“UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL

PERU”
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA

VELOCIDAD DE REACCION DE UN
FERMENTADOR EN MEDIO SOLIDO PARA LA
OBTENCION DE BIOMASA RICA EN PROTEINAS.

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

REALIZADO POR:

 LUCAS ROSALES, Jorge Jonathan

Alumno de la Facultad de Ingeniería Química

HUANCAYO – 16- 07-2014

1
TABLA DE CONTENIDO

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA..........................................................................4

1.1 DESCRIPCIÓN DE LA REALIDAD PROBLEMÁTICA........................................4

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.......................................................................4

1.3 OBJETIVOS...............................................................................................................4

1.3.1 Objetivo general.........................................................................................4

1.3.2 Objetivos específicos.................................................................................4

1.4 JUSTIFICACIÓN.......................................................................................................5

1.5 LIMITACIONES........................................................................................................5

2. MARCO TEÓRICO..........................................................................................................6

2.1 ANTECEDENTES.....................................................................................................6

2.2 MARCO CONCEPTUAL........................................................................................14

2.3 FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS.........................................................................30

3. METODOLOGÍA............................................................................................................31

3.1 DISEÑO METODOLÓGICO..................................................................................31

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA...................................................................................32

3.3 CARACTERIZACION DEL SUSTRATO:.............................................................33

3.4 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES........................................................39

3.5 PLAN DE TRABAJO..............................................................................................39

2
 3.6 FINANCIAMIENTO...............................................................................................40

A. PRESUPUESTO.......................................................................................................40

3.7 MATRIZ DE CONSISTENCIA...............................................................................42

4. RESULTADOS...............................................................................................................43

4.1 PROGRAMA DE SIMULACION EN MATLAB:..................................................43

4.2 RESULTADOS DE LA SIMULACION:................................................................45

5. REFERENCIAS...............................................................................................................46

3
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1 DESCRIPCIÓN DE LA REALIDAD PROBLEMÁTICA

En la ciudad de Huancayo no existe una compañía que se dedique a la manufactura de la

biomasa rica en proteínas. Además en las instalaciones de la facultad de ingeniería química no

existe una tecnología para producir la biomasa rica en proteínas ni siquiera a escala de

laboratorio. Por otro lado la producción de biomasa rica en proteínas por medio de la

fermentación en medio solido tiene mayores rendimientos que en la fermentación sumergida.

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

1.2.1 Problema general

¿Qué factores influyen en velocidad de fermentación en un reactor de fermentación en

estado sólido?

1.2.2 Problemas específicos

¿Cuál es el tiempo óptimo de fermentación del sustrato?

¿Cuál es la caracterización biológica – química del sustrato a utilizar?

¿Cómo diseñar un biorreactor de fermentación en estado sólido a escala laboratorio?

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general

Determinar los factores que influyen en la velocidad de fermentación en un reactor de

fermentación en estado sólido

1.3.2 Objetivos específicos

Determinar el tiempo óptimo de fermentación del sustrato

Caracterizar el sustrato a fermentar

Diseñar un biorreactor de fermentación en estado sólido escala laboratorio.

4
 1.4 JUSTIFICACIÓN

Entre los compuestos más importantes y que se descargan al medio ambiente en nuestra

localidad están los desechos orgánicos propio de la agricultura y de los desechos domésticos. La

relevancia de estos compuestos es que pueden ser tratados y darles un uso amplio, por ello que

existe el interés de implementar procesos que permitan el tratamiento de este tipo de compuestos.

Si bien existen estudios relacionados con fermentación en medio sólido esta aun

realizándose para llevarlo a una escala industrial, ya que la mayoría de investigaciones son

realizadas a una escala laboratorio. Sin embargo se ha investigado desde hace algunos años la

potencialidad de este tipo de fermentación y los múltiples compuestos que se obtienen, como.

Etanol, enzimas, antibióticos, hongos comestibles, ácidos orgánicos, aminoácidos, pigmentos,

metabolitos secundarios, etc.

Las ventajas de este proceso son:

• Pequeño volumen de mosto parcialmente fermentado y el volumen del reactor, lo

que resulta en el fondo de maniobra menor costos

• Menor riesgo de contaminación debido a la baja niveles de humedad

• Separación del producto Fácil (Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007)

1.5 LIMITACIONES

Dificultad en el control de temperatura y humedad. Poco volumen utilizado en el reactor y

daños en el micelio (Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007).

5
 2. MARCO TEÓRICO

2.1 ANTECEDENTES

T. Robinson, D Singh y P Nigam (2001). Fermentación en estado sólido: una tecnología

microbiana promisoria para la producción de metabolitos secundarios.

La fermentación en estado sólido (FES) se ha usado exitosamente para producción de

enzimas y metabolitos secundarios. Estos productos están asociados con la fase estacionaria de

crecimiento microbiano y son producidos a escala industrial para su uso en agricultura y en el

tratamiento de enfermedades. Muchos de esos metabolitos secundarios son producidos aun en

fermentaciones liquidas sumergidas (FLS), aunque a través de su producción este método ha

mostrado ser menos efectivo que la FES, ya que la producción a gran escala se incrementa

asimismo lo hacen los costos y la demanda energética. La FES ha mostrado que produce un

producto más estable, requiere menor energía, en fermentadores más pequeños que facilitan el

proceso de separación de los productos (downstream). En este artículo los autores revisaron una

importante área de la biotecnología, donde la evidencia reciente indica que las bacterias y los

hongos creciendo bajo condiciones de FES, son capaces de suplir en la demanda global de

metabolitos secundarios (Robinson – Nigam, 2001)

6
 J.C. Dustet, J.J. Peña, Wuilmaris Perez y Milene Díaz (2002). Evaluación de un nuevo

prototipo de biorreactor para fermentaciones en estado sólido de residuos fibrosos.

Se evaluó un fermentador rectangular para estado sólido, con capacidad de 8 kg mediante la

fermentación con un hongo de la especie Aspergillus niger, se utilizó como soporte solido el

bagazo de caña .los resultados demostraron la eficiencia del diseño para mantener, Durante la

operación, la homogeneidad de las variables de control, porcentaje de humedad y temperatura del

cultivo. La homogeneidad del resto de las condiciones de operación se caracterizó mediante la

media y la varianza de las variables medidas en 15 zonas del equipo. Los resultados de las

variables en las dos fermentaciones realizadas fueron: pH (5,98 y 3,16 respectivamente), todos

para 95% de confianza. En la fermentación, se obtuvo un producto con 6.1 % de PV a las 48 h.

los resultados permiten comparar la eficiencia de este equipo con respecto a otro similar

informado en la literatura (Dustet, 2002).

