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Protocolo Enzima Colagenasa
Protocolo Enzima Colagenasa
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Protocolo de investigación
Enzimología y Biocatálisis
Agosto-Diciembre 2022
Profesora:
Dra. Karla Patricia Mayolo-Deloisa
Integrantes Matrícula
Laura Sofía García Arreola (Investigador) A00818725
Cheyra Lizeth Dávila Pérez (Director) A00824501
Melina Lizeth Figueroa Montes (Investigador) A01636348
Nancy Guadalupe Catalán López (Analista) A01423819
I. Resumen
Las colagenasas son proteínas que catalizan procesos químicos y rompen enlaces
peptídicos del colágeno. El uso de esta proteína de manera inyectable o en forma de
ungüento puede resultar útil para la degradación del colágeno de la piel debido a sus
propiedades terapéuticas en la cicatrización de heridas, quemaduras y algunas
enfermedades como la cicatrización queloide. Por esta razón es que por medio del
presente trabajo se desarrolló un protocolo para la produccion y purificacion de dos
tipos de colagenasa (I y II), a partir de la bacteria Clostridium histolyticum, la
evaluación de su actividad enzimática, así como el posterior desarrollo de un
ungüento empleando dicha colagenasa, cuyo objetivo será corregir las cicatrices de
quemaduras y cicatrices queloides. Dicho producto recibirá el nombre de
“Cicatrenasa”, y se espera que actúe aumentando la adhesión, migración y
proliferación de los monocitos que intervienen en las fases de la cicatrización
generando que las heridas cierren. Se espera además que nuestro producto presente
una alta actividad enzimática y que sea eficaz por medio del tratamiento que se
propone para su aplicación, siendo que deberá ser colocado de manera directa en la
cicatriz queloide o por quemadura en el paciente cada 12 horas durante 15 días, y
cuyo avance también deberá ser monitoreado para determinar su continuidad.
Abstract
Collagenases are proteins that catalyze chemical processes and break collagen peptide
bonds. The use of this protein injectable or in the form of an ointment can be useful
for the degradation of skin collagen due to its therapeutic properties in the healing of
wounds, burns and some diseases such as keloid healing. For this reason, through this
work, a protocol was developed for the production and purification of two types of
collagenase (I and II), from the bacterium Clostridium histolyticum, the evaluation of
its enzymatic activity, as well as the subsequent development of an ointment using
said collagenase, in order to correct burn scars and keloid scars. This product will be
called “Cicatrenase”, and it is expected that it will act by increasing the adhesion,
migration and proliferation of the monocytes that are involved in the healing phases,
causing the wounds to close. It is also expected that our product has a high enzymatic
activity and be effective through the proposed treatment for its application, since it
must be placed directly on the keloid scar or by burn in the patient every 12 hours for
15 days, and whose progress should also be monitored to determine its continuity.
II. Introducción
El colágeno es una proteína muy presente en la piel, con un promedio del 75% del
peso seco en la piel. Este es una proteína dominante, la cual debe dividirse para permitir la
separación de las escaras. La colagenasa es una enzima exógena que descompone el colágeno
nativo y desnaturalizado, siendo su principal ventaja que no degrada el colágeno sano y
normal (Ostlie, 2021). La colagenasa está aprobada por la FDA para el tratamiento de
quemaduras, siendo principalmente utilizada para la eliminación de escaras. Dicha enzima
actúa descomponiendo la molécula de colágeno desnaturalizado que está presente en el tejido
quemado. Es entonces cuando los productos de degradación se pueden eliminar
mecánicamente del lecho de la herida, con el objetivo de acelerar el desbridamiento y la
cicatrización de la herida (Pham et al., 2019).
Actualmente, el desbridamiento y el injerto son considerados el estándar de atención
para reducir la inflamación y el riesgo de infección que pueda retrasar u obstruir la
cicatrización. La eliminación del tejido necrótico tiene múltiples beneficios en la resolución
de las quemaduras, como la eliminación de las fuentes de nutrientes para el crecimiento
microbiano, la atenuación de las respuestas inmunitarias prolongadas, la minimización del
daño a la red microvascular por componentes celulares, la prevención de la evaluación clínica
tardía y el potencial de una reepitelización más rápida (Frederick et al., 2021). Estudios
recientes han demostrado que, para una correcta sanación de la herida, se requieren dos partes
esenciales: la primera es la escisión tangencial temprana para eliminar gradualmente las capas
de tejido muerto; la segunda se basa en el uso de agentes tópicos para apoyar el cuidado local
de la herida y asimismo asegurar su delimitación. Uno de los agentes tópicos más utilizados
en la práctica clínica hace uso de la colagenasa de Clostridium, derivada de Clostridium
histolyticum.
