SEMINARIO: RECEPTORES AhR

Pedro Fernández Salguero catedrático de Bioquímica y Biología molecular en la Universidad de Extremadura dirige grupo de
investigación del cáncer. Uno de los expertos de receptores AhR.

1. CANOCICAL AND NOC-CANONICAL AHR SIGNALLING

Es un FT del citosol que cuando se activa se transloca al núcleo. Se pesaba que era por unión de ligando exógeno, pero ahora se
sabe que existen diversas rutas donde hay un ligando endógeno o simplemente se activa por degradación proteosomal A la
derecha son las rutas de señalización que implica al receptor en funciones no nucleares en el citosol, el receptor se asocia a
diferentes intermediarios de rutas relacionadas con tirosinas quinasas de membrana plasmática o con Wint. De manera que el
receptor hace funciones toxicológicas como FT y no nucleares en el citosol.

2. TOXICIDAD INDUCIDA POR PAHs

En caso de ratón Knock-out para receptor AhR:

- La ausencia del receptor impide que se produzcan fenómenos tóxicos inducidos por dioxinas como es una no atrofia y
ausencia de fenotipo hepático. Se hizo lo mismo para tumor en piel.

- El receptor es necesario para que se produzca el efecto tóxico y carcinogénesis. Sin receptor son insensibles.

3. TOXICIDAD DE LA DIOXINA EN EL DESARROLLO

- La exposición intrauterina a la dioxina induce el cierre incompleto del paladar y defectos en los riñones y las gónadas.

- En el pez cebra la dioxina altera el desarrollo de los órganos y perjudica la regeneración de las aletas. En el caso de los
peces al cortar la cola, esta es capaz de regenerarse. Sin embargo, cuando se trata con dioxina se impide la regeneración.

- EL AhR humano parece ser menos sensible a la dioxina que el receptor de ratón. Por tanto, parece que hay diferencias
de sensibilidad de este receptor en humanos y otros organismos. De manera que cuando se humaniza un ratón, este
expresa la proteína del receptor humano, al tratarlo con dioxina el paladar se cierra completamente.
Cuando se activa el receptor por ejemplo con benzopireno, se
produce un incremento en el daño cerebral cuando se
produce un infarto.

En la izq los ratones tratados con benzopireno tienen una

mayor incidencia daño cerebral. Además, cuando se trata con
antagonisa como CH se tiene el efecto inverso, se protege al
animal respecto al infarto cerebral.

Resumen: cuando se activa el receptor se incrementa el daño.

Estudios en cáncer de mama, al tratar células tumorales de

glándulas mamarias con hexaclorobenceno (agonista del
receptor) se induce muerte celular (apoptosis), y se ve un
aumento en la expresión del receptor. Al igual que sucede con
fibroblastos transformados tumorales donde se produce un
incremento en la expresión del gen diana de AhR: CYP4501A1.
Por tanto, el receptor es necesario para apoptosis tumoral y se
produce por activación transcripcional.

4. PAPEL ENDÓGENO DE AhR

- En ratones KO que tienen un fenotipo hepático portal con incremento de fibrosis, en ausencia de receptor y ligando el
ratón tiene un fenotípico hepático portal. De forma que una unión portosistémica que se tiene que resolver durante el
desarrollo embrionario como sucede en un ratón normal, en mutantes no se produce y por tanto tienen un defecto de
circulación hepática endógeno. En ratones tiene AhR tiene funciones en los sistemas hepático, gonadal, cardiovascular
e inmunológico.

- En C elegans AhR-1 modula la diferenciación del SNC y el posicionamiento celular espacial.

- En mosca que expresa un heterólogo del receptor de mamífero, denominado spineless (ss), cuando no tienen receptor
se forma un fenotipo acusado en las patas, alas y ojo. En mosca el receptor está activado endógenamente en ausencia
de ligando, es constitutivamente nuclear, regula el desarrollo de los ojos y las alas, pero no se une a las dioxinas (son
insensibles a dioxinas).
Desde el punto de vista evolutivo, el receptor tiene funciones endógenas independientes de dioxina (dioxina no tiene función
primordial). Por tanto, el receptor tiene un papel importante en fisiología pues participa en la homeostasis y en patología
(toxicológico) que es una función exacerbada.

5. INVESTIGACIONES DE DIVERSOS PROCESOS DONDE INTERVIENE AhR

Diferenciación: implica que de una célula pluripotente o totipotente se acaba diferenciando. Se estudia como el receptor está
implicado en la regeneración de las células Stem y cómo ello implica regeneración pulmonar, hepática y en piel. Esto se asocia
con la reprogramación tanto in vitro como in vivo. Y esto a su vez se asocia con progresión tumoral por activación oncogénica.
 Diferenciación y regeneración:

Desde hace mucho tiempo se consideraba que la cascada de diferenciación que hace que una célula totipotente, la célula se divide
y cae en un proceso de diferenciación hasta célula unipotente (diferenciada). Se suponía que esta célula tiene definido un patrón
de expresión génica irreversible. Sin embargo, los experimentos de Shinya Yamanaka y John Gurdon demostraron que se puede
reprogramar. De forma que una célula diferenciada puede volver a ser pluripotente, revertiendo la cascada. Esto permite que,
partiendo de una célula diferenciada como un fibroblasto,
hepatocito se puede reprogramar (desdiferenciar) hasta
células pluripotenciales y estas diferenciarse hacia cualquier
tipo de célula.

Existe un ciclo por el cual una célula pluripotente se diferencia,

se reprograma y se puede volveré a diferenciar a otro tipo
celular diferente.

Regeneración pulmón:

En los experimentos se cogen ratones con o sin receptor se

trata con napthaleno y se ve como se regenera el pulmón.
La imagen es un corte del pulmón, el naftaleno mata las
células y en función de si tiene receptor se regenera o no.

Los ratones KO (no tienen receptor) regeneran antes el

epitelio que los ratones silvestres.

La regeneración en el epitelio pulmonar se debe a células

Stem (células madre, basales neuroepiteliales). En los
ratones KO tienen una activación prematura de ese número
de células Stem.

Además, esta capacidad de regenerar está

asociada con la expresión de genes de
pluripotencial y reprogramación OCT4 y NANOG.
 Regeneración en hígado:

En hígado se hace al igual que antes experimentos con

ratones con y sin receptor. Se tratan con agente que
induce necrosis hepática (CCl4) y al igual que antes la
capacidad de regenerar es mayor en organismos sin
receptor.

Se miran marcadores de células madre hepáticas: CK14,

TBX3 y β-Catenina. Viendo que la activación de estas
células con fenotipo Stem es mucho mayor en organismos
KO.

Aumenta el número de células SP y OCT4 y NANOG.

CONCLUSIONES:

En ausencia de receptor se favorece un fenotipo de pluripotencial y de indiferenciación que hace que el proceso de regeneración
sea más rápido y eficiente en el tiempo con respecto al organismo silvestre. La inhibición de la activación del receptor de manera
controlada con inhibidores farmacológicos no tóxicos podría ser una herramienta para incrementar la capacidad de regeneración
hepática importante en terapia.

- La activación temprana de células madre pluripotentes

mejora la regeneración tisular en ausencia de AhR.
- El déficit de AhR induce un fenotipo basal indiferenciado
que favorece la regeneración tisular.
 Desde el punto de vista quirúrgico, la regeneración del hígado inducido por PHx:

El hecho de no tener receptor (AhR -/- ) regenera más rápido pero tiene la contrapartida de que se favorece la activación de células
madre tumorales por lo que aumenta la carcinogénesis hepática, disminuyendo la capacidad de supervivencia.

De forma que, si se tratan ratones con

dietilnitrosamina, los ratones que no tienen receptor
tienen muchos tumores y esto afecta a la capacidad
de supervivencia→ grafica líneas azul y roja.

Además, en ratones envejecidos sucede lo mismo.

Regeneración de la piel:

A medida que las células de la piel se mueven en altura, aumenta la diferenciación.

El pelo se regenera a partir de las células madre que están en la zona basal, van migrando hacia arriba y regenera el pelo.
En el experimento se cogen ratones de 3 días con y sin
receptor, se pueden aislar las células epiteliales de la piel y las
de la dermis. Si se combinan en una proporción determinada
(se mezclan las células) y se implantan en el dorso de los
ratones sin piel, se regenera la piel y el pelo.

Las células procedentes de ratones que no tienen receptor

regeneran peor que las que si tienen. Al revés que lo
explicado en hígado y pulmón.

La función del receptor en ciertos tejidos no se comporta de

la misma manera, en algunos tejidos limita (pulmón e hígado)
y en otros promueve (piel) la regeneración.

- Keratinocito AhR tiene efectos autocrino en la regeneración de la piel.

- Stromal AhR parece tener un papel menos relevante.
- Los genes epidérmicos progenitores entre los genes específicos de la protuberancia son regulados en ausencia de
expresión de AhR.

Ensayos in vitro se cogen células de la piel, se crecen en

monocapa en una palca de cultivo, se añade un medio de
diferenciación y en la propia placa se regenera una piel
completa (en la imagen se observa la membrana (línea
fina de abajo) donde han crecido las células y la piel
formada)

Cuando no hay receptor se reduce la capacidad de

regeneración.

CONCLUSIÓN: En piel el receptor promueve la diferenciación.

 Reprogramación in vitro y en vivo:

In vitro se cogen fibroblastos de ratones que tienen o no

receptor. Estos fibroblastos expresan genes de
reprogramación, se infectan con retrovirus que expresan
shAhR para inactivar el receptor. Al tratar los fibroblastos
infectados con Doxitulina se ve que la capacidad de
reprogramación es mayor en los que no tienen receptor.

In vivo si se cogen los ratones (Rosa26) y se cruzan con ratones

sin receptor, se obtienen ratones con y sin receptor. Al
tratarlos con DOX se induce la reprogramación de tejidos
diferenciados hacia indiferenciados. Al hacer esto in vivo los
ratones sufren procesos de carcinogénesis, se forman células
madre tumorales. De forma que los ratones con receptor
tienen tasa de tumores que en condiciones normales
normalmente no está, pero si además se le quita el receptor
aumenta aun más dicha tasa.

Reprogramación y senescencia:

En senescencia celular, no se mueren ni proliferan. Parece que se activan cuando se induce reprogramación y la célula senescente
que se genera en los tumores incrementa la capacidad de desarrollo tumoral. De forma que cuando se reprograman los tejidos no
solo se produce desdiferenciación que hace que haya células madre tumorales sino que también se generan células senescentes
dentro del propio tumor que potencia aun mas el desarrollo tumoral.
 Inducción tumoral y oncogenes: AhR and human K-Ras

Ratones que expresan de manera inducible el oncogén

humano k-Ras que tienen la mutación G12D, la más
frecuente en tumor de pulmón en humanos. Los
ratones con el oncogén se cruzan con ratones AhR
nulos y se obtienen ratones con oncogén con y sin
receptor.

Ambas líneas se tratan con adenovirus y cuando se

integra la proteína Cre, Cre libera un codón de parada
y se activa el oncogén induciendo procesos tumorales.

Los ratones sin receptor tienen una progresión

tumoral más rápida.

Patrón de expresión de proteínas características de células madre en pulmón como SPTC, Sox2, Aldh1 y Lgr5:

*Las imágenes están al revés.

Arriba es AhR-/-.

CONCLUSIÓN: la ausencia o deficiencia del receptor AhR podría ser un factor que potenciara la capacidad oncogénica de K-Ras en
pulmón.

6. CONCLUSIONES
AhR→ la presencia del receptor limita la pluripotencia y favorece la diferenciación. Pero cuando los niveles de receptor bajan se
produce reprogramación y regeneración, así como progresión tumoral.