H. A. Ruíz-Leza, R. M. Rodríguez-Jasso, R. Rodríguez-Herrera, J. C. Contreras-Esquivel y

C. N. Aguilar (2007). Diseño de biorreactores para fermentación en medio sólido

En años recientes ha existido un gran interés en los procesos de fermentación en medio

sólido por los altos rendimientos que se han obtenido en la producción de metabolitos de alto

valor agregado de interés industrial, por lo que se han llevado a cabo investigaciones en el diseño

de biorreactores en busca de que sean aplicados a nivel industrial. En el presente trabajo se llevó

a cabo una revisión de los principales equipos diseñados para los bioprocesos en cultivo sólido

(Ruíz, 2007).
7
 L.O. Miranda, A. Tomasini, A. Mejía y J. Barrios-González. Efecto del mezclado y la

adición de agua y lactosa sobre la producción de penicilina por Penicillium chrysogenum

por fermentación en estado sólido.

Se diseñó y construyó un reactor para estudiar el efecto del mezclado y la adición de agua y

nutrientes, sobre la producción de penicilina por fermentación sólida. La producción del

antibiótico en el fermentador estático fue 68.5% mayor que en columna. Se encontró que un

mezclado suave y limitado, de 2 min/día a 5 rpm, tiene un fuerte efecto positivo sobre la

producción de antibiótico, y que con 4 min/día se obtiene un mezclado adecuado del medio

sólido. La adición de agua al reactor (15 ml/día) permitió extender la fase de producción hasta las

144h, aunque a una tasa de producción relativamente baja. (Barrios-Gonzáles, 1988)

María Caridad, Julian Ricardo, Luis B. Ramos Sanchez (2007). Fermentación en estado

sólido (I). Producción de alimento animal.

Importantes avances se reportaron en el desarrollo de bioprocesos y productos mediante

fermentación en estado sólido (FES), se destaca su uso en biorremediacion y biodegradación de

compuestos contaminantes, en la transformación biológica de residuos agroindustriales y en

biopulpeo, en la producción de compuestos bioactivos, de enzimas, de ácidos orgánicos,

biopesticidas, biocombustibles y compuestos aromáticos. En este artículo se presenta un análisis

de su definición y aplicaciones en el enriquecimiento nutricional de los residuos agroindustriales

destinados a la alimentación animal, se encuentra un creciente interés tanto en los resultados en el

incremento microbiano como por la formación de productos (Caridadad-Sanchez, 2007)

8
 Alberto Duarte T. y Gustavo Buitrago H. Desarrollo de un equipo de tambores rotatorios

para la fermentación de subproductos agroindustriales en medio sólido.

• Los resultados obtenidos, indican que en el. Equipo desarrollado se obtienen resultados

confiables y reproducibles lográndose un control aceptable de la temperatura y humedad y un

control preciso del grado de agitación y mezcla del sustrato.

• Los gradientes de temperatura que se presentan entre tambores, en todos los ensayos,

indican la necesidad de estudiar los sistemas de control de temperatura y de alimentación de

aire .caliente a cada tambor.

• El problema de arrastre de agua desde la .columna de burbujeo para caudales de aire

mayores que 1,48 m3/h, y alturas de agua en la columna mayores que 0,24 m indica la necesidad

de rediseñar la columna con una mayor área transversal para disminuir la velocidad ascendente

del aire y el tamaño de las gotas de agua arrastradas, o estudiar una alternativa diferente para la

humidificación.

• En todos los ensayos de fermentación de pulpa de café, en el equipo de tambores

rotatorios, se observaron incrementos en los porcentajes de proteína cruda y proteína verdadera, y

disminución del contenido de polifenoles. Estos resultados fueron obtenidos sin necesidad de

suplementar la pulpa con una fuente de nitrógeno (Alberto Duarte)

Reyes-Ocampo, M. González-Brambila y F. López-Isunza (2013). Un análisis del

metabolismo de aspergillus niger creciendo sobre un sustrato sólido.

9
 Se analiza el metabolismo de Aspergillus Níger A10 creciendo sobre una placa de agar,

utilizando un modelo estructurado que describe a las rutas de la glicólisis (EMP), pentosa-

fosfatos (PF), el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT), y la producción de biomasa, e incluye

la regulación de diferentes enzimas en EMP y CAT en términos de las concentraciones de ácido

cítrico y ATP en el micelio. Las predicciones del modelo se apoyan en una serie de experimentos

con diferentes concentraciones de glucosa en el medio sólido, así como mezclas binarias de

sustratos como fuentes de carbono. Además de las mediciones de biomasa, el CO 2 producido y el

O2 consumido se miden en una caja Petri modificada. Se utiliza el concepto de disipabilidad de

energía (Atkinson, 1969), para analizar la eficiencia del crecimiento a concentraciones de glucosa

inicial en la placa de agar que van de 25 a 250 gL-1. (Reyes-Ocampo, 2013)

D. P. Bayrock and W Michael Ingledew (2001). Application of multistage continuous

fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology.

A fermentation system to test the merging of very high gravity (VHG) and multistage

continuous culture fermentation (MCCF) technologies was constructed and evaluated for fuel

ethanol production. Simulated mashes ranging from 15% to 32% w/v glucose were fermented by

Saccharomyces cerevisiae and the dilution rates were adjusted for each glucose concentration to

provide an effluent containing less than 0.3% w/v glucose (greater than 99% consumption of

glucose). The MCCF can be operated with glucose concentrations up to 32% w/ v, which

indicates that the system can successfully operate under VHG conditions. With 32% w/v glucose

in the medium reservoir, a maximum of 16.73% v/v ethanol was produced in the MCCF. The

introduction of VHG fermentation into continuous culture technology allows an improvement in

10
ethanol productivity while producing ethanol continuously. In comparing the viability of yeast by

methylene blue and plate count procedures, the results in this work indicate that the methylene

blue procedure may overestimate the proportion of dead cells in the population. Ethanol

productivity (Yps) increased from the first to the last fermentor in the sequence at all glucose

concentrations used. This indicated that ethanol is more effectively produced in later fermentors

in the MCCF, and that the notion of a constant Yps is not a valid assumption for use in

mathematical modeling of MCCFs. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology

(Bayrock, 2001). Mosleh M. Manfe, S. J. Attar, Niraj S. Topare (2011). An overview of

bioreactor design for protein and enzymes enrichement of agricultural residues by solid-state

fermentation.