French et al. (1992) y estudios posteriores de Kim et al. (2007) demostraron que la
colagenasa clostridial ayuda en la eliminación continua del tejido necrótico y acumulado
mientras deja intacto el tejido sano. Aunque el uso clínico de la colagenasa clostridial ha sido
bien documentado y muestra resultados prometedores en comparación con otros agentes
tópicos, Das et al. (2018) reveló en su investigación sobre la reparación y regeneración tisular
la capacidad única de la colagenasa derivada de Clostridium histolyticum para modular la
respuesta inflamatoria. En particular, el desbridamiento con colagenasas clostridiales afecta la
polarización de los macrófagos desde el estado proinflamatorio hasta el estado regenerativo
en heridas agudas y crónicas. Esta transición permite la estimulación de la secreción de
citoquinas y factores de crecimiento involucrados en la pro-resolución (Frederick et al.,
2021). Además, los subproductos generados de la escisión del colágeno producidos a través
del desbridamiento con colagenasa clostridial contribuyen a la quimiotaxis y proliferación de
fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales (Sheets et al., 2016; Shi et al., 2010).
III. Objetivos
A. General
Producir un ungüento a partir de la enzima colagenasa que socorra en el
tratamiento de quemaduras y cicatrización queloide mediante la disminución
del tiempo de cicatrización de heridas y minimización del dolor.
B. Específicos
● Definir un protocolo para la producción y purificación de colagenasa.
● Definir un protocolo para determinar la actividad enzimática de la
colagenasa.
● Definir un protocolo para la elaboración de un ungüento para el
tratamiento de quemaduras y cicatrices queloides a partir de
colagenasa.
Ensayo de colagenasa
Se colocarán 25 gramos de colágeno triturado sin desnaturalizar en un tubo de ensayo
de 0.1 mL de una solución acuosa al 0.1% de la enzima liofilizada y 5 mL de buffer tris. La
composición de este buffer debe ser:
tris(hidroximetil) aminometano, 0.2 M - 50 mL
- HCl, 0,2 M - 44.2 mL
- Acetato de calcio, 0.02 M - 100 mL
- Agua destilada - qs. a 200 mL
Se preparará un tubo de control A con los mismos componentes que el anterior pero
sin agregar la enzima. Luego deberá prepararse un tubo B pero sin agregar el colágeno (este
tubo sí deberá contener la enzima). Se preparará un tercer tubo de control C con los mismos
compuestos pero en lugar de la colagenasa se le añadirán 0.1 mL de tripsina al 0.1% (Armour
Pharmaceutical Co., Kankakee, IL). Cada uno de los 4 tubos deberá incubarse a una
temperatura de 37°C durante 24 horas. Después de la incubación, se decantarán 0.5 mL del
sobrenadante claro de cada tubo y se colocarán en un matraz volumétrico de 10 mL. A cada
matraz volumétrico se deberá añadir 1 mL de solución acuosa de ninhidrina al 1% y 1 mL de
solución acuosa de puridina al 5%. Los matraces volumétricos deberán ser colocados en un
baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Se agregará suficiente agua destilada para
alcanzar un volumen total de 10 mL y las soluciones de prueba serán leídas en un colorímetro
fotoeléctrico Klett a 570 milimicras contra el control. La actividad colagenasa se expresa en
unidades C. Una unidad C representa la lectura de densidad óptica calculada que se obtiene
cuando un miligramo de enzima actúa sobre 25 miligramos de colágeno en las condiciones
anteriores. La colagenasa deberá tener una actividad mínima de 40,000 unidades U por
gramo, de lo contrario, se descartará.
V. Resultados esperados
Se espera que la cepa seleccionada Clostridium histolyticum MB 204 sea eficaz y que
se pueda obtener la colagenasa de tipo I y tipo II, ya que, Berková y compañìa (2018)
determinaron a través de una prueba PCR la presencia de dos genes que codifican a la
colagenasa; ColG que codifica la colagenasa de tipo I y CoIH que codifica la colagenasa tipo
II. A su vez, al usar un medio de cultivo de triptona se espera que se optimice la fermentación
y mejore la producción de colagenasa, ya que los resultados obtenidos por estos mismos
autores muestran que este medio presentó una actividad de la colagenasa.
