas, las fluorescencias
se superponen y se
observan dos puntos
amarillos o dos puntos
rojos y verdes
superpuestos con una zona
central amarilla.
Si SI existe translocación:
se observan tres puntos:
-Uno amarillo,
correspondiente al
cromosoma intacto
-Unos rojo y uno verde,
correspondientes a las dos
partes del cromosoma
traslocado.
Si no existe traslocación
Si existe traslocación
SONDAS DE FUSIÓN Para detectar translocaciones cuando se conocen los dos cromosomas.
Si NO existe traslocación: Si existe traslocación:

- 2 puntos verdes, uno - Un punto verde:
correspondiente a un cromosoma 11 no traslocado
cromosoma y otro - Un punto rojo: cromosoma
correspondiente al otro 14 no traslocado
cromosoma - Dos puntos amarillos,
- 2 puntos rojos, uno correspondiente a los dos
correspondiente a un cromosomas derivados de la
cromosoma y otro traslocación, fusión de parte
correspondiente al otro del cromosoma 11 y parte del
cromosoma cromosoma 14
DETENCIÓN DE TRISOMÍAS Y TRIPLOIDÍAS MEDIANTE SONDAS DE SEPARACIÓN Y FUSIÓN

PINTADO DE CROMOSOMAS ENTEROS (WPC-FISH)
Técnica: FISH
Tipo de sonda: WPC-FISH, cromosoma 1 verde y
cromosoma 5 rojo
Anomalía detectada: ninguna, se ven los dos pares de
cromosomas normales.
BANDEO CROMOSÓMICO MULTICOLOR (mBand)

FISH multicolor del cromosoma 1 obtenido con sondas para pintado de bandas
específicas y posterior tratamiento informático del espectro de fluorescencia.
CARIOTIPO ESPECTRAL (SKY)

ISH CROMOGÉNICA (CISH)
DEPARTAMENTO DE SANIDAD
Ciclo Formativo: LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO Curso: 1º
Módulo: Biología Molecular y Citogenética
Curso escolar: 2023-24 Ejercicio: Práctica 1 NanoDrop Evaluación: 2ª
Fecha aprobación: 06-12-2023 Fecha realización ejercicio: 13/12/2023
Ficha elaborada y aprobada por: Patricia Pascua R.
DATOS DEL ALUMNO Calificación:

Apellidos: Núñez Rodríguez.
Nombre: Paula Nº: 18
EJERCICIO PRÁCTICO: MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN Y PUREZA DE ADN EN

NANODROP.
INTRODUCCIÓN:
La medición precisa de la concentración y pureza del ADN es esencial en los
laboratorios de biología molecular. El NanoDrop es una herramienta ampliamente
utilizada para esto debido a su capacidad para cuantificar la concentración de ácidos
nucleicos y evaluar su pureza en muestras de ADN.
FUNDAMENTO:
El NonoDrop utiliza la espectrofotometría UV-VIS para
medir la absorbancia de la luz a diferentes longitudes
de onda por las moléculas presentes en la muestra. El
ADN absorbe la luz ultravioleta a una longitud de onda
aproximada de 260nm, mientras que las impurezas,
como proteínas o nucleótidos, absorben la luz a una
longitud de onda de 280nm. La relación de absorbancia
entre 260nm y 280nm se utiliza para evaluar la pureza
del ADN, mientras que la absorbancia a 260nm se
utiliza para calcular la concentración.
OBJETIVO:
El objetivo principal de aprender a manejar el NanoDrop y aprender a analizar los
resultados que este nos muestra. Se debe tener en cuenta que antes de realizar la PCR
debemos comprobar que el ADN extraído está suficientemente puro y tiene pocas
proteínas contaminantes. Además, hay que saber si tenemos una concentración
adecuada para que la técnica se lleve a cabo de manera eficiente.
MATERIAL Y REACTIVOS :
• Micropipetas.
• Puntas con filtro.
• Muestra del ADN extraído mediante diferentes técnicas.
• Tampón TE.
TÉCNICA:
1. Descongelar las muestras de ADN obtenidas mediante las diversas técnicas de
purificación: salting out y cromatografía de absorción.
2. Identificar bien cada una de las muestras.
3. Asegurarnos que el ácido nucleico del eppendorf está bien resuspendido y
homogenizado.
Pasos para realizar la lectura en el NanoDrop:
1. Encender el NanoDrop y dejar que estabilice según las instrucciones del
fabricante.
2. Preparación de la superficie de medición. Antes de realizar la lectura de la
muestra debemos asegurarnos de que no haya ningún componente que pueda
alterar el resultado, para ello limpiaremos la superficie de medición del
NanoDrop con un paño limpio y sin pelusa. Tras ello, utilizaremos un paño
humedecido con agua ultrapura para eliminar cualquier residuo.
3. Preparación de la muestra. Debemos cargar una pequeña cantidad de la
muestra de ADN en el NanoDrop con una micropipeta. Antes de ello hemos de
comprobar que la muestra está bien mezclada y libre de burbujars de aire.
4. Seleccionar el tipo de muestra que hemos cargado y la longitud de onda
deseada para la lectura en el software del NanoDrop. En este caso como lo que
cargamos es una muestra de ADN y lo que queremos es medir la pureza de la
muestra debemos seleccionar: ADN, 260nm y 280nm.
5. Realizar la lectura. Para ello cerraremos la tapa y pulsaremos el botón de
“medir”.
6. Anotar los resultados obtenidos en la lectura.
7. Limpiar la superficie de medición del NanoDrop nuevamente con un paño
limpio y sin pelusa humedecido con agua ultrapura para eliminar cualquier
residuo de la muestra.
RESULTADO:
Tras la realización de la práctica se obtendrán valores de absorbancia a 260nm y
280nm para cada muestra de ADN cargada, así como la relación de absorbancia
260/280. Utilizando estos valores se deberá calcular la concentración de ADN y se
evaluará su pureza. Los resultados proporcionarán información crucial sobre la calidad
y la cantidad del ADN presente en las muestras analizadas.
CUESTIONES:
1. ¿Qué solución has utilizado para realizar el blanco? ¿Por qué?
Para realizar el blanco se utilizó agua ultrapura. El propósito del blanco es
establecer una línea de base para la absorbancia, asegurando que cualquier
absorbancia medida en la muestra debe ser únicamente del ADN presente en la
muestra y no a impurezas en el agua u otros componentes presentes en el
NanoDrop. El agua ultrapura es ideal para este propósito, ya que no contiene
sustancias que absorban significativamente en la región de longitud de onda
utilizada para la cuantificación del ADN.
IMÁGENES REALIZADAS DURANTE LA PRÁCTICA:
Foto 1 Foto 2
Foto 3
LEYENDA:
Foto 1: resultado obtenido de la medición de la primera muestra.
Foto 2: resultado obtenido de la medición de la segunda muestra.
Foto 3: resultado obtenido de la medición de la tercera muestra.
Curso escolar: 2023-24 Ejercicio: Práctica 2 Integridad de ADN Evaluación: 2ª
Calificación:
DATOS DEL ALUMNO
EJERCICIO PRÁCTICO: INTEGRIDAD DEL ADN .