In this review article we discuses about bioreactor designs and their use for protein

production under solid-state fermentation (SSF) conditions using various agricultural by-

products. The advantages and disadvantages of various bioreactors and their potential for scale-

up are described. SSF is proposed as a suitable low-tech strategy for protein enrichment for

animal feed by converting a previously low value substance into a more nutritionally valuable

one. The use of various substrates and microorganisms for protein enrichment are also listed.

Solid-state fermentation has emerged as a potential technology for the production of microbial

products such as feed, fuel, food, industrial chemicals and pharmaceutical products. Its

application in bioprocesses such as bioleaching, bio-beneficiation, bio-remediation, bio-pulping,

etc. has offered several advantages. Utilization of agro-industrial residues as substrates in SSF

processes provides an alternative avenue and value-addition to these otherwise under- or non-

utilized residues. Today with better understanding of biochemical engineering aspects,

particularly on mathematical modeling and design of bioreactors (fermenters), it is possible to

11
scale up SSF processes and some designs have been developed for commercialization. It is hoped

that with continuity in current trends, SSF technology would be well developed at par with

submerged fermentation technology in times to come (Mosleh, 2011)

María Claridad Julián Ricardo, Luis B. Ramos Sánchez y Kenia Ferrer Sifontes (2007).

Cinética del crecimiento microbiano en residuos de la industria azucarera por fermentación

en estado sólido para la producción de alimento animal.

Se presenta la cinética del crecimiento microbiano en la producción de alimento para

animales por fermentación en estado sólido. Se empleó la levadura Candida utilis para el

enriquecimiento proteico de bagazo de caña de azúcar, además, se utilizaron los residuos de la

industria azucarera cachaza y miel y otro elementos como nutrientes en el medio de cultivo. Se

estudió la respuesta dinámica del sistema en función de la temperatura en un rango de 25 a 45°c,

a través de las variables proteína verdadera y azucares reductores totales. La fermentación duro

30 horas. Se empleó un modelo logístico para presentar los datos experimentales usados en el

simulador Moder Maker. Sus constantes mostraron dependencia con la temperatura, que se ajusta

muy bien a polinomios. La constante específica de crecimiento máxima varía entre 0,0598 y

0,1123. La temperatura óptima para alcanzar máximo enriquecimiento proteico está entre 30 y

33°c. Los parámetros determinados del modelo ajustado se corresponden con los observados en

sistemas similares, según reporta la literatura (María Claridad, 2007)

12
 M. en Ciencias Carolina Campos y Dr. Francisco José Fernández Perrino (2006).

Transformacion en Penicillium Chrysogenum para una sobreproduccion de penicilina G.

En el Oriente, principalmente en Japón (Fukoshima D, 1982), los procesos de fermentación

en medio sólido se usa a escala comercial para la producción de diferentes tipos de metabolitos

fúngicos. Sin embargo, este sistema de cultivo puede ser significativamente ventajoso en relación

a los métodos de fermentación líquida para la manufactura de productos no tradicionales de

interés. Estas ventajas y su versatilidad de tales sistemas de cultivo han provocado la aparición de

un gran número de nuevos campos de aplicación (Pandey, 1992). Algunos ejemplos de nuevas

aplicaciones son: alimentos fermentados, metabolitos secundarios como las micotoxinas y la

producción de alcohol entre otros (Campos, 2006).

Evrim Taskin, Regin Eltem and Esra Soyak (2010). Enchancement of solid state

fermentation for production of penicillin G on sugar beet pulp.

In this study, two local strains of Penicillum Chrysogenum named EGEK458 EGEK 469

were selected for enchancement of Penicillin G (PenG) production under solid state fermentation

(SSF) conditions. These two strains were selected among seven strains according to their

fermentation yields for PenG production during previous test under submerged fermentation

conditions. Sugar beet pulp, and agro-industrial residue of the sugar industrym, was used as inert

support for the first time in PenG production under SSF (Evrim Taskin, 2010).

13
 2.2 MARCO CONCEPTUAL

A.FERMENTACIÓN:

Es un proceso catabólico de oxidación incompleta, totalmente anaeróbico, siendo el producto

final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos

de fermentaciones. En su acepción estricta, se refiere a la obtención de energía en ausencia de

oxígeno y generalmente lleva agregado el nombre del producto final de la reacción.

B. FERMENTACIÓN EN ESTADO SOLIDO

Las fermentaciones sólidas ocurren espontáneamente en la naturaleza. La evidencia más

común es el enmohecimiento del pan, frutas, vegetales y parte del biodeterioro de alimentos

sólidos. La fermentación en estado sólido consiste en el crecimiento de microorganismos sobre

materiales sólidos texturizados y porosos sin la presencia de agua libre. El agua es necesaria, pero

se encuentra en forma absorbida dentro de la matriz sólida.

La mayoría del sustrato está inicialmente inaccesible debido a la heterogeneidad del medio

de cultivo, su disponibilidad puede aumentar, disminuir o permanecer constante durante la

fermentación

La fermentación en sustrato sólido con hongos ha sido empleada desde hace mucho tiempo

en la preparación de alimentos orientales. Sin embargo, a pesar de su uso tan extendido, el

conocimiento de la fisiología y microbiología de estos procesos fermentativos no habían sido

estudiados y aún se desconocen muchos aspectos). El proceso de fermentación en estado sólido

es usado en escala comercial para la producción de diferentes alimentos fermentados, obtención

de enzimas, metabolitos secundarios y para la bioconversión de desperdicios orgánicos en

productos útiles.
14
 C. TIPO DE BIORREACTORES DE FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO

i. Biorreactor en Columna

Fue desarrollado y patentado por el grupo del Instituto para la Investigación y Desarrollo

(IRD) en Francia, entre 1975 y 1980, compuesto por pequeñas columnas de cuatro centímetros de

diámetro y veinte centímetros de altura, el cual es llenado con un medio previamente inoculado y

puesto en un termorregulador de agua. El equipo está conectado a una columna de cromatografía

de gases para monitorear la producción de CO2, resultado de la respiración del microorganismo y

de sus reacciones metabólicas. La demanda de oxigeno se cubre por medio de aeración forzada

utilizando compresores con sistemas de regulación de presión para evitar la compactación

excesiva del lecho. La geometría y diseño de las columnas permite que sea un equipo barato,

debido a que son elaboradas a base de vidrio, por lo que la remoción del calor exotérmico de la

fermentación se lleva a cabo de manera eficiente. Requiere de poca cantidad de medio de cultivo

y la fácil adaptación del equipo a sistemas más rudimentarios en cuanto a equipamiento y

cuantificación de productos, le confiere practicidad de uso. Este equipo es conveniente en las

primeras etapas del desarrollo de un bioproceso ya que es adecuado para estudios de

caracterización y optimización de la composición del medio de cultivo, y para cuantificar los

datos necesarios para llevar a cabo el cálculo de parámetros cinéticos.