Después del proceso de fermentación, se espera que en el método de purificación de
la enzima a través de las cromatografías y eluciones, ayuden a obtener una mayor actividad
enzimática y un alto factor de purificación, ya que en un estudio realizado por Kurfürst y
compañía (2006) este conjunto de metodologías lograron que de la colagenasa II se obtuviera
una actividad específica de 13000 U/g y de a colagenasa I 3000 U/g, cuando lo ideal se
estimaba de 18000 U/g y 5000 U/g respectivamente. No obstante, los resultados de las
actividades enzimáticas que se desean esperar con esta purificación, tomando como
referencia los que se obtuvieron, son perfectos para la preparación del ungüento. Con la
irradiación, que ayudará a la esterilización para garantizar la seguridad y fiabilidad del
producto, se espera que se tenga una pérdida mínima de la colagenasa y que en el ensayo de
actividad enzimática se obtenga un valor de al menos 4,000 U/g.
Finalmente, con la metodología propuesta, se espera desarrollar un ungüento para el
tratamiento de quemaduras y cicatrices queloides de una mezcla de dos tipos de colagenasa (I
y II) para tener una mayor actividad enzimática, ya que, en conjunto son capaces de disociar
las matrices de tejido extracelular de una manera más rápida, permitiendo así una
recuperación más rápido. Debido a que, la colagenasa del tipo I tiene el equilibrio original de
la actividad de esta enzima, mientras que la colagenasa tipo II contiene niveles relativamente
más altos de actividad de proteasa. Asimismo, se ha demostrado que la colagenasa del tipo I y
II son menos eficaces en digerir colágeno o tejido estando separadas, en comparación de una
mezcla de ambas formas donde se tiene una disociación más rápida y un mayor rendimiento
(Wolters et al., 1995).
Además, en estudios recientes se ha demostrado que el uso de colagenasa ha traído
grandes beneficios y se ha vuelto como una herramiento terapéutica valiosa que puede servir
en diferentes etapas del proceso de cicatrización como en el caso de Mengarelli y Cevallos
(2015) donde después de ocho semanas se logró la cicatrización de una herida de un paciente
con colagenopatía (Fig. 1). Por otra parte, se encuentran Vaccalluzzo y Mengarelli (2017)
quienes implementaron el uso de la colagenasa en un paciente con una úlcera por una
quemadura, donde la evolución clínica con el uso de la enzima fue favorable, evidenciándose
el cierre de la herida a las siete semanas (Fig. 2). En cuestión a las cicatrices queloides, se
tiene al tratamiento propuesto por Montero y compañía (2021) quienes hacían uso de una
colagenasa recombinante, en donde al cabo de seis meses hubo una evolución en la reducción
del volumen de las cicatrices, pero finalmente seis meses después fue cuando se vió el mayor
efecto (Fig. 3).
Fig 1. Tratamiento de colagenasa en úlcera por quemadura. A. Día 0, úlcera en la pierna. B. Semana 8, úlcera
completamente cicatrizada. Fuente: Mengarelli y Cevallos, 2015.
Fig 2. Cierre de herida con colagenasa en paciente con colagenopatía después de siete semanas. Fuente:
Vaccalluzzo y Mengarelli, 2017.
Fig. 3. A. Cara anterior del brazo derecho al inicio del tratamiento con colagenasa recombinante. B. Evolución
tras seis meses de tratamiento. C. Control seis meses después del último tratamiento. Fuente: Montero et al.,
2021.
Por todo lo anterior, es que se cree que el ungüento con la enzima colagenasa, ayudará
al proceso de cicatrización de quemaduras generando un incremento en la adhesión,
migración y proliferación de monocitos que ayudarán en todas las fases de la cicatrización
favoreciendo el cierre de las heridas. Asimismo, se espera que sirva como tratamiento para
cicatrices queloides, en donde se tenga una aplicación asequible y en pocas sesiones sin tener
alguna recaída a través de los años. El ungüento al ser la mezcla correspondiente de vaselina,
enzima y Strep-Combiótico, se desea que se tenga una estabilidad entre los componentes y
que pueda tener una alta vida de anaquel, en un promedio de 48 semanas a temperatura
ambiente.
Dicho ungüento recibirá el nombre de “Cicatrenasa”, en una presentación de 50 g, el
tratamiento para su aplicación consiste en ser aplicado cada 12 horas durante un periodo de
15 días, realizando evaluaciones periódicas (de preferencia, semanales) de la mejora en la
cicatriz del paciente, para determinar si el tratamiento debe continuar.
Fig 4. Imagen ilustrativa del producto.
