Valorización de residuos agroindustriales para la producción de pectinasa

por Aspergillus aculeatus : Aplicación en la clarificación del zumo de

anacardo
RESUMEN:
El procesamiento agroindustrial genera una cantidad exorbitante de residuos
lignocelulósicos, que contribuyen de forma significativa a la huella de carbono.
La producción de importantes enzimas microbianas a partir de estos agro-
residuos no alimentarios podría subvencionar el coste de los procesos
biotecnológicos y garantizar la sostenibilidad. En consecuencia, se recuperaron
aislados fúngicos de muestras de suelos ricos en pectina y se evaluó el aislado
más potente para la producción de pectinasa en medios constituidos con
residuos agroindustriales. El aislado fúngico codificado como NEJC mostró la
máxima producción de pectinasa en el día 8 (262,5 ± 3,53 U/L) del proceso de
fermentación. Entre los agro-residuos evaluados, el aislado mostró el título más
alto de pectinasa (1360 ± 254.55 U/L) cuando la cáscara de mango sirvió como
única fuente de carbono. El hongo aislado se identificó como Aspergillus
aculeatus NEJC (nº de acceso MT951632). Además, la actividad óptima de la
pectinasa se obtuvo a pH y temperatura de 5,5 y 40°C, respectivamente.
Además, la enzima mostró una capacidad significativa de clarificación del zumo
de anacardo al reducir la turbidez con un 44% y un 56% de reducción de la
viscosidad tras 30 min y 60 min de preincubación, respectivamente. Los
resultados del estudio ponen de relieve la importancia de los residuos agrícolas
para la producción sostenible de pectinasa fúngica. Además, las propiedades de
la pectinasa fúngica apuntalaron sus perspectivas de aplicación en la tecnología
de bioprocesos.
INTRODUCCION
Por lo general, las frutas tienden a estropearse antes de llegar a los usuarios
finales o a las instalaciones de procesado. Entre las frutas más comunes se
encuentran la naranja, el plátano, el mango, el anacardo, la manzana, la piña, el
limón, la cereza y la guayaba ( Prajapati et al., 2021 ). Estas frutas se consumen
a diario por sus valores nutricionales, pero son muy perecederas. Su vida útil es
muy baja debido al alto contenido de agua de la vacuola que causa el deterioro
( Conte et al., 2013 ). Por ello, la vía alternativa de conservación de estas frutas
incluye su conversión en zumo de frutas, un producto con mayor vida útil. El
zumo de fruta es un producto no fermentado que se obtiene a partir de frutas
maduras y frescas ( Mihalev et al., 2018 ). Son ricos en nutrientes esenciales,
incluyendo vitaminas, minerales, antioxidantes ( Ruxton et al., 2006 ; Xie et al.,
2007 ), y fuentes de fluidos para el cuerpo, que son vitales para una vida
saludable. Durante los procesos de extracción del zumo, el material celulósico
(pectina) de la pulpa de la fruta se lixivia en el zumo, introduciendo así algunas
características no deseadas como la turbidez en el zumo de fruta. Las pectinas
son polisacáridos estructurales primarios que se encuentran en las paredes
celulares de las plantas, con ácido 1, 4- 𝛼- d -galacturónico ( Mohamed, 2016 ).