Fig. 1. Fuente: Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007.

15
 ii. Biorreactor de Columna Estéril

Diseñado en Francia, tomando como base de diseño al biorreactor en columna. Este

biorreactor trabaja con un volumen de 1 litro, cuenta con un muestreador de humedad relativa y

un sistema de calefacción en la cabeza de la columna, mientras que en el circuito de operación se

encuentra un sistema de enfriamiento, utilizando agua fría, el cual rodea una resistencia de

calentamiento.

Fig. 2. Biorreactor estéril: (1) tapa para calefacción, (2) termómetro, (3) tamiz de acero, (4)

medidor de temperatura del aire en la entrada, (5) medidor de humedad relativa, (6) resistencia,

(7) medidor de temperatura del agua, (8) medidor de flujo másico, (9) medidor de nivel, (10)

chaqueta aislantes. Fuente: Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007.

iii. Tambor horizontal

Uno de los biorreactores en estado sólido más utilizado son los llamados tambor horizontal,

el cual se ha diseñado de varias formas: como un contenedor rotatorio, perforado o con paletas,

con el fin de obtener una agitación continua del sustrato sólido para incrementar el contacto entre

las paredes del biorreactor y el sustrato, así como, proveer mayor oxígeno al microorganismo.

16
Los equipos rotatorios, desarrollados por el grupo Several, consisten de un cilindro, con o sin

chaqueta con agua para el control de temperatura, el cual gira lentamente volteando al medio de

cultivo ayudado de pestañas que se encuentran adheridas a la pared (Fig. 3a). Este tipo de

biorreactor presenta dificultades en el control de temperatura y humedad debido a problemas de

aglomeramientos de células por ruptura micelial. En cambio los biorreactores de tipo tambor con

paletas, vuelve más eficiente la trasferencia de oxígeno y disminuye la aglomeración de

partículas de sustrato durante el crecimiento microbiano (Fig. 3b). Sin embargo, generalmente, un

biorreactor de fermentación sólida con agitación permanente, aunque sea suave, puede modificar

la estructura del medio sólido. Además, dependiendo de la naturaleza de la partícula del soporte

sólido, esta agitación puede llegar a ser abrasiva causando daños al micelio.

Fig. 3. Biorreactor tambor horizontal: (a) rotatorio. (1) entrada de aire, (2) embalaje

rotatorio, (3) conector, (4) boquillas de entrada de aire, (5) línea de aire, (6) rodillos, (7) tambor

rotatorio, (8) medio sólido, (9) aro. (b) con paletas. (1) entrada de aire, (2) medidor de

temperatura,(3) chaqueta de agua, (4) paletas, (5) salida de aire, (6) motor de agitación, (7)

reactor, (8) medio sólido, (9) árbol de agitación. Fuente: Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007.

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 iv.Biorreactor Zymotis

Diseñado y desarrollado por el grupo ORSTOM, el cual consiste de platos verticales por

donde internamente hay transferencia de calor debido a la circulación de agua fría, mientras, que

el aire previamente temporizado es introducido por el fondo del sistema. Entre cada plato se

carga el medio sólido previamente inoculado, dicha cama se mantiene estática durante la

fermentación. Este sistema es parecido a los biorreactores de columna, con la diferencia de que

las capas de sustrato están verticalmente fijas, por lo tanto es difícil trabajar en condiciones

asépticas (Fig. 4). Además, existe mayor posibilidad de que la cama de sustrato presente un

encogimiento del volumen durante el crecimiento del micelio, provocando que el contacto con

los platos verticales disminuya a medida que la fermentación progrese, lo cual llevaría la

formación de canales pobres en transferencia de calor y oxígeno.

Fig. 4. Biorreactor Zymotis. (1) Platos verticales intercambiadores de calor, (2) cama de

sustrato, (3) entrada de agua, (4) salida de agua, (5) termostato. Fuente: Ruiz. R.M. Rodríguez-

Jasso, 2007.

18
 v. Biorreactor Growtek.

Diseñado por el Departamento de Biotecnología, Agricultura e Ingeniería en Alimentos del

Instituto Tecnológico de la India, llamado Growtek (Fig. 5). Consiste de un envase de 16 cm de

altura y 11.3 cm de diámetro, que tiene un tubo, de 2.6 cm de diámetro y 8.5 cm de altura, pegado

a la base con una inclinación de 15° con respecto a la vertical. El cuerpo del recipiente y del tubo

externo está hechos de policarbonato, y las tapas de ambos son de polipropileno. Este biorreactor

tiene dentro del envase un depósito de polipropileno que contiene una tela de fibra de vidrio en el

fondo, donde se sostiene el sustrato. La fermentación ocurre en la vasija cilíndrica y el medio es

introducido por el tubo inclinado. Dicho dispositivo también permite la dosificando de agua para

mantener la humedad adecuada para el crecimiento microbiano. Sin embargo, no cuenta con un

sistema de medición de la variación de temperatura y no es posible la toma de muestra sin

descartar toda la cama del sustrato.

Fig. 5. Biorreactor Growtek (1) cuerpo del biorreactor de policarbonato transparente, (2a)

depósito, (2b) base del depósito perforada donde se deposita el sustrato sólido y el inoculo, (3)

tubo lateral que facilita la entrada del medio, (4) tapa enroscada de aireación estéril, (5) tapa

enroscada del tubo exterior, (6) mangos del depósito. Fuente: Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007.

19
 vi.Biorreactor para proceso continúo

Van de Lagemaat y Pyle (2001) propusieron un proceso de fermentación en medio sólido

basado en la producción continua de la enzima tanasa. Este trabajo es uno de los reportes que han

explorado el diseño de biorreactores de régimen continuo a escala laboratorio y cuyo principio es

el empleo de un tornillo sin fin que sirve para alimentar y agitar los sustratos los cuales pueden o

no ser inoculados en el proceso. Los estudios correspondientes de mezclado, crecimiento fúngico

y niveles de esporulación han sido llevados a cabo en condiciones exitosas de operación continua,

debido a que el tiempo de residencia del complejo sustrato-microorganismo enzima es menor que

en los biorreactores convencionales y al estar en condiciones cerradas la asepsia es mayor. En

cambio, existe la formación de gradientes de temperatura que no permiten un sistema homogéneo

de transferencia de calor.

vii. Biorreactor Columna-Charola

Investigación en Alimentos de la Universidad Autónoma de Coahuila. El cual consiste de

una columna de 13 pulgadas de altura y un diámetro de 10 pulgadas (Fig. 6). En su interior se

encuentran ocho charolas perforadas, las cuales tiene una capacidad de 140 mL cada una. La

transferencia del oxígeno es por burbujeo a través de un distribuidor de aire, permitiendo la

transferencia a un flujo de 194 mL/min. La temperatura es regulada por una chaqueta de

enfriamiento y/o calentamiento, por lo que es posible controlar y medir los cambios de

temperatura. Bajo este sistema se permite una mejor distribución de oxigeno por aireación hacia

las charolas.