INTRODUCCIÓN:
La integridad del ADN es crucial en numerosos campos de la biología molecular y la
genética. La evaluación de la integridad del ADN se realiza comúnmente mediante la
electroforesis en gel de agarosa, una técnica que separa fragmentos de ADN en
función de su tamaño. Este proceso permite detectar la presencia de fragmentación o
degradación del ADN, lo que puede ser causado por diversos factores, como la
contaminación o la degradación.
FUNDAMENTO:
La calidad de los ácidos nucleicos se puede determinar, entre otros parámetros, por la
integridad de los ácidos nucleicos aislados y purificados. Para determinarla debemos
realizar una electroforesis de las muestras aisladas.
OBJETIVO:
Estudiar mediante electroforesis en el gel de agarosa la integridad del ADN extraído
por las distintas técnicas y verificar así su validez de cara a ser usado para una PCR.
MATERIAL:
• Equipo de electroforesis.
• Transiluminador.
• Matraz Erlenmeyer 250ml.
• Vaso de precipitado pequeño.
• Probeta.
• Vidrio de reloj.
• Espátula.
• Balanza.
• Microondas.
• Guantes térmicos.
• Cubeta y molde de electroforesis.
• Peine de electroforesis.
REACTIVOS:
• Agarosa.
• Tampón de carga 6X
• TAE 1X
• RedSafe TM
• Danablue TM
• Muestra de ADN
TÉCNICA:
1. Preparar TAE 1X a partir de TAE 50X
TAE 50X (100ml) La solución TAE 50X es una mezcla de Tris 2M, ácido acético
1M y EDTA 50mM. Para preparar 100ml de buffer TAE 50X necesitamos:
Tris ————————————2,42 g
EDTA———————————-0,1861 g
Ácido acético glacial ————- 0,571mL
Agua ultrapura ——————-- enrasa hasta 100ml
Posteriormente hacer la dilución adecuada a 1X: 20 ml TAE 50X+980 ml H2Od.
Necesitaremos 100ml de TAE 1X para cada mesa.
2. Preparar el gel de agarosa al 0,7%
Para ello pesamos 0.7 gr de agarosa y lo diluimos en 100 ml de solución tampón
TAE 1X.
En principio prepararemos 100 ml para el gel, pero después hay que tener en
cuenta la capacidad del molde que utilizaremos para prepararlo.
Ponemos los componentes en un erlenmeyer añadiendo primero el tampón y
luego la agarosa. Tapamos el Erlenmeyer con algodón para evitar que se salga
en el microondas.
Ponemos el microondas aproximadamente 2 minutos hasta que desaparezca la
turbidez y aparezca perfectamente transparente. Se recomienda controlarlo y a
los 30 segundos sacar y agitar un poco, repetir si fuera necesario durante esos 2
minutos.
Lo dejamos enfriar hasta que notemos que ya no quema pero que no se
solidifique.
Vamos a hacer 2 electroforesis: una para practicar, otra con muestras reales.
Para la primera: Diluir tampón de carga en agua destilada en proporción 1:9.
Preparamos 100µl por mesa. Mezclamos bien pero sin hacer burbujas. Esto lo
utilizaremos para practicar la carga del gel de agarosa.
Para la segunda: añadir dana blue marker 0.1% (80-100 µl) al gel cuando se esté
enfriando, pero antes de solidificar. También se puede utilizar RedSafe
(5µl/100ml). Esto nos permitirá visualizar las muestras de ADN en el gel con luz
UV. Además, hay que preparar las muestras de ADN que vayamos a analizar.
Para ello mezclamos en un eppendorf pequeño 20 µl de muestra con 5 µl de
tampón de carga para visualizar el avance de las muestras.
3. Preparar el molde.
Mientras se enfría el gel preparamos el molde, colocando los topes de metal y
sellando los bordes con papel de autoclave. Ponemos el peine.
Dejamos caer el gel sobre el molde y esperamos hasta que se solidifique
aproximadamente 10 - 15 minutos.
Retiramos los topes de metal y el papel de autoclave. Además retiramos el

peine del gel cuidadosamente para evitar romper los pocillos.
4. Preparar la cubeta
Colocamos el gel en la cubeta de electroforesis correctamente orientada con
los pocillos más cerca del polo negativo (color negro) y lo cubrimos con tampón
TAE 1X.
Cargar 20µl de muestra en cada pocillo del gel de agarosa, una vez que está
sumergido en TAE1X y montado en la cubeta de electroforesis. Asegurarse que
el gel está completamente cubierto de tampón. Para la primera electroforesis
no usamos muestra real, para la segunda sí.
5. Realizar la electroforesis.
Colocar los cables adecuadamente. Ten en cuenta que el ADN es aniónico (ión
negativo y va a moverse hacia el polo positivo. Insertar la clavija del cable negro
en la entrada de color negro de la fuente de corriente (entrada negativa).
Insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de
corriente (entrada positiva).
Someter a electroforesis a 100V hasta que veamos desplazarse las muestras.

Vigilar que los colorantes no salen fuera del gel. Después de 10 minutos
empezará a observarse la separación de las muestras. Después de que la
electroforesis ha terminado, apagar la fuente de corriente, desconectar los
cables y sacar la cubierta. Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca (si
no se dispone, una hoja de papel blanco también puede utilizarse) o a una
placa de luz ultravioleta, donde podremos observar las bandas del frente de
electroforesis y las muestras. Atención: la luz UV daña los ojos, se debe usar
con gafas especiales.
Para una correcta visualización de las bandas también puede teñirse el gel y así
ver todas las bandas correctamente.
6. Tinción del gel
a) No teñir los geles en la cubeta de electroforesis.
b) Colocar el gel en un recipiente con 100 ml de FlashBlue 0.75X, de forma que
quede completamente cubierto.
c) Incubar durante 10 minutos. Aumentar el tiempo de tinción conllevará a un
mayor número de lavados con agua a posteriori para eliminar el exceso de
colorante.
d) Guardar los 100 ml de FlashBlue 0.75 X para otras tinciones.
e) Colocar el recipiente con el gel debajo de un grifo de agua y dejar correr el
agua hasta que no salga de color azul. Sujetar el gel para no perderlo. Llenar el
recipiente con agua.
f) Cuidadosamente sacar el gel del recipiente y examinar el gel en un
transiluminador de luz blanca (si no se dispone, puede servir una hoja blanca).
En este paso se apreciarán las bandas pero el gel tendrá un color azul muy
intenso que no permitirá apreciar bien las bandas.
g) Realizar varios lavados con agua en agitación si es posible. Se observará
como cada vez se hacen más visibles las bandas y desciende el color azul de
fondo.
h) Si todavía tiene un color muy intenso de
fondo, es posible, dejarlo toda la noche en agua y
a la mañana siguiente observar el gel.
RESULTADO:
Tras la electroforesis en gel se observaron diferentes bandas de ADN indicativas de la
presencia de fragmentos de diferentes tamaños en la muestra. La aparición de bandas
claras y definidas sugiere la integridad del ADN, mientras que la presencia de bandas
difusas o la ausencia de bandas puede indicar fragmentación o degradación del ADN.
Al comparar las bandas obtenidas con un marcador de peso molecular conocido se
pudo determinar el tamaño aproximado de los fragmentos presentes en la muestra y
evaluar su integridad.
Curso escolar: 2023-24 Ejercicio: Práctica 3 Microarrays Evaluación: 2ª

EJERCICIO PRÁCTICO: MICROARRAYS.