La etapa de clarificación es un aspecto importante de la producción de zumo de
fruta, ya que el zumo con alta claridad y valor nutricional es más deseable para
los consumidores ( Nur'Aliaa et al., 2011 ). Varios métodos químicos se utilizan
en la eliminación de la turbidez del zumo, y estos procesos presentan varias
desventajas que incluyen una baja recuperación de zumo, un proceso de
sedimentación de larga duración, y mano de obra intensiva. En lugar de los
métodos clásicos, las enzimas hidrolíticas han mostrado atributos positivos en la
clarificación de los zumos de frutas al descomponer los polisacáridos
estructurales, eliminando la viscosidad y la turbidez, al tiempo que mejoran la
consistencia del producto final ( Prajapati et al., 2021 ). Las pectinasas
microbianas se han identificado como enzimas industriales de alto valor ( Amin
et al., 2021 ), que desempeñan funciones importantes en la producción de
bebidas mediante la eliminación de los componentes de pectina que causan
turbidez ( Nur'Aliaa et al., 2011 ; Minh, 2020 ). La pectinasa es una enzima que
cataliza la despolimerización de la pectina a través de la hidrólisis acoplada con
reacciones de esterificación ( El Enshasy et al., 2018 ). La importancia de la
enzima en el mercado alimentario está creciendo continuamente en los últimos
tiempos, representando el 25% de la venta mundial de enzimas alimentarias e
industriales, debido al aumento de la población mundial que necesita sustento (
Sudeep et al., 2020 ). Aparte de la amplia aplicación de la pectinasa en el
procesado de zumos y vinos, las perspectivas se han extendido a otros
empeños, como la extracción de aceite, el tratamiento de aguas residuales, la
alimentación animal y las industrias farmacéuticas ( Ahmed et al., 2021 ). Los
hongos son buenas fuentes de metabolitos versátiles y se han utilizado
ampliamente para producir enzimas pectinolíticas robustas en fermentación en
estado sólido o sumergido ( John et al., 2020 ). Las pectinasas de origen fúngico
son óptimamente activas en un medio ácido ( Amin et al., 2020 ). Entre las cepas
fúngicas reportadas, las especies de Aspergillus son los aislados líderes en la
producción de pectinasas con relevancia industrial y biotecnológica ( Sudeep et
al., 2020 ). La disponibilidad industrial de enzimas depende principalmente de la
economía del proceso de producción. El uso de residuos no alimentarios ricos
en pectina para producir pectinasas de importancia industrial mediante aislados
fúngicos autóctonos del medio terrestre es un atractivo desde los puntos de vista
ecológico e industrial. La cáscara de arroz, la cáscara de cacahuete, la cáscara
de naranja, la cáscara de ba- nana y la cáscara de mango son algunos de los
materiales de desecho generados por el procesamiento agroindustrial, que
contribuyen significativamente a la huella de carbono; sin embargo, podrían ser
utilizados por microbios para producir productos de alto valor ( Elegbede y Lateef,
2018 ). Se han hecho varios intentos para valorizar estos residuos baratos en
productos valiosos, ya que contenían importantes macro y micro nutrientes (
Maldonado-Celis et al., 2019). Por ejemplo, la cáscara de mango es altamente
rica en fibra cruda (8%), carbohidratos (80%), pectina (13%), así como
contenidos razonables de grasas (2%) y proteínas (4%) ( Wongkaew et al., 2021
) dependiendo de la variedad de la fruta y el estado de ma- madurez (
Maldonado-Celis et al., 2019 ). Este estudio tuvo como objetivo el aislamiento de
cepas fúngicas a partir de muestras de suelo de tierras de cultivo con un alto
depósito de materiales ricos en pectina. Se evaluó la actividad pectinolítica del
aislado más potente en medios constituidos por agro-residuos y se confirmó la
identidad del aislado mediante técnica molecular. La pectinasa fúngica producida
se purificó parcialmente y se aplicó en el proceso de clarificación del zumo de
anacardo.
MATERIALES Y METODOS
2.1. Recogida de muestras, preparación y aislamiento de hongos
Se recogió una cantidad de muestra de suelo (50 g) en un terreno cultivable de
Nsukka (con coordenadas geográficas 6,8429°N y 7,3733°E), Estado de Enugu,
Nigeria, y se diluyó en serie hasta 10 - 5 . Cien mi- crolitros (100 μL) de la muestra
se extendieron en placas de agar papa dextrosa y se incubaron a 37 °C durante
siete días. Tras la incubación, se observaron las placas en busca de presuntos
aislados fúngicos por su aspecto morfológico. Los aislados se subcultivaron en
nuevas placas de agar dextrosa y posteriormente se caracterizaron según lo
descrito por Gilman (Gilman, 1971).