20
 Fig. 6. Biorreactor Columna Charola. (1) Entrada de aire estéril, (2) entrada de agua estéril,

(3) distribuidor de aire, (4) entrada para el termómetro, (5) charola, (6) chaqueta para el control

de temperatura, (7) columna de acrílico, (8) entrada de agua, (9) salida de agua. Fuente: Ruiz.

R.M. Rodríguez-Jasso, 2007.

D.PRINCIPIOS DE DISEÑO DE UN BIORREACTOR

Los Biorreactores son los equipos donde se realiza el proceso de cultivo, sea en estado sólido

o líquido. Su diseño debe ser tal que asegure homogeneidad entre los componentes del sistema y

condiciones óptimas para el crecimiento microbiano y la obtención del producto deseado. Es

importante tomar en cuenta los problemas de transferencia de calor y oxígeno sobre la cama de

sustrato, los cuales dependen de las características de la matriz que se esté utilizando para la

fermentación, siendo éste, uno los principales factores que afectan el diseño y las estrategias de

control.

Los criterios más importantes para el diseño de un biorreactor pueden resumirse del

siguiente modo dependiendo del tipo de biorreactor y la fermentación a utilizar:

1. El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, para

evitar la aparición de contaminantes en las operaciones de bioprocesos de larga duración.

21
 2. Debe permitir una mayor área de contacto entre las fases biótica y abiótica del sistema, es

decir, se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las

necesidades metabólicas de los microorganismos

3. El consumo de energía debe de ser el mínimo posible.

4. Entradas para la adición de nutrientes y el control de pH.

5. El crecimiento microbiano es generalmente exotérmico, por lo que, el biorreactor debe

facilitar la transferencia de calor, del medio hacia las células y viceversa, a medida que se

produce el crecimiento celular, además de mantener estable la temperatura deseada.

6. Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo.

7. Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo.

8. El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema

ha sido esterilizado y posteriormente inoculado con el microorganismo deseado.

Los biorreactores más utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de

agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, pH. Los

biorreactores deben ser optimizados para obtener la máxima concentración de productos de la

fermentación, como lo son la biomasa microbiana y/o metabolitos en un tiempo mínimo y a

menor costo de producción (Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, 2007).

E. HONGO ASPERGILLIUS NIGER

El hongo Aspergillus Níger (A. Níger) produce diversos compuestos de gran interés para las

industrias farmacéutica y de alimentos (enzimas, ácidos orgánicos), y es el principal productor de

ácido cítrico a nivel industrial por cultivo lıquido. Se ha observado que se obtiene un alto

rendimiento de ácido cítrico cuando existe una alta acumulación de este en el micelio, que puede

estar asociada con una alta concentración de glucosa y de oxıgeno disuelto el medio lıquido. Sin
22
embargo, no es posible conocer aún todos los factores ambientales y fisiologicos que originan

esta acumulación, ni saber cómo estos determinan la morfología del micelio, la cual podría, en

principio, usarse como un indicador del nivel de producción del ácido, al realizar mediciones del

diámetro promedio de las madejas formadas por las hifas en el medio lıquido, que se cree

corresponden a un medio con altas concentraciones de glucosa, O 2 y ácido cítrico, antes de que la

difusión de sustrato y O2 sea deficiente cuando la madeja alcance un tamaño crıtico, de acuerdo

con el criterio de Thiele.

En el crecimiento en estado sólido, normalmente sobre una placa de agar en una caja Petri,

es fácil medir la cantidad de biomasa producida para diversas concentraciones iniciales de

glucosa, pero no es fácil la determinación de los productos excretados, como en un medio

lıquido, por lo que solo se obtiene un conocimiento limitado acerca del metabolismo de A. Níger.

A la fecha, los estudios realizados en sustrato solidos no han incorporado ninguna información

basada, por ejemplo, en el conocimiento de las rutas metabólicas de este microorganismo, lo que

nos permitiría describir el crecimiento de A. Níger de una forma menos empírica, y tal vez

facilitaría el análisis de los diversos procesos bioquímicos y ambientales que determinan el

metabolismo de A. Níger, así como la producción de ácido cítrico y otros metabolitos.

F. CEPAS, MEDIOS DE MANTENIMIENTO E INÓCULOS

Normalmente la cepa de producción es mantenida como esporos, liofilizados o en nitrógeno

líquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo en N2 líquido o congelado a -70 °C.

Antes de comenzar un proceso a partir de un cultivo, el operador debe realizar una

exhaustiva evaluación que asegure el mantenimiento de las características de la cepa, lo cual

implica determinar el grado de esporulación, la productividad y características morfológicas, lo

que incluye ensayos en agitadores y en fermentadores de laboratorio.

23
 Muchos son los factores que se asocian en la síntesis de antibióticos, tales como

esporulación, velocidad de crecimiento y niveles de intermediarios, todos los el motivo por el

cual las mutaciones con agentes físicos (luz UV, rayos X) y químicos, han tenido un gran éxito en

el mejoramiento de cepas. Este mejoramiento fue posible no solamente por modificaciones en la

cepa, sino también por la tecnología del proceso, como la ingeniería de aireación y sistema de

mezclado en fermentadores, alimentación continua de glucosa, empleo de electrodos de pH para

el control del mismo, y utilización del sistema continuo.

Las técnicas genéticas se han utilizado de dos formas para el mejoramiento del proceso. En

primer lugar el empleo de mutantes bloqueado ha permitido el conocimiento de las rutas

biosintéticas y de apropiadas técnicas de selección. En segundo lugar, las técnicas de fusión de

protoplastos y procesos parasexuales facilitaron la obtención de recombinantes con rendimientos

superiores a los de las cepas originales y con expresiones estables. Además esto permitió la

obtención de organismos productores de nuevos antibióticos.

G. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y ESPECÍFICOS

Además de glucosa y lactosa, Peiticillittm chrysogenum puede utilizar una gran variedad de

fuentes de carbono y energía. Alternativamente se han usado sacarosa, almidón, dextrinas,

melaza, aceites vegetales y animales, etanol y glicerol. Un medio de cultivo en sistema batch

puede contener entre 30 y 40 g/l de lactosa, en tanto que si se emplea un cultivo con alimentación

de fuente de carbono, se puede utilizar glucosa o melaza a una concentración final de 100 g/1.

La principal fuente nitrogenada empleada hasta la década del 70 fue "corn-steep liquor"

debido a que aumentaba los rendimientos del antibiótico probablemente al suministrar

compuestos como aminoácidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, además

24
de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los

problemas de suministro, y también debido a la introducción de precursores específicos de la

cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de

semilla de algodón, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos

productos son igualmente variables y tanto o más caros. Trabajando en cultivos alimentados y

modificando la relación nitrógeno/carbono en la alimentación, se comprobó que cuando el cultivo

estaba limitado en nitrógeno cesaba la producción de biomasa, la cual se restablecía al ser la

fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH 4+ podría reflejar su

necesidad para la síntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cisteína.

H. CRECIMIENTO MICROBIANO

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos

comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo

para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del

medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede

detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los

mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera

alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al

crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de

microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y

el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.

25
 I. ESTEQUIOMETRÍA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La aplicación de la estequiometria requiere conocer los rendimientos. Estos se definen como

la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y

energía). Por ejemplo el rendimiento celular se define como:

−dX
Y x/ s= ⋯ (1)
dS

X y S representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente.

En la práctica, para el cálculo del Y x/ s se emplea la expresión:

−∆ X
Y x/ s= ⋯ (2)
∆S

Por ejemplo para obtener 30 g/l de levadura para panificación se consumen 60 g/l de fuente

carbonada, luego el rendimiento será:

g
−30 de levadura
l
Y x/ s= =0.50
g
60 de fuente carbonada
l

Se ha encontrado que la composición elemental de un microorganismo dado durante un

cultivo no se modifica mayormente y, lo que es más, las composiciones elementales de distintos

tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. De este modo se puede definir un

"microorganismo promedio" como aquél cuya composición es (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 =

31.0; N = 10.85, siendo el contenido de sales aproximadamente 5%. Es importante recalcar que si

bien la composición elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, no ocurre

lo mismo con la composición macromolecular, esto es: proteínas, ácidos nucleicos, cte., la cual

puede variar sensiblemente.

26
 Conviene hacer algunas consideraciones sobre la composición elemental de los

microorganismos con respecto a los elementos mayoritarios (C, N, H, O) ya que la misma será el

punto de partida para realizar los cálculos estequiométricos. Además, y antes de aplicar los

balances estequiométricos deberemos responder a esta pregunta: ¿qué peso de células (o

biomasa) corresponde a "un mol"?.

Teniendo en cuenta la composición media anterior, es posible escribir la "fórmula mínima"

de un microorganismo promedio como: CH 1.79O0.5N0.2 (en la que está representado el 95% p/p de

la biomasa) y con fines netamente prácticos definir "un C-mol de biomasa" como la cantidad de

biomasa que contiene un átomo gramo de Carbono. Luego:

12+1.79+15 ( 0 , 5 ) +14 ( 0 , 2 )
1 C−mol de biomasa= =25.8 g
0.95

Por tanto una concentración de X en g.l-1 de biomasa es equivalente a X/25.8 C-mol de

biomasa l-1, o bien Xox/12 C-mol de biomasa l-1. Donde ox es la fracción de Carbono de la

biomasa (0.465 para el "microorganismo promedio"). Esta última forma de calcular los C-moles

de biomasa es ventajosa ya que sólo requiere conocer ox; un dato que se puede obtener

fácilmente de la bibliografía. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer ox =

0.465 sin temor a cometer errores groseros. De forma análoga a la anterior se definen 1 C-mol de

fuente de Carbono y energía, y también 1 C-mol de producto. Por ejemplo para la glucosa

(C6H12O6) 1 C-mol de glucosa estará representado por CH 2O y pesará 30 g, mientras que 1 C-mol

de etanol (C2H60) estará representado por CH3O0.5 y pesará 23 g. En general para un compuesto de

la forma Cn H1 Oq Nm, 1 C-mol estará representado por CH1/n Oq/n Nm/n. En base a lo anterior, el

27
crecimiento puede representarse mediante la siguiente "reacción química", en la que

supondremos que el NH3 (o alguna sal de amonio) es la fuente de nitrógeno:

CH s 1 O s 2+QNH 3+ b O2 → y x / s CH b 1 Ob 2 N b 3 + y p /s +CH p 1 O p2 N p 3 + y CO / s CO 2 +W H 2 O+ q( calor) ⋯ (3)

2

Debe notarse que en esta ecuación todos los coeficientes estequiométricos están referidos a 1

C-mol de fuente de Carbono y energía.

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf

J. VELOCIDAD DE REACCIÓN BIOLÓGICA-MODELO DE MONOD

En una reacción biológica son varios los sustratos que participan en ella, las bacterias crecen

y utilizan muchísimas enzimas para llevar a cabo la reacción biológica deseada. Si se quisiera

describir detalladamente las reacción deberíamos usar un modelo segregado y estructurado, lo

cual es muy complejo y escapa a este capítulo que debe considerarse como introductorio a la

temática de bioreactores.

Monod en 1942 desarrolló una ecuación muy simple para representar los procesos biológicos

que funciona en general muy bien. Para ello asumió que si bien pueden existir muchos sustratos,

uno de ellos será el limitante. En este modelo se asume que la producción de biomasa depende

exclusivamente de la concentración de este sustrato limitante. Para una reacción biológica del

tipo:

αS → γX ⋯ (4 )

La velocidad de crecimiento de biomasa puede representarse como sigue:

s
μ=μ max ⋯ (5)
s+ k s

28
 Donde

 µmax=velocidad específica de crecimiento máxima, h-1

 Ks=constante de saturación, g/l

 S=concentración de sustrato limitante, g/l

La dependencia del substrato de la velocidad de crecimiento específica (μ) es de forma que

si la cantidad de substrato es muy grande la tasa específica se aproxima al valor máximo y si la

concentración del sustrato tiende a cero, se aproxima a cero (Figura 1).