INTRODUCCIÓN:
Los microarrays, también conocidos como chips de ADN, con herramientas poderosas
en la investigación genómica y en bología molecular. Estos dispositivos permiten
analizar la expresión génica a gran escula al detectar la presencia y la abundancia
relativa de miles de genes simultáneamente. El principio básico de los arrays implico la
hibridaciñon de sondas de ADN marcadas con muestras de ARN o ADN, seguida de
detección y cuantificación de las señales de la hibridación.
FUNDAMENTO:
La tecnología de microarrays de dos colores permite la comparación de los perfiles de
expresión de dos muestras diferentes (por ejemplo, células de la piel normal frente o
células de cáncer de piel). Hay cuatro pasos básicos que intervienen en un microarray
de dos colores:
1. Preparación de muestras: el ARNm total se extrae de las muestras control y
experimentales.
2. Síntesis de ADNc: se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir de
las muestras de ARN usando transcriptasa inversa (RT), una enzima que utiliza ARN
como molde para producir ADN. Las bibliotecas de ADNc son etiquetados con sondas
fluorescentes. El ADNc aislado de la muestra control es marcado con una etiqueta
fluorescente verde normalmente, mientras que cDNA aislado de la muestra
experimental se marca con un fluorescente rojo.
3. La hibridación: el cDNA marcado a partir de muestras control y experimentales se
pone en contacto con chip micromatriz, donde hibrida con el punto que contiene el
oligo con una secuencia complementaria. Estos resultados de hibridación dan lugar a
una hélice de doble cadena de ADN estable. Después de la hibridación, el chip se lava
varias veces para eliminar cualquier ADNc que no se ha unido a un oligo en el chip.
4. Búsqueda y Análisis de Datos: el chip se escanea con un láser que excita los
marcadores fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge
y se procesa mediante un programa especializado que crea una imagen en color de la
micromatriz. La imagen se analiza utilizando un programa que interpreta la
fluorescencia de cada punto.
El color y la intensidad de fluorescencia en cada punto permiten a los investigadores
identificar diferencias genéticas clave, como las que existen entre las células normales
de la piel y las células de cáncer de piel. La biblioteca de cDNA control representa el
nivel normal de expresión de genes en células de la piel. Si sólo se hibrida la biblioteca
del control en nuestro microarrays, diferentes puntos aparecerían con diferentes
intensidades de color verde. Manchas verdes brillantes indican los puntos que han
capturado los niveles altos de ADNc (lo que sugiere un alto nivel de expresión), y
manchas verdes débiles o negras sugieren que hay una baja (o no hay) expresión de
ARNm. A la inversa, si el mismo chip se hibridó exclusivamente con la biblioteca de
ADNc de cáncer de piel, se ven diferentes intensidades de color rojo. Cuando las dos
bibliotecas se hibridan simultáneamente para el mismo chip, se espera que aparezcan
cuatro colores en el análisis, color negro (sin expresión), verde, rojo o amarillo.
Aparecen manchas amarillas cuando el control y las muestras experimentales se
hibridan en cantidades equivalentes. Cuando aparece un punto verde nos indica la
presencia de más de ADNc a partir de la muestra de control (sanos) que de la muestra
experimental (célula enferma). Por lo tanto, un punto verde revela que hay menos
mRNA presente en la célula de cáncer de lo normal, y el gen se dice que tiene una
"baja expresión". Por el contrario, una mancha roja significaría que el gen tiene una
"elevada expresión" en la muestra del cáncer.
OBJETIVO:
El objetivo de esta práctica es comprender los conceptos básicos de la técnica de
Microarrays y como se aplica a la genómica funcional. Esta práctica es una simulación
que se ha diseñado para proporcionar a los estudiantes la oportunidad de analizar las
diferencias en la expresión génica utilizando un microarray de dos colores. En esta
práctica, analizaremos cuatro conjuntos de muestras simuladas de pacientes para
determinar diferentes niveles de expresión génica. Al final de la práctica, habréis
observado y analizado un experimento utilizando la técnica de Microarrays.
• Pacientes muestratras de microarrays QuickStrips TM (conservación en nevera).
• Equilibration Buffer (conservación en nevera).
• Control cDNA solution (conservación en nevera).
• Hidrolization Buffer (conservación en nevera).
• Microtubos.
• Tarjeta de microarrays.
• Ppera de volumen fijo (5µl).
• Tubos de micro centrífuga de 200µl.
• UV onda larga fuente de luz (linterna o transiluminador).
• Recomendado: estufa de incubación.
TÉCNICA:
Preparaciones previas:
• Preparación de las placas de microarrays QuicjStrip TM: usando unas tijeras,
CORTE las placas QuickStrip TM de
microrrays horizontalmente entre
las filas D y E, luego CORTE
verticalmente entre las columnas 8
y 9.
Nota: las columnas 9-12 no se utilizan en estos experimentos, se han dejado
intencionalmente vacías y pueden ser dercartadas.
• Preparación de las tarjetas de microarrays de papel: emparejar cada placa
QuickStrip TM de microarrays de 4
hileras con una tarjeta de microarrays
de papel a juego. Las placas que
contienen las filas A-D deben
emparejarse con una tarjeta para las
filas A-D, mientras que las pplacas con
las filas E-H se emparejarán con una
tarjeta para las filas E-H.
Cada grupo recibirá una de las placas
QuickStripTM de microarrays y una
tarjeta de microarrays correspondiente. Las muestras para el paciente 1 están
contenidas en las filas A y E, el paciente 2 en las filas B y F, el paciente 3 en las
filas C y G, el paciente 4 en las filas D y H. Cada pareja del grupo se encargará
de uno de los pacientes, es decir, de una fila de cada tarjeta. Lo mismo para
analizar los resultados.
Hay que golpear suavemente las placas QuickStripTM de microarrays para
asegurarse de que todas las muestras estén en el fondo de los pocillos.
• Preparación de tampones y muestras de ADNc de control:
1. Dispensar 200 μl de tampón de equilibrio (componente A) en 2 tubos de
microcentrífuga. Etiquete los tubos como "EB".
2. Dispensar 200 μl de ADNc de control (componente B) en 2 tubos de
microcentrífuga. Etiquete los tubos como "ADNc".
3. Dispensar 200 μl de tampón de hibridación (Componente C) en 2 tubos de
microcentrífuga. Etiquete los tubos como "HB".
Esquema de la práctica:
1. Hay que orientar la tarjeta de microarrays de papel y la placa QuickStripTM para que
el paciente 1 (fila "A" o "E") se encuentre en la esquina superior izquierda de cada uno.
Además, hay que etiquetar la tarjeta de microarrays con sus iniciales o número de
grupo.
2. Usando una micropipeta, aplicar 5 μl de Equilibration Buffer (EB) a cada punto de la
tarjeta de microarrays que te corresponda.
3. Incubar la tarjeta de microarrays en una incubadora a 37 ° C durante 5 minutos, o a
temperatura ambiente durante 10 minutos. Deje que las muestras se sequen por
completo.
4. Con una punta de micropipeta nueva, agregar 5 μl de ADNc de control (ADNc) al
pocillo superior izquierdo de la placa QuickStripTM perforando el papel de aluminio.
5. Con la misma punta de micropipeta, pipetee hacia arriba y hacia abajo 3 veces para
mezclar.
6. Todavía usando la misma punta de micropipeta, aplicar 5 μl de la muestra mezclada
en el punto superior izquierdo de la tarjeta de microarrays.
7. Usando una punta de micropipeta nueva, repetir los pasos 4-6 para la segunda
muestra en la fila superior.
8. Continúe repitiendo los pasos 4-6 para cada pocillo adicional en la fila superior,
luego continúe con los 3 restantes filas Una vez que las 32 muestras se hayan
mezclado con el ADNc de control y se hayan agregado a la tarjeta de microarrays de
papel seguir con el paso 9.
9. Incubar la tarjeta de microarrays en una estufa de incubación a 37 ° C durante 5
minutos, o a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deje que las muestras se
sequen por completo.
10. Aplicar 5 μl de tampón de hibridación (HB) en cada punto de la tarjeta de
microarrays.
11. Incubar la tarjeta de microarrays en una estufa de incubación a 37 ° C durante 5
minutos, o a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deje que las muestras se
sequen por completo.
12. Visualizar el microarray utilizando una luz UV portátil de onda larga o un
transiluminador de rango medio. Las tarjetas de microarrays pueden conservarse y
analizarse durante hasta una semana si está protegida de la luz.
Análisis de los resultados:
Los resultados del microarrays indican
cambios en la expresión génica entre las
cuatro muestras de pacientes y el ADNc
control. Las primeras cuatro columnas
representan las muestras de control y
deben verificarse primero para
asegurarse de que el experimento
funcionó como se esperaba. Una vez que
se han verificado los controles, se pueden
analizar los cuatro genes de interés en
cada uno de los pacientes para
determinar la regulación ascendente o
descendente de los genes.
Las muestras de genes que presentan fluorescencia en amarillo muestran una
expresión similar al ADNc de control, mientras que la fluorescencia naranja-roja indica
que el gen ha aumentado la expresión y la fluorescencia verde indica que la expresión
del gen está disminuida. Sin fluorescencia indica que no hay expresión.
RESULTADO:
Tras la hibridación de muestras de ARN con el microarray, se obtuvieron datos de
expresión génica para miles de genes simultáneamente. Estos datos se analizaron y se
observaron diferentes perdiles de expresión génica, destacando genes cuya expresión
se veía aumentada o disminuida en respuesta a los estímulos o tratamientos aplicados.
CUESTIONES:
1. Realiza una fotografía de la tarjeta de arrays de tu grupo y adjuntala a
continuación:
2. Analiza los resultados para la muestra utilizada que te corresponde.

Teniendo en cuenta que la muestra que me corresponde es la F:
Sobreexpresión del gen 1.
Expresión única de los genes 2, 4, 6 y 8.
Expresión normal de los genes 3, 5 y 7.
IMÁGENES REALIZADAS DURANTE LA PRÁCTICA :
Foto 2
Foto 1
Foto 5
Foto 3 Foto 4
Foto 6 Foto 7
Foto 8
LEYENDA:
Foto 1: material utilizado durante la práctica.
Foto 2: componente C.
Foto 3: TED.
Foto 4 y 5: proceso de realización de la práctica.
Foto 6, 7 y 8: visualización de los resultados.
Curso escolar: 2023-24 Ejercicio: Práctica 4 Factor Rh Evaluación: 2ª

EJERCICIO PRÁCTICO: DETERMINACIÓN DEL FACTOR RH POR PCR.

INTRODUCCIÓN:
La determinación del factor Rh es un análisis crucial en el ámbito médico, ya que es
crucial para evitar reacciones inmunológicas graves. El factor Rh se trata de un
proteína presente en la superficie de los glóbulos rojos y puede ser positivo (Rh+) o
negstivo (Rh-).
FUNDAMENTO:
• PCR
La PCR ha revolucionado la investigación y diagnóstico basado en la Biología
Molecular. La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que
proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser
capaz de amplificarlo de forma que se tenga suficiente para realizar
experimentos: test diagnósticos, secuenciación de ADN, determinaciones
forenses, paternidades, diagnóstico clínico, ...
En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN
que es extraída de varias fuentes biológicas o tejidos. En la PCR, el ADN o gen a
amplificar se define como diana y los oligonucleótidos sintéticos utilizados se
definen como “primers” (cebadores). Un set de 2 cebadores de entre 20-45
nucleótidos son sintetizados químicamente para que se correspondan con los
extremos del gen a amplificar. Cada cebador se une a uno de los extremos de
cada cadena de ADN y es el punto de inicio de la amplificación.
Una reacción típica de PCR contiene ADN molde, Taq polimerasa y los 4 dNTPS
en un tampón de reacción apropiado (entre otros reactivos). El volumen total
de reacción es de 25-50 µl. En el primer paso de la reacción de PCR, las cadenas
complementarias de ADN se separan (desnaturalizan) la una de la otra a 94ºC,
mientras que la Taq polimerasa permanece estable. En el segundo paso la
muestra es enfriada a una temperatura entre 40-65ºC que permita la
hibridación de los 2 cebadores, cada uno a una hebra del ADN molde. En el
tercer paso, conocido como extensión, la temperatura es elevada a 72ºC y la
Taq polimerasa añade nucleótidos a los cebadores para completar la síntesis de
una nueva cadena complementaria Estos tres pasos, desnaturalización-
hibridación de cebadores-extensión, constituye un ciclo básico de PCR. Este
proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la secuencia objeto
exponencialmente. La PCR se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento
que es programado para un rápido calentamiento, enfriamiento y

mantenimiento de las muestras varias veces. El producto amplificado es luego
detectado por separación de la mezcla de reacción mediante electroforesis en
gel de agarosa.
• Factor Rh
En 1940, Landsteiner y Wiener demostraron que los anticuerpos producidos
contra las células rojas de la sangre de los monos Rhesus eran capaces de
aglutinar alrededor del 85 % de los eritrocitos de la sangre de la población
humana.
Se demostró que se dirigían a una molécula que se denominó antígeno Rhesus
(Rh), los individuos que poseían esta molécula fueron denominados Rh positivo
y el 15 % restante Rh negativo.
El locus Rh consiste en 2 genes estructurales: D y CcEe, los cuales codifican para
la cadena del polipéptido D y las proteínas C/c y E/e respectivamente.
La presencia o ausencia del gen D en el genoma determina la base genética del
polimorfismo de los grupos sanguíneos Rh-positivo/Rh-negativo. Por tanto, los
individuos son clasificados como Rh+ si contienen el antígeno D en la
membrana de sus eritrocitos. De todas formas, el sistema Rh es mucho más
complejo, y hasta 47 diferentes Rh antígenos han sido descritos.
El antígeno D es altamente inmunogénico e induce una respuesta inmune en
muchas personas Rhcuando reciben una transfusión con sangre Rh+. Por esta
razón, en muchos países se realizan controles rutinarios en los donantes de
sangre y los individuos que se van a someter a una transfusión, de forma que
pacientes Rh- reciben exclusivamente productos D negativo.
El sistema Rh se ha observado que también está implicado en afecciones como
la enfermedad hemolítica del recién nacido, anemias hemolíticas autoinmunes
y reacciones hemolíticas de origen no inmune.
La enfermedad hemolítica del recién nacido ocurre cuando una madre Rh- lleva
un feto Rh+, a pesar, de que los eritrocitos fetales están separados de la
circulación de la madre por la placenta, durante el embarazo, eritrocitos fetales
pueden escapar a la circulación de la madre donde son consideradas como
extrañas y producir una respuesta inmune. En esta práctica, utilizaremos el
ADN aislado a partir de la saliva y lo utilizaremos para llevar a cabo la reacción
de PCR. La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D.
La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+. Debido a
que los genes D y CcEe son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores
que se emparejan en una región del gen D y también a una región del gen CcEe.
De esta forma, todas las muestras de ADN sirven como molde para la
amplificación. Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes
tamaños (1200pb y 600 pb) y los individuos Rh- una única banda
correspondiente al fragmento del gen CcEe (1200 pb).
OBJETIVO:
El objetivo de este experimento es introducirnos en los principios y práctica de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) mediante el estudio de la determinación
del Rh.
• Muestras de sangre de pacientes.

• Reactivos de extracción de ADN.
• Primers específicos para el gen del factor Rh.
• Mezcla de reacción de PCR.
• Termociclador.
• Agarosa y TAE buffer.
• Marcador de peso molecular de ADN.
• Colorante de gel.
TÉCNICA:
En esta primera PCR vamos a utilizar un kit comercial de PCR. En el kit se suministran
reactivos suficientes para la realización de PCRs y geles de electroforesis en agarosa al
1 %. El Kit consta de:
• Tampón de electroforesis concentrado 10X.
• Agarosa.
• MIX PCR.
Polimerasa mix hot start:
Permite amplificar cualquier fragmento a partir de ADN, de forma que sólo hay que
añadir agua. Se requiere un paso de activación de 10 minutos a 95ºC de forma que se
eliminen los productos no específicos como los dímeros de primers. Además contiene
un colorante rojo que permite la fácil visualización y la siembra directa en el gel sin
necesidad de mezclar con un tampón de carga.
Reacción de la PCR:
NOTA: Utilizar siempre puntas con filtro y cambiar de punta cada vez que se realiza
una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar a falsos resultados.
1. Utilizar 2,5 µl (100-250 ng) del ADN para cada reacción de PCR.
IMPORTANTE:
a) Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 2,5 µl de
agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o
micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN. En el control
negativo no se ha de amplificar nada.
b) Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 2,5 µl de
control positivo Rh+ en lugar del ADN.
2. Mezclar bien el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.

3. Para aquellos termocicladores que no tengan un “heated lid”, añadir 25 µl de
aceite mineral para prevenir la evaporación.
4. Realizar el proceso de amplificación.
IMPORTANTE: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario
programar un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95ºC, después
programar los 30 ó 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar.
5. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa

después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de carga.
6. Utilizar un método de detección o tinción del ADN.
7. Si todo sale correctamente se ha de obtener un resultado similar al siguiente:
RESULTADO:
Tras la amplificación mediante PCR y la posterior electroforesis en gel de las muestras
de ADN, se observaron diferentes patrones de bandas de ADN correspondientes a los
diferentes genotipos del factor Rh. La comparación de las muestras con un marcador
de peso molecular permitió la determinación precisa del genotipo del factor Rh de
cada muestra analizada.
Foto 1 Foto 2
LEYENDA:
Foto 1 y 2: visualización de los resultados obtenidos.
Curso escolar: 2023-24 Ejercicio: Práctica 5 Transformación bacteriana Evaluación: 2ª

EJERCICIO PRÁCTICO: TRANSFORMACIÓN BACTERIANA P GAL-221.

INTRODUCCIÓN:
La transformación bacteriana es un proceso fundamental en biología molecular que
implica la introducción de material genético exógeno. En esta practica de laboratorio
se llevará a cabo la transformación bacteriana utilizando el plásmido pGal-221, que
contiene un ADN inserto con sitios de reconocimiento y un gen de resistencia a un
antibiótico específico. La expresión del gen reportero permitirá la identificación de
bacterias transformadas mediante la observación de un fenotipo específico en las
placas de cultivo.
FUNDAMENTO:
• PCR
La PCR ha revolucionado la investigación y diagnóstico basado en la Biología
Molecular. La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que
proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser
capaz de amplificarlo de forma que se tenga suficiente para realizar
experimentos: test diagnósticos, secuenciación de ADN, determinaciones
forenses, paternidades, diagnóstico clínico, ...
En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN
que es extraída de varias fuentes biológicas o tejidos. En la PCR, el ADN o gen a
amplificar se define como diana y los oligonucleótidos sintéticos utilizados se
definen como “primers” (cebadores). Un set de 2 cebadores de entre 20-45
nucleótidos son sintetizados químicamente para que se correspondan con los
extremos del gen a amplificar. Cada cebador se une a uno de los extremos de
cada cadena de ADN y es el punto de inicio de la amplificación.
Una reacción típica de PCR contiene ADN molde, Taq polimerasa y los 4 dNTPS
en un tampón de reacción apropiado (entre otros reactivos). El volumen total
de reacción es de 25-50 µl. En el primer paso de la reacción de PCR, las cadenas
complementarias de ADN se separan (desnaturalizan) la una de la otra a 94ºC,
mientras que la Taq polimerasa permanece estable. En el segundo paso la
muestra es enfriada a una temperatura entre 40-65ºC que permita la
hibridación de los 2 cebadores, cada uno a una hebra del ADN molde. En el
tercer paso, conocido como extensión, la temperatura es elevada a 72ºC y la
Taq polimerasa añade nucleótidos a los cebadores para completar la síntesis de
una nueva cadena complementaria Estos tres pasos, desnaturalización-
hibridación de cebadores-extensión, constituye un ciclo básico de PCR. Este
proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la secuencia objeto
exponencialmente. La PCR se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento
que es programado para un rápido calentamiento, enfriamiento y
mantenimiento de las muestras varias veces. El producto amplificado es luego
detectado por separación de la mezcla de reacción mediante electroforesis en
gel de agarosa.
• Factor Rh
En 1940, Landsteiner y Wiener demostraron que los anticuerpos producidos
contra las células rojas de la sangre de los monos Rhesus eran capaces de
aglutinar alrededor del 85 % de los eritrocitos de la sangre de la población
humana.
Se demostró que se dirigían a una molécula que se denominó antígeno Rhesus
(Rh), los individuos que poseían esta molécula fueron denominados Rh positivo
y el 15 % restante Rh negativo.
El locus Rh consiste en 2 genes estructurales: D y CcEe, los cuales codifican para
la cadena del polipéptido D y las proteínas C/c y E/e respectivamente.
La presencia o ausencia del gen D en el genoma determina la base genética del
polimorfismo de los grupos sanguíneos Rh-positivo/Rh-negativo. Por tanto, los
individuos son clasificados como Rh+ si contienen el antígeno D en la
membrana de sus eritrocitos. De todas formas, el sistema Rh es mucho más
complejo, y hasta 47 diferentes Rh antígenos han sido descritos.
El antígeno D es altamente inmunogénico e induce una respuesta inmune en
muchas personas Rhcuando reciben una transfusión con sangre Rh+. Por esta
razón, en muchos países se realizan controles rutinarios en los donantes de
sangre y los individuos que se van a someter a una transfusión, de forma que
pacientes Rh- reciben exclusivamente productos D negativo.
El sistema Rh se ha observado que también está implicado en afecciones como
la enfermedad hemolítica del recién nacido, anemias hemolíticas autoinmunes
y reacciones hemolíticas de origen no inmune.
La enfermedad hemolítica del recién nacido ocurre cuando una madre Rh- lleva
un feto Rh+, a pesar, de que los eritrocitos fetales están separados de la
circulación de la madre por la placenta, durante el embarazo, eritrocitos fetales
pueden escapar a la circulación de la madre donde son consideradas como
extrañas y producir una respuesta inmune. En esta práctica, utilizaremos el
ADN aislado a partir de la saliva y lo utilizaremos para llevar a cabo la reacción
de PCR. La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D.
La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+. Debido a
que los genes D y CcEe son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores
que se emparejan en una región del gen D y también a una región del gen CcEe.
De esta forma, todas las muestras de ADN sirven como molde para la
amplificación. Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes
tamaños (1200pb y 600 pb) y los individuos Rh- una única banda
correspondiente al fragmento del gen CcEe (1200 pb).
OBJETIVO:
En este experimento los estudiantes se explorará el proceso biológico de la
transformación bacteriana utilizando células bacterianas de E.coli y plásmidos. Este
proceso es un paso fundamental en algunas técnicas de clonación molecular. Al
finalizar la práctica se habrá observado y analizado los rasgos adquiridos por las células
bacterianas transformadas. La presencia de colonias bacterianas azules demostrará la
expresión del gen específico para el fenotipo Lac+.
MATERIAL:
• Placas Petri pequeñas.
• Placas Petri grandes.
• Pipetas Pasteur de plástico para transferencia.
• Pipetas de ml estériles.
• Asas de inoculación estériles.
• Microtubos.
• Micropipetas automáticas y puntas.
• 2 baños de agua (37ºC y 42ºC).
• Termómetro.
• Estufa de incubación (37ºC).
• Hielo picado.
• Mechero bunsen, placa calefactora o microondas.
• Guantes termoprotectores.
REACTIVOS:
• E.coli.
• Plásmifo ADN Pgal.
• Ampicilina.
• X-Gal.
• CaCl2.
• Buffer Control
• Ready Pour Agar.
• Recovery Broth (caldo de recuperación).
TÉCNICA:
PRECAUCIONES:
1. Los experimentos de transformación contiene antibióticos para seleccionar las
bacterias transformadas. Los técnicos con alergia a ampicilina no deben
participar en este experimento.
2. Llevar guantes de laboratorio mientras se trabaja.
3. El agar se debe calentar y fundir lo cual puede ser peligroso si se realiza
incorrectamente.
4. NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados.
5. Lavarse las manos con jabón y agua antes y después de haber trabajado en el
laboratorio.
6. Las bacterias E.coli utilizadas en este experimento no son patógenas para el ser
humano. A pesar de ello, es una buena práctica seguir los siguientes consejos
para el manejo y desecho de los materiales contaminados con bacterias:
a) Limpiar las superficies de trabajo, antes y después de la práctica, con un
desinfectante de laboratorio o una solución 10% de lejía.
b) Todos los materiales que entran en contacto con las bacterias deberán ser
desinfectados antes de tirar a la basura. Desinfectar los materiales lo antes
posibles después de su uso, bien utilizando un autoclave a 121ºC durante 20
minutos, o bien, por inmersión de los materiales en una solución al 10% de
lejía.
DÍA 1: PREPARACIONES PREVIAS AL DÍA DE LA PRÁCTICA. PLACAS DE CULTIVO Y BACTERIAS.
La preparación de las diferentes placas de cultivo que se van a utilizar en el
experimento de transformación en sí es un trabajo muy habitual en un laboratorio de
biología molecular.
PROTOCOLO:
1. ROMPER en pequeños pedazos el agar sólido ReadyPour LB Agar mediante vigorosa
agitación y exprimiendo el bote de plástico.
2. AFLOJAR pero NO ELIMINAR el tapón del ReadyPour LB Agar. Esto permite al vapor
escapar durante el calentamiento. PRECAUCIÓN: Un fallo en aflojar en el tapón previo
al calentamiento puede causar la rotura o explosión del bote.
3. Calentar con un microondas el ReadyPour LB Agar hasta fundir el agar.
Cuidadosamente sacar el bote del microondas y AGITAR suavemente. Continuar
calentando a intervalos de 30 segundos hasta que el agar está completamente disuelto
(la solución ámbar debería estar transparente y libre de pequeñas partículas).
NOTA: Tener mucho cuidado y asegurarse que el agar hirviendo no sale fuera del bote.
Parad de calentar si empieza a borbotear en exceso.
4. ENFRIAR el bote ReadyPour LB Agar a 60ºC con mucho cuidado. Para evitar que se
enfríe en exceso y no dé tiempo de preparar todas las placas, se recomienda colocar el
envase de ReadyPour LB Agar en un baño a 55-60ºC.
5. Mientras el medio se está enfriando, ETIQUETAR las placas Petri con rotulador
permanente:
• 10 placas pequeñas X-GAL/Amp. (60 x 15 mm) Dos placaS por grupo
• 5 placas pequeñas X-GAL. (60 x 15 mm) Una placa por grupo
• 2 placas grandes fuente de E.coli. (100 x 15 mm) Para todos
6. Añadir 20 ml del ReadyPour Agar enfriado en cada una de las placas grandes fuente
de E.coli utilizando una pipeta de 10 ml.
7. AÑADIR la solución de X-Gal al resto de ReadyPour Agar enfriado. Cerrar el bote y
agitar suavemente para mezclar los reactivos. SOLO AÑADIR LOS REACTIVOS AL AGAR
ENFRIADO A 60ºC ya que si se añaden a más temperatura se pueden degradar.
8. Utilizando una nueva pipeta de 10 ml AÑADIR 5 ml en las placas pequeñas X-
Gal/control-1. (1 por grupo). Marcar como ADN - (X-GAL/Control 1).
9. AÑADIR la cantidad entera de Ampicilina al ReadyPour Agar restante. Cerrar el bote
y agitar suavemente para mezclar los reactivos. Como la ampicilina es un polvo se
puede añadir 1 ml del medio con una micopipeta y resuspender el polvo de ampicilina.
10. Utilizando una nueva pipeta de 10 ml AÑADIR 5 ml en las placas pequeñas X-Gal/
Amp. (2 por grupo). Marcar como ADN - (Amp/X-Gal Control 2), ADN + (Amp/X-
Gal/pGal).
11. TAPAR y ESPERAR al menos 20 minutos a que las placas de agar solidifiquen. Para
unos resultados óptimos, dejar las placas a temperatura ambiente toda la noche.
12. CONSERVAR las placas a temperatura ambiente por no más de 2 días. Las placas se
deberían invertir y colocar en una bolsa de plástico o papel de auminio para asegurar
que no se secan.
NOTA: si las placas no se utilizan en los 2 días siguientes a su preparación, se deben
conservar invertidas a 4ºC en una nevera. El día de su uso sacar de la nevera y calentar
a 37ºC en una estufa durante 30 minutos antes de su uso.
DÍA 2: PREPARACIÓN PLACAS FUENTE DE E.COLI.

Para unos resultados óptimos las placas fuente de E.coli deberían ser preparadas 16-20
horas antes del desarrollo del experimento de transformación. Si no dispone de una
estufa de cultivo, las colonias se formarán a temperatura ambiente en
aproximadamente 24-48 horas.
1. SACAR un BactoBead de su vial utilizando un asa de inoculación estéril. TRANSFERIR
el BactoBead en un borde de una placa grande fuente de E.coli. CERRAR el vial
inmediatamente después de su uso para limitar la exposición a la humedad y aire.
2. Instantáneamente DISOLVER el BactoBead añadiendo 10 µl de agua estéril.
3. Hacer estrías con el asa estéril sobre el BactoBead disuelto como se muestra en la
figura. Intentar no clavar el asa en el medio.
4. Hacer nuevas estrías con el asa de siembra
tal y como se muestra en la figura.
5. ROTAR la placa y hacer nuevas estrías en
una parte limpia del agar como se muestra en
la figura.
6. ROTAR la placa una vez más, y hacer
nuevas estrías en una parte limpia del agar
como se muestra en la figura. Esto debería
producir colonias aisladas.
7. TAPAR la placa y incubar invertidas a 37ºC
durante 16- 20 horas. Si no dispone de una
estufa de cultivo, las colonias se formarán a
temperatura ambiente en aproximadamente 24- 48 horas.
Otras preparaciones previas:
1. Dispensar 0.6 ml de CaCl2 en 5 microtubos marcados (uno para cada grupo) y
colocar en la nevera a 4ºC.
2. Dispensar 0.6 ml de Caldo de Cultivo Luria (Recovery Broth) en 10 microtubos
marcados (uno para cada grupo) y mantener a temperatura ambiente.
3. Preparación del ADN plasmídico pGAL: Las alícuotas del ADN plasmídico y Control
Buffer pueden ser preparadas el día antes de la práctica y conservarse a 4ºC para ganar
tiempo. (OPCIONAL)
a. Colocar el microtubo del plásmido pGal y Control Buffer en hielo.
b. Marcar o etiquetar 5 microtubos con “pGal” y 5 microtubos con “Control”.
c. Antes de dispensar el ADN plasmídico, asegurarse que toda la muestra de los
plásmidos se encuentra en el fondo del microtubo. Si se dispone de centrifuga se
puede realizar un spin para recoger todas las gotas de líquido.
d. Utilizando una micropipeta, dispensar 12 microlitros del ADN plasmídico en cada
microtubo marcado “pGal” y 12 microlitros del Control Buffer en cada microtubo
marcado”control”. Cerrar los microtubos y colocarlos a 4ºC.
DÍA 3: EXPERIMENTO DE TRANSFORMACIÓN.
Preparaciones previas el día de la práctica antes de empezar el experimento:
Equilibrar los baños de agua a 37ºC y 42ºC. Estufa de incubación a 37ºC. Si sólo se
dispone de un baño de agua después de utilizar el baño de 42ºC, bajar la temperatura
rápidamente a 37ºC eliminado agua y añadiendo agua fría.
Una vez realizadas todas las operaciones previas a la práctica en sí, vamos a describir el
proceso completo del experimento de transformación.
Cada grupo requiere:
• 1 microtubo de 0.6 ml CaCl2.
• 1 microtubo del plásmido pGal.
• 1 microtubo del Control Buffer.
• 1 microtubo de 0.6 ml de Caldo de cultivo Luria (Recovery Broth).
• 2 placas pequeñas X-Gal/Amp. Control 2 y transformadas.
• 1 placa pequeña X-Gal. Control 1
• 1 placas grande fuente de E.coli por cada 2 grupos.
• 4 pipetas estériles de 1ml.
• 3 asas de siembra.
1. MARCAR o ETIQUETAR un microtubo con ADN + y un segundo microtubo con ADN -.
(a poder ser de diferente color). COLOCAR LOS MICROTUBOS EN HIELO DURANTE
TODO EL PROCESO
2. TRANSFERIR 500 µl del CaCl2 conservado previamente a 4ºC en el microtubo AND -
utilizando una micropipeta.
3. Utilizando un asa de siembra, TRANSFERIR aproximadamente 15 colonias (cada
colonia debería tener un tamaño de 1-1.5 mm de tamaño) de la placa fuente de E.coli
al microtubo AND -. NORMALMENTE las células bacterianas en la placa fuente de E.coli
no crecen individualizadas y crecen en toda la placa como un césped que cubre toda la
placa, en este caso arrastrar el asa de siembra por la placa y recoger las células, tener
cuidado de no coger agar y un exceso de células que inhibiría el proceso.
4. ESTE PASO ES MUY IMPORTANTE HACERLO BIEN PARA TENER ÉXITO: LIBERAR las
células del asa rotándola enérgicamente para liberar todas las células bacterianas.
Cuando se liberen las células se observará un grumo. RESUSPENDER las células
bacterianas en la solución de CaCl2 utilizando una micropipeta hasta que no se
observe ningún grumo de células y la SUSPENSIÓN CELULAR esté turbia.
MUY IMPORTANTE: liberar bien todas las células y resuspenderlas completamente, se
debe observar una solución turbia, si no es así añadir más células con el asa o
resuspender bien.
5. TRANSFERIR 250 µl de la SUSPENSIÓN CELULAR al microtubo marcado ADN +.
COLOCAR los microtubos en hielo.
6. AÑADIR al microtubo marcado como ADN +:10 µl del plásmido pGal (del tubo
marcado como pGal) y 10 µl de Control buffer al microtubo marcado como ADN-.
7. INCUBAR en hielo durante 10 minutos.
8. COLOCAR los microtubos en un baño de agua a 42ºC durante 90 segundos.
9. INMEDIATAMENTE colocar los microtubos en hielo e INCUBAR durante 2 minutos.
10. TRASNFERIR 250 µl del Recovery Broth a cada microtubo utilizando una
micropipeta. Mezclar suavemente el microtubo.
11. INCUBAR las células a 37ºC en un baño de agua durante por lo menos durante 30
minutos.
12. Coger las 3 placas de agar marcadas: ADN - (X-GAL/Control 1), ADN - (Amp/X-Gal
Control 2), ADN + (Amp/X-Gal/pGal).
13. Después del periodo de incubación de 30 minutos , sacar los tubos del baño de
agua y colocar en una gradilla u otro utensilio de laboratorio.
14. Utilizando una micropipeta TRANSFERIR 250 µl de las células del tubo marcado
como ADN- y depositarlos en el medio de las placas ADN - (X-GAL/Control 1) y ADN -
(Amp/X-Gal Control 2).
15. Utilizando una micropipeta. TRANSFERIR 250 µl de las células del tubo marcado
como ADN + y depositarlos en el medio de las placa ADN + (Amp/X-Gal/pGal).
16. EXTENDER las células bacterianas por toda la placa utilizando un asa de siembra.
Utilizar un asa estéril para extender ambas ADN - muestras. CAMBIAR por un asa
nueva antes de extender las muestras ADN +. Asegurarse bien que todas las células
han sido bien extendidas por toda la superficie de las placas. TAPAR las placas y
ESPERAR durante 5 minutos que la suspensión celular sea absorbida por el agar.
17. AGRUPAR todas las placas de un mismo grupo y marcarlas con el número de grupo.
COLOCAR las placas en una posición invertida a 37ºC en una estufa de incubación
durante toda la noche (16-18 horas). SI no dispone de un incubador, las colonias serán
visibles en 24- 48h a temperatura ambiente.
18. VISUALIZAR las placas control y transformadas. Para cada placa observar:
- El número de colonias de la placa.
- El color de la bacteria.
RESULTADO:
Resultados esperados:
Colonias Colonias
Nada
blancas azules
Control negativo Control negativo Control positivo

(plásmido)
Resultados obtenidos:
Colonias Colonias Colonias

blancas azules blancas
Tras realizar la practica hemos obtenido resultados diferentes a los deseados. En la

primera placa crecieron, como se esperaba, colonias blancas. En la segunda placa no
debería haber crecido nada, sin embargo, han crecido las colonias azules. Esto puede
haberse debido a un fallo a la hora de echar los controles, habiendo echado el control
positivo en lugar del negativo o porque ha habido contaminación. En la tercera placa
no ha ocurrido la transformación, ya que se ven las colonias blancas, pero no las
azules. Esto se puede deber a que el proceso de transformación se ha realizado de
manera incorrecta. Para intentar solucionar los fallos hemos echado en la placa 3
control positivo y se ha vuelto a incubar a la temperatura idónea y con los tiempos
correctos.
CUESTIONES:
1. ¿Hay presencia de colonias “satélite”? ¿De qué color son estas colonias? ¿Por
qué?
Sí y son de color blanco. La aparición de estas colonias se debe a que estas
bacterias no se han incorporado eficientemente en el plásmido y, por lo tanto,
son incapaces de crecer de forma independiente y, en lugar de ello, se asocian
a las colonias más grandes que sí contienen el plásmido y pueden aprovechar
los recursos disponibles de su entorno.
2. ¿Por qué las células competentes que no reciben el pGal (control) no crecen
en las placas que contienen ampicilina?
Las células competentes que no reciben el plásmido pGal no crecen en las
placas que contienen ampicilina porque este antibiótico es letal para las células
bacterianas que no poseen el gen de resistencia al mismo. Por ello las células
sin el plásmido son susceptibles al efecto bactericida del antibiótico y no
pueden sobrevivir a su presencia.
3. ¿Cuántas células crecen en la placa X-Gal en comparación con las otras
placas? ¿Por qué? ¿Y de qué color son? ¿Por qué?
El número de células que ha credido es menor en comparación con las de las
otras placas, ya que solo se expresan, crecen y forman colonias azules aquellas
que se han incorporado con éxito al plásmido.
4. ¿Qué evidencia tenemos de qué la transformación ha tenido lugar?
La evidencia de que la transformación ha tenido lugar se basa en la presencia
de colonias bacterianas en las placas que contienen ampicilina.
5. Explica algunas razones por las que la transformación no tendrá lugar.
- Ineficiencia del proceso de competencia celular.
- Daño al ADN plasmídico durante la preparación y manipulación del mismo.
- Concentración insuficiente de células competentes a la muestra.
- Condiciones inadecuadas de incubación en temperatura y/o tiempos.
- Contaminación del medio de cultivo.
Foto 1 Foto 2
Foto 4
Foto 3
LEYENDA:
Foto 1: reactivos utilizados.
Foto 2: cultivo de E.coli con los reactivos echados.
Foto 3: incubación de las placas.
Foto 4: resultado de la práctica.

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TEMA 5: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

ACTIVIDADES IMÁGENES UD 5 (TÉCNICAS FISH Y CISH).

Cromosoma 22 para el locus zzq.11.2

Todas muestran lo mismo: 2 puntos rojos

- Homocigotos normales: individuos 2, 3 y 5.

PRIMERAS ACTIVIDADES DE REPASO DEL TEMA.

Tampón de reacción → 25 x 1/10=2,5

SEGUNDAS ACTIVIDADES DE REPASO DEL TEMA.

TEMA 7: CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Plásmido recombinante Escherichia Coli

Selección e identificación Ampicilina

TEMA 8: MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

6. Se han secuenciado dos oligonucleótidos con métodos de 1ª generación. Descifra la secuencia de

Técnica de Secuenciación Método de Amplificación Método de Secuenciación

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DETENCIÓN DE TRISOMÍAS Y TRIPLOIDÍAS MEDIANTE SONDAS DE SEPARACIÓN Y FUSIÓN

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2. Analiza los resultados para la muestra utilizada que te corresponde.

DATOS DEL ALUMNO Calificación:

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• Muestras de sangre de pacientes.

2. Mezclar bien el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.

5. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa

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Control negativo Control negativo Control positivo

Colonias Colonias Colonias

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