2.2. Producción de pectinasa mediante fermentación sumergida
La producción de pectinasa se llevó a cabo en un matraz de sobremesa (250 mL
de capacidad) conteniendo medio salino basal (100 mL) compuesto de (p/v)
peptona (0. 3%), ZnSO 4 (0,0001%), MnSO 4 (0,05%), MgSO 4 (0,05%), K 2
HPO 4 (0,04%), KH 2 PO 4 (0,06%), FeSO 4 (0,0005%), y glucosa (1%) (
Prajapati et al., 2021 ). Los matraces se esterilizaron en autoclave y, a
continuación, el pH del medio se ajustó asépticamente a 6,0. A continuación, los
matraces se esterilizaron en autoclave. A continuación, los matraces se
inocularon con un cultivo fúngico de 4 días (cuatro bucles de micelio ∅3 mm) y
se incubaron a 30 °C en condiciones de agitación durante 15 días. Se retiraron
alícuotas asépticamente cada día, y el medio se sometió a homogeneización, se
filtró utilizando calicó de cuatro capas y se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min;
y el sobrenadante se utilizó como extracto crudo para determinar la actividad
pectinasa.
2.3. Ensayo de la actividad pectinasa
Para el ensayo de la actividad pectinasa se adoptó el método del ácido
dinitrosalicílico ( Miller, 1959 ), descrito por da Câmara Rocha (2020) con ligeras
modificaciones. Brevemente, se mezcló 1 mL de la enzima cruda con 1 mL de
2% (p/v) de pectina de cítricos (Sigma-Aldrich, EE.UU.) en un tampón de pH 5,0
y se incubó a 40 °C durante 15 min. Tras la incubación, se utilizó 1 mL de solución
de ácido dinitrosali- cílico para detener la reacción enzimática hidrolítica. La
mezcla se agitó a fondo y se colocó en un baño de agua durante 30 min para el
desarrollo del color. Se utilizó una alícuota de la mezcla para determinar la
absorbancia a 540 nm (JENWAY 6304). La concentración de pectinasa que
provocó la liberación de 1 μmol de ácido galacturónico por minuto en las
condiciones del ensayo se definió como una unidad de enzima.
2.4. Determinación del contenido en proteínas
La concentración de proteínas de la solución enzimática se evaluó mediante el
método de Lowry y se utilizó albúmina sérica bovina como proteína patrón (
Lowry et al., 1951).
2.5. Análisis molecular y filogenético del potente hongo aislado
El ADN genómico del potente hongo aislado con el código NEJC se aisló
siguiendo el protocolo establecido por Pryce et al. (2003) . La región del
espaciador transcrito interno (ITS) del ADN genómico se amplificó en
condiciones estándar mediante la reacción en cadena de la polimerasa. V9D: 5
′ -TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3 ′ y LS266: 5 ′ -
GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3 ′ se utilizaron como el conjunto de
oligonucleótidos universales para los cebadores delantero y reverso,
respectivamente ( Hoang et al., 2019 ). Los amplicones se purificaron con kits de
limpieza UltraClean PCR (Applied Biosystems) y se secuenciaron utilizando un
analizador genético 3500 de 16 capilares (Applied Biosystems) y se utilizó ABI
Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied
Biosystems) siguiendo los protocolos del fabricante. La secuencia fúngica se
visualizó con la versión 2.6.6 de Chromas. La secuencia nucleotídica se utilizó
para realizar una búsqueda en la base de datos del Centro Nacional de
Información Biotecnológica (NCBI) con el fin de recuperar secuencias similares.
Después de la recuperación de secuencias de referencia de la base de datos
NCBI, se llevó a cabo la alineación de secuencias múltiples utilizando el
programa ClustalW y el árbol filogenético construido utilizando el método de
unión de vecinos en Molecular Evolutionary Genetics Analysis X (Kumar et al.,
2018).
2.6. Sustitución de los residuos agrícolas por glucosa como única fuente de
carbono
La producción de pectinasa se llevó a cabo en una fermentación sumergida con
un 1% (p/v) de diversos residuos agrícolas (serrín, cáscara de arroz, cáscara de
naranja, plátano y mango y cáscara de cacahuete) como única fuente de
carbono. Los medios de producción constituidos con el medio salino basal y los
agrorresiduos se inocularon con micelio fúngico de cuatro días de edad y se
incubaron durante ocho días a 30 °C. El caldo se homogeneizó y el sobrenadante
se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se utilizó para
determinar la actividad pectinasa y se sometió posteriormente a un proceso de
purificación.
2.7. Purificación de la pectinasa
2.7.1. Precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel El contenido proteico
deseado del extracto crudo se precipitó de la solución utilizando el método de
salado, descrito anteriormente ( Omeje et al., 2020 ). Se añadieron unos 358 g
de sulfato de amonio a 1000 mL de la solución de pectinasa cruda y se dejó
reposar bajo agitación in- termitente. La mezcla se centrifugó a 6000 rpm (30
min) para recuperar el precipitado, y el sobrenadante se llevó al 85% de
saturación. De nuevo, la mezcla se sometió a centrifugación 4 h después de la
incubación. El pellet total recuperado de los dos pasos de saturación con sulfato
de amonio se disolvió en tampón de acetato de sodio (0,1 M; pH 5,5), se
suspendió en una membrana de diálisis (10 nm de tamaño de poro) y se dializó
contra tampón de acetato de sodio durante 24 h con cambios periódicos (4 h) del
tampón. Se introdujeron veinticinco mililitros (100 mL) de la pectinasa dializada
en una columna de vidrio Sephadex G75 (43,0 ×1,5 cm). Subsiguientemente, se
recogieron eluyentes a razón de 2 mL por 5 min, que se utilizaron para determinar
la actividad de la pectinasa y la concentración de proteínas. Las fracciones con
actividad enzimática positiva que mostraron el pico más alto se agruparon y se
utilizaron posteriormente para otras determinaciones analíticas.

Fig 1. Morfología de un hongo axénico aislado NEJC.

2.8. Determinación del pH y la temperatura óptimos
El efecto del pH sobre la actividad de la pectinasa se evaluó entre pH 3,5-9,0 a
intervalos de 0,5 unidades utilizando soluciones tampón 0,1 M de fosfato sódico
(pH 3,5-5,0), acetato sódico (pH 5,5-6,5) y Tris-HCl (pH 7,0-9,0). Asimismo, se
estudió el efecto de diferentes temperaturas sobre la actividad pectinasa, de 30
a 65 °C a intervalos de 5 °C.
2.9. Clarificación del zumo de pulpa de anacardo utilizando pectinasa
parcialmente purificada
Las pulpas maduras de anacardo se recolectaron en la granja agrícola de la
Universidad de Nigeria, en Nsukka. Los frutos se lavaron y trituraron con una
batidora eléctrica. La pulpa se exprimió utilizando un calicó de dos capas para
obtener zumo no clarificado. El zumo se pasteurizó y la temperatura se dejó
enfriar hasta 40 °C. La clarificación del zumo de anacardo se llevó a cabo como
se ha descrito anteriormente ( Prajapati et al., 2021 ) con modificaciones.
Brevemente, el zumo de anacardo se mezcló con pectinasa parcialmente
purificada en una proporción de 1:1 y después se incubó (60 min; 40 °C) en un
baño de agua. El proceso de reacción enzimática se detuvo calentando el tubo
de reacción en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos y, a continuación,
se filtró la solución. Se analizaron varios parámetros fisicoquímicos del filtrado,
como la claridad a 660 nm, el color, la viscosidad y el cambio de pH. La
viscosidad del zumo se determinó con un viscosímetro de Ostwald. El
experimento de control siguió un protocolo similar, salvo que la solución
enzimática utilizada se in-activó por calentamiento antes de mezclarla con el
zumo de anacardo.
3. RESULTADOS
3.1. Aislamiento de hongos y detección de pectinasa
Las cepas fúngicas se recuperaron de muestras de suelo basándose en sus
distintas colonias morfológicas. El cribado primario y secundario de los aislados
para la actividad pectinasa en medios sólidos mostró que el aislado NEJC ( Fig.
1 ) hidrolizaba notablemente la pectina, por lo que fue seleccionado para estudios
posteriores.
3.2. Estudio del curso temporal y producción de pectinasa en residuos
agroindustriales por el aislado NEJC
La producción de pectinasa por NEJC se estudió en función del tiempo, y el
resultado mostró que la actividad peroxidasa aumentaba con el tiempo de
incubación ( Fig. 2 a). La máxima producción de pectinasa se obtuvo en el día 8
con una actividad pectinasa de 262,5 ± 3,53 U/L. Sin embargo, la producción de
la enzima disminuyó consistentemente después del octavo día de incubación,
mostrando una actividad pectinasa de 244 ± 9,89 U/L, 231 ± 7,07 U/L, 212 ± 9,89
U/L y 198 ± 5,66 U/L en los días 9, 10, 11 y 12, respectivamente ( Fig. 2 a). La
mayor actividad pectinasa de 1360 ± 254.55 U/L se registró en presencia de
cáscara de mango ( Fig. 2 b). La utilización de residuos agrícolas como único
carbono mejoró el rendimiento de pectinasa por NEJC hasta 5 veces en
comparación con la glucosa.
3.3. Identidad del potente hongo aislado
La confirmación de la identidad de NEJC basada en la secuenciación de la región
ITS y el análisis filogenético mostró que poseía un 99% de similitud de secuencia
con Aspergillus aculeatus QRF410 (número de acceso KP278205) y Aspergillus
aculeatus MBT102 (número de acceso MK886612), por lo que se identificó como
Aspergillus aculeatus cepa NEJC. La secuencia de nucleótidos se envió al NCBI
GenBank, y se le asignó el número de acceso MT951632 . En la Fig. 3 se
muestra la agrupación de A. aculeatus NEJC y otras secuencias relacionadas.
3.4. Purificación de la pectinasa
La pectinasa extraída se purificó parcialmente utilizando tres pasos de
precipitación con sulfato de amonio, diálisis y filtración en gel. Las fracciones de
pectinasa activa se utilizaron para la caracterización de la enzima y también para
la clarificación del zumo. La pureza y el rendimiento total de la enzima fueron de
3,6 veces y 34,3% respectivamente ( Tabla 1 ). Además, la actividad específica
respectiva y la concentración de proteína tras el último paso de purificación
fueron de 0,36 mg y 725 U/mg.
3.5. Efecto del pH y la temperatura en la actividad pectinasa
Se estudió la influencia del pH en el rendimiento catalítico de la pectinasa NEJC
de A. aculeatus entre pH 3,5-9,0. Los resultados indicaron una actividad óptima
de la pectinasa a pH 5,5, aunque no hubo diferencias significativas entre pH 5,0
y 6,5 ( El resultado indicó una actividad óptima de la pectinasa a pH 5,5; aunque
no hubo diferencias significativas entre pH 5,0 y 6,5 ( Fig. 4 a). La actividad
enzimática en condiciones más ácidas (pH 3,0-4,5) y entre neutras y alcalinas
(pH 7,0-9,0) mostró una actividad relativa inferior al 50%. Se evaluó la
termoactividad de la enzima y se observó que la eficiencia biocatalítica
aumentaba con el incremento de la temperatura y mostraba una actividad óptima
a 40 °C ( Fig. 4 b). Por encima de 40 °C, la actividad de la pectinasa disminuyó
de forma constante, con una actividad relativa del 23% a 65 °C.
3.6. Clarificación del zumo de pulpa de anacardo
La Tabla 2 muestra el potencial de clarificación del zumo de la pectinasa fúngica
de A. aculeatus NEJC. Tras el tratamiento enzimático a 40 °C durante 60 min, se
produjo una disminución de la viscosidad del zumo tratado (0,70 ± 0,02 mPa S)
en comparación con el control (1,60 ± 0,01 mPa S). Del mismo modo, la claridad
del zumo mejoró notablemente tras el tratamiento enzimático, como se muestra
en la Tabla 2 . Además, el pH del zumo de anacardo pasó de 5,8 a 6,24 tras la
aplicación de pectinasa activa.
4. DISCUSION
Los aislados de hongos han sido conocidos por sus tendencias a producir una
amplia gama de metabolitos relevantes para avanzar en una bioeconomía
sostenible ( John et al., 2020 ). El estrés ambiental se ha identificado como un
factor que influye en la distribución de los organismos y la inclinación a un rasgo
particular ( Guan et al., 2017 ; Rocca et al., 2019 ). En consecuencia, los aislados
de hongos se aislaron de una tierra cultivable con un alto depósito de materiales
que contienen pectina. El aislado codificado como NEJC era prometedor para la
producción de pectinasa, ya que expresó un título de pectinasa notable después
de ocho días de incubación en un medio basal suplementado con glucosa como
fuente de carbono. La producción óptima de pectinasa por parte de varias cepas
fúngicas se ha descrito a diferentes tiempos, incluyendo 36 horas,