Fig. 7. Ilustración de la cinética de crecimiento de Monod. Fuente:

http://web.udl.es/usuaris/r5213847/Cin%C3%A9tica.pdf

K. CINÉTICA Y ACTIVIDAD METABÓLICA DEL CULTIVO BATCH.

La cinética de un proceso; representa la variación de una o más variables de dicho proceso

en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de mayor importancia y que más se han

estudiado son: contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del sustrato, la síntesis de uno o

varios metabolitos, el consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono.

Los estudios cinéticos permiten determinar aspectos tan importantes como:

 La velocidad específica de crecimiento (m).

29
  El rendimiento del proceso.

 La productividad del sistema.

 El calor generado en el sistema.

 La estrategia a seguir en cuanto a la producción de un metabolito específico.

Una de las principales dificultades encontradas en el estudio y desarrollo de los procesos de

fermentación en estado sólido viene dada por las características intrínsecas de estos sistemas

heterogéneos, la imposibilidad del muestreo durante la fermentación para determinar las

concentraciones correspondientes de biomasa, sustrato y productos. Este hecho se refleja de

manera particularmente aguda cuando se tiene la necesidad de realizar estudios cinéticos del

proceso. No obstante, existen diferentes alternativas que permiten desarrollar estos estudios de

manera objetiva y satisfactoria.

2.3 FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS

En el diseño de un biorreactor de fermentación en estado sólido de tambores rotatorios un

aumento del tiempo y la cantidad de sustrato permitirán un incremento de la velocidad de

producción de biomasa rica en proteínas.

3. METODOLOGÍA

3.1 DISEÑO METODOLÓGICO

CAUSA EFECTO
30
 Variable independiente Variable dependiente

 Temperatura  % de biomasa rica en proteínas

 Cantidad de sustrato

 Tiempo de fermentación

 Tipo de diseño: Experimental factorial simple 23

 Niveles:

 Temperatura: (-)32°C (+)50°C

 Cantidad de sustrato. (-) 20 g/l (+) 45 g/l

 Tiempo de fermentación: (-) 40 horas (+) 60 horas

 N° de experimentos: 8

 N° de repeticiones: 2

 Total de corridas: 16

 Matriz de experimentos:

VARIABLE
VARIABLES INDEPENDIENTES
DEPENDIENTE
N°Exp
Concentració temperatur % de biomasa obtenida
tiempo
n a I II
1 - - -

31
 2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA

Población:

Masa de maíz del distrito de San Agustín de cajas Anexo Coyllor en la época de la

rebusca.

Muestra:

Masa de maíz del distrito de San Agustín de cajas Anexo Coyllor en la época de la

rebusca en 4 hectáreas de terreno.

(Z ¿¿ ∀¿¿ 2)( p)(q)( N )

n= ¿¿
( e ) ( N−1 )+( Z¿ ¿ ∀¿ ¿ 2)( p)(q) ⋯ (6)¿¿
2

Donde:

Z ∀ : puntuacion correspondiente al riesgo ∀ que se haya elegido .(Z ∀=2)

p : probabilidad estimada en porcentaje=95.5 %

q=100−p=4.5 %

N :tamaño de poblacion=4 hectareas(15 kg de maíz /hectarea )

e : error permitido en porcentaje=5

(2¿¿ 2)( 95.5)(4.5)(60)

n= ¿
( 5 ) ( 60−1 ) +(2¿¿ 2)( 95.5)(4.5)¿
2

n=32.29 ≅ 32 kg de maíz

Muestreo probabilística estratificado

32
Fracción de estrato ( fh):

n 32
fh= = =0.5333
N 60

Estratos Peso disponible en Factor de Muestra estratificada

cada lugar (Kg) estratificación (fh) (nh)
Hectárea 1 16.3 0.53 8.64
Hectárea 2 13 0.53 6.89
Hectárea 3 16 0.53 8.48
Hectárea 4 15 0.53 7.95

Total de población N=50 Total muestra n=32

3.3 CARACTERIZACION DEL SUSTRATO:

A. DETERMINACION DE CENIZAS

Equipos y materiales empleados

 Mufla.

 crisoles de porcelana.

 Balanza analítica.

 Disgregador y pinzas.

Detalles experimentales

 Pese 2 gr de muestra en un crisol previamente tarado y deshumedecido.

 El crisol y su contenido se calcinan, primero sobre una llama baja, evitando en lo

posible la formación excesiva de hollín, hasta que se carbonice y luego en un horno de

mufla a 650° C. Trabaje con el extractor en funcionamiento.

33
  Calcine en la mufla durante 3-4 horas. El método más seguro es calcinar hasta peso

constante, asegurándose que la ceniza sea blanca o parda. Previamente, al cumplirse

los primeros 30 minutos de calcinación, sacar el crisol y dejar enfriar, con el

disgregador romper las partículas incineradas en forma uniforme y cuidadosamente,

introducir nuevamente el crisol en la mufla y completar la calcinación durante el

tiempo antes mencionado.

 Transcurrido el tiempo requerido, sacar el crisol y dejar enfriar a temperatura

ambiente, colocar en un desecador y luego pesar.

Cálculos

% Cenizas= ( peso del crisol mas ceniza− peso del crisol vacio
peso de la muestra ) .100

B. DETERMINACION DE LA DENSIDADES

Materiales y equipo

 Balanza

 Probeta

 Regla graduada

Procedimiento

 Se toma 40 gramos del sustrato de maíz y se lleva a la balanza analítica para

conocer su peso (m).

34
  Luego el sustrato se sumerge con cuidado y completamente en una probeta que

contiene un volumen exacto de agua (V 0). Luego se lee cuidadosamente el

volumen final (V f ). El volumen del sustrato corresponde a la diferencia:

V =V f −V o

 Con los datos obtenidos se puede determinar la densidad mediante la siguiente

formula:

m
ρ=
V

C. DETERMINACION DE PROTEINAS:

Materiales:

 Balón de kjeldahl de 100ml (digestión).

 Balón kjeldahl de 250ml (destilación).

 Frascos Erlenmeyer de 250ml (150).

 Pipeta cilíndrica.

 Probeta graduada de 25, 50,100ml.

 Piceta de agua destilada.

 Papel filtro.

Reactivos:

 Ácido sulfúrico concentrado.

 Selenio de sodio (selenio en polvo).

 Catalizador (sulfato de potasio y sulfato de cobre).

 Ácido bórico al 4%.

35
  Indicador de Ph (rojo azul de metilo).

 Ácido clorhídrico en solución de 0.05N.

 Solución de hidróxido de sodio al 40%.

Procedimiento: Se realiza en tres fases:

a. Digestión o ataque a la materia orgánica.

 Pesar 0.2gr. de muestra seca en estudio en la balanza analítica.

