Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Licenciatura en Biotecnología
Facultad de Ciencias Biológicas
Ingeniería de proteínas

Práctica 3: Digestión del vector recombinante pPICZB-HN,

para confirmar la presencia del inserto eHN.

Objetivo:
• Confirmar la presencia del eHNen el vector pPICZB por digestión
enzimática.
Equipo 2
• Manuel Pablo Saavedra
• Italivi Velázquez Alonso
• Uriel de Jesús Velázquez Hernández
DESARROLLO
En dos microtubos eppendorf se colocaron a cada uno 3µl del plásmido pPICZB-HN, para que
posteriormente se agregaran 7µl de las digestiones enzimáticas EcoR1 y EcoR1/Xbal a cada tubo.
Se rotuló, centrifugó e incubó a 37°C durante 24 hrs. Transcurrido el tiempo establecido, se preparó
el gel de agarosa pesando 0.21 gr de agarosa para añadirle 30 ml de buffer TBE 0.5X previamente
preparado, calentarlo durante 20 segundos en el microondas, verter en el molde y esperar a que
polimerizara y solidificara. Finalmente, se montó la cámara de electroforesis colocando el gel de
agarosa en la cámara, añadiendo buffer TBE 0.5X y cargando las muestras previamente tratadas
para su corrida a 75 volts durante 30 minutos. Se observó el resultado en el transiluminador UV.
RESULTADOS

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Ilustración 1. Gel A. Corrida de las diges6ones pertenecientes a los equipos 1, 2 y 3.

En los pozos 1 y 4 fueron depositados el control negativo (el plásmido sin digerir) y el marcador
de ADN respectivamente. Al presente equipo nos correspondieron los pozos 5 y 6 para la carga de
las digestiones. La digestión con EcoR1 se cargó en el pozo 5 y la doble digestión con EcoR1/Xbal
en el pozo 6. Para la digestión con EcoR1 se puede observar que se llevó a cabo correctamente. La
banda coincide con el tamaño esperado de la linearización del plásmido de 5086 pb, coincidiendo
con las digestiones de los equipos 1 y 3 en los pozos 2 y 7. Se observa una intensidad considerable
de la banda obtenida. Sin embargo, para la doble digestión se observa un efecto cometa. No se
aprecian las dos bandas esperadas de la doble digestión. Del mismo modo, este efecto se aprecia
en el carril del plásmido sin digerir, así como en los carriles correspondientes de los equipos 1 y 3.
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Ilustración 2. Gel B. Corrida correspondientes a las diges6ones de

los equipos 4, 5 6.

De la misma manera que en el gel A, en los pozos 1 y 4 se colocaron el control negativo y el

marcador de ADN respectivamente. Las bandas en los carriles 2, 5 y 7 corresponden a las
digestiones con EcoR1. Se aprecia una linearización del plásmido correcta y con una longitud de
pb de 5000. Sin embargo, tanto en el control negativi como en las dobles digestiones con
EcoR1/Xbal se obtuvo un efecto cometa. La visualización del material genético se aprecia barrido
casi al final del gel. Cabe destacar que la longitud de ambos geles varía ya que los equipos de
electroforesis empleados para el corrimiento eran diferentes modelos. No obstante, el tiempo de
corrida fue el mismo para ambos experimentos.

DISCUSIÓN
Los resultados de la doble digestión de EcoR1/Xbal no fueron favorables, puesto que se realizó
con un buffer universal y no con el Buffer de reacción enzimática:10X Thermo scientific / BioLabs,
por lo tanto, no fue compatible con nuestras enzimas. Esto se observa en el efecto cometa que
revela el gel en los carriles 3, 6 y 8 de ambos geles. De acuerdo con el diagrama del vector
recombinante pPICZB-HN, en el inserto del ORF del HN, un extremo posee el sitio de restricción
para EcoR1, y en el otro para Xbal. La doble digestión habría revelado una banda de 1500 pb
correspondiente para HN y otra de 3500 pb para el vector pPICZB. Sin embargo, por cuestiones
ya discutidas, no se logró obtener el resultado esperado.
CONCLUSIÓN
Como equipo, concluimos que lo más favorable es que el buffer de reacción enzimática debe ser
el estandarizado comercialmente para nuestras enzimas, ya que crean las condiciones óptimas de
reacción específicas para la enzima utilizada.