VI. Referencias
1. Berková, Z., Saudek, F., Leontovyč, I., Benešík, M., & Štveráková, D. (2018). Testing
of a New Collagenase Blend for Pancreatic Islet Isolation Produced by Clostridium
histolyticum. Advances in Bioscience and Biotechnology, 09(01), Article 01.
https://doi.org/10.4236/abb.2018.91003
2. Chiulli, A., & Wegman, E. (1974). U.S. Patent No. 3,821,364. Washington, DC: U.S.
Patent and Trademark Office.
3. Das A., Sinha M., Datta S., Abas M., Chaffee S., Sen C.K., Roy S. Monocyte and
macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am. J. Pathol.
2015;185:2596–2606. doi: 10.1016/j.ajpath.2015.06.001.
4. Frederick, RE., Bearden, R., Jovanovic, A., Jacobson, N., Sood, R., Dhall, S. (2021).
Clostridium Collagenase Impact on Zone of Stasis Stabilization and Transition to
Healthy Tissue in Burns. Int J Mol Sci. 22(16):8643. doi: 10.3390/ijms22168643.
PMID: 34445347; PMCID: PMC8395468.
5. French M.F., Bhown A., Van Wart H.E. (1992). Identification of Clostridium
histolyticum collagenase hyperreactive sites in type I, II, and III collagens: Lack of
correlation with local triple helical stability. J. Protein Chem.11:83–97. doi:
10.1007/BF01025095.
6. Hansbrough J., Achauer, B., Dawson, J., Himel, H., Luterman, A., Slater, H.,
Levenson, S., Salzberg, C., Hansbrough, B., Doré, C. (1995). Wound healing in
partial-thickness burn wounds treated with collagenase ointment versus silver
sulfadiazine cream, J Burn Care Rehabil,16(3):241-7.
7. Kim M., Hamilton S.E., Guddat L.W., Overall C.M. (2007) Plant collagenase: Unique
collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger. Biochim. Biophys.
1770:1627–1635. doi: 10.1016/j.bbagen.2007.08.003.
8. Kurfürst, M., & Schmidbauer, S. (2006). Method for purifying enzymes from
clostridium histolyticum using multi-stage chromatography (United States Patent No.
US7083964B2). https://patents.google.com/patent/US7083964B2/en
9. Mengarelli, R., & Cevallos, M. (2015). El valor de la colagenasa en heridas agudas y
crónicas. Revista argentina de dermatología, 96(3), 61-67. Recuperado de
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1851-300X2015000300
009&lng=es&tlng=es.
10. Montero, M., Solís, J., Ramírez, M., Sánchez, E. Tratamiento con enzima
recombinante tipo colagenasa en una paciente con cicatrices hipertróficas por
quemadura. Dermatología Revista Mexicana, 65 (1): 73-77. DOI:
https://doi.org/10.24245/dermatolrevmex.v65i1.5053
11. Ostlie, DJ., Juang, D., Aguayo, P., et al. (2012) Topical silver sulfadiazine vs
collagenase ointment for the treatment of partial thickness burns in children: a
prospective randomized trial. J Pediatr Surg;47(6):1204–1207.
12. Pham, CH., Collier, ZJ., Fang, M., Howell, A., Gillenwater, TJ. (2020). The role of
collagenase ointment in acute burns: a systematic review and meta-analysis,
28(2):9-15. Doi:10.12968/jowc.2019.28.Sup2.S9
13. Sabatino, G. L., JR, B. J. D. T., Bassett, P. J., Tharia, H. A., & Hitchcock, A. G.
(2011). Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases (United
States Patent No. US20110243920A1).
https://patents.google.com/patent/US20110243920/en
14. Sheets A.R., Demidova-Rice T.N., Shi L., Ronfard V., Grover K.V., Herman I.M.
(2016). Identification and Characterization of Novel Matrix-Derived Bioactive
Peptides: A Role for Collagenase from Santyl® Ointment in Post-Debridement
Wound Healing? PLoS ONE.11:e0159598.
15. Shi L., Ermis R., Garcia A., Telgenhoff D., Aust D. (2010). Degradation of human
collagen isoforms by Clostridium collagenase and the effects of degradation products
on cell migration. Int. Wound J.7:87–95. doi: 10.1111/j.1742-481X.2010.00659.x.
16. Vaccalluzzo, R. & Mengarelli, R. (2017). Uso de colagenasa en úlcera de pierna y
seguimiento de su evolución. CicatrizAr Revista de la Asociación Interdisciplinaria
Argentina de Cicatrización de Heridas, 3, 5, p: 24-31
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17. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., & van Schilfgaarde, R. (1995).
Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat
pancreatic islet isolation. Diabetes, 44(2), 227–233.
https://doi.org/10.2337/diab.44.2.227