 Envolver en un papel filtro de análisis previamente tarado, asegurando del exterior

con hilo.

 Introducir en forma de un paquete dentro de un balón de digestión kejldahl de

100ml

 Agregar 01gr. De mezcla catalizadora (0.05gr. de sulfato de cobre y 0.95gr. de

sulfato de potasio).

 Se añade una pizquita de selenio en polvo (0.3 a 1gr.aprox.).

 Adicionar por las paredes del valón 2.5ml de ácido sulfúrico concentrado.

 Mezclar con cuidado, imprimiendo el balón un moviendo rotatorio

 Colocar el valón en posición inclinada sobre una de las hornillas de la cámara

digestor multi-kjeldahl, de manera que la boca del balón quede dentro de la

correspondiente abertura del tubo de plomo, por donde serán removidos los gases

producidos durante la ebullición.

 Dar paso a la corriente eléctrica y regular a la temperatura de forma que la

ebullición sea moderada. Esta ebullición se mantendrá durante 30 minutos o más

si fuera necesario. Generalmente hasta media hora después de que el líquido tome

un color verde claro o azul verdoso

36
  Luego se deja enfriar hasta que empiece a formar cristales.

 En las mismas condiciones se realiza una digestión “en blanco”, o digiera a parte

el papel filtro, pero sin muestra; esta representa también una muestra en blanco.

b. Destilación del amoniaco.

 Termina la digestión y enfriarla el balón, añadir con cuidado 25ml. De agua

destilada y enfriar nuevamente.

 Adicionar en un matraz de Erlenmeyer de 250ml de capacidad, 5ml de ácido

bórico al 4% y cuatro gotas de indicador y colocarlo en la parte inferior del

tubo condensador de tal manera que el extremo del tubo de unión quede

sumergido en ácido bórico.

 Mezclar continuamente, haciendo un lavado de todos los residuos de la

muestra contenida en el balón.

 Agregar lentamente por las paredes del balón 25ml. De agua destilada.

 Transferir la muestra a otro balón de destilación de 250ml.

 Colocar el balón en el aparato de tecator y conectarlo al tubo condensador,

donde se añade 25ml. De solución de hidróxido de sodio al 40% con la

manivela del álcali del aparato en posición correcta.

 Se alimenta vapor con la manivela presionando hacia abajo

 A los pocos minutos comenzara la ebullición y destilación.

 Destilar por tres minutos desde el cambio de color rojo a verde

 Después de tres minutos subir la manivela hacia arriba para cortar el vapor

 Retirar el balón con cuidado a un lugar seguro.

37
  Retirar el Erlenmeyer con cuidado lavando el extremo del tubo con un poco de

agua destilada.

 Destilar también el balón que contiene la digestión (en blanco).

c. Titulación del borato de amonio.

 Enjuagar la bureta con la solución a utilizar para titular (HCL), antes de ser

aforada a cero, para evitar la contaminación.

 Cargar la bureta milimetrada con ácido clorhídrico al 0.05N valorado.

 Titular el contenido del matraz de Erlenmeyer con la solución de HCL 0.05N,

agitando suavemente hasta que el color vire aun color violeta (cada ml. De

hasta solución que se gasta en la titulación, equivale a 1.4mg. de nitrógeno).

 Una vez cambiada el color de la muestra contenida en el erlenmeyer, se hace la

lectura correspondiente en al bureta, cuyo dato se considera como gasto

38
 3.4 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

Tipo de variable Nombre de Definición conceptual Unidad de medida

variable /indicador
Magnitud con la que se
Grados centígrados (°C) /
Temperatura mide el aumento o
termómetro.
disminución de calor.
Tiempo Magnitud con la que se días/ cronómetro
Variable mide la duración de un
Independiente determinado fenómeno
o suceso
Cantidad de Gramos de sustrato que g/l /balanza analítica
sustrato ingresan al reactor de
fermentacion
Variable Velocidad de Cantidad de biomasa Gramos de biomasa
Dependiente producción de rica en proteínas /unidad de tiempo.
biomasa rica en obtenida sobre unidad Método adecuado de
proteinas de tiempo por peso de análisis.
sustrato

3.5 PLAN DE TRABAJO

Periodo de tiempo
Acciones Año 2014
Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov Dic
Elaboración del
proyecto
Recopilación de
bibliografía
Preparación de
materiales y equipos
Recopilación de
datos
Tratamiento de datos
Resultados y
discusión
Redacción del
borrador del informe
final
Presentación y

39
 defensa de la tesis
3.6 FINANCIAMIENTO

Los recursos económicos serán asumidos por los ejecutores de esta investigación, las

instalaciones en las que se llevarán a cabo la investigación será en la facultad de Ingeniería

Química de la UNCP.

A. PRESUPUESTO

1. SERVICIOS DE MATERIALES DE ESCRITORIO

Papel S/ 14.00

Lapiceros S/ 5.00

Resaltadores S/ 12.00

USB S/ 60.00

CD S/ 20.00

Folders S/ 25.00

SUBTOTAL S/ 136.00

2. SERVICOS DE TICS

Copias S/ 40.00

Impresión S/ 80.00

Alquiler de internet S/ 60.00

SUBTOTAL S/ 180.00

3. SERVICOS DE ADQUISICIONES

Papers S/ 50.00

40
 Libros S/ 100.00

Material de construcción del S/ 1000.00

reactor

SUBTOTAL S/ 1150.00

4. SERVICOS DE ANALISIS

Análisis proteico S/ 300.00

Alquiler de materiales y equipos S/ 50.00

SUBTOTAL S/ 350.00

5. SERVICOS GENERALES

Viáticos y pasajes S/ 150.00

Tramites de titulación S/ 250.00

SUBTOTAL S/ 400.00

TOTAL S/ 2080.00

41
 3.7 MATRIZ DE CONSISTENCIA

VARIABLES Y
PROBLEMA OBJETIVOS HIPOTESIS METODOLOGÍA
DIMENSIONES
PROBLEMA OBJETIVO HIPÓTESIS VARIABLE Tipo de
GENERAL GENERAL GENERAL INDEPENDIENTE investigación
-Temperatura Aplicada
¿Qué factores Determinar los En el diseño de -Tiempo
influyen en la factores influyen en un biorreactor de -Cantidad de sustrato Diseño de
velocidad de la velocidad de fermentación en investigación
fermentación en un fermentación en un estado sólido de Indicadores de la V.I -Experimental 23 de
reactor de reactor de tambores -termómetro 16 corridas totales
fermentación en fermentación en rotatorios un -Cronometro. -Muestreo
estado sólido? estado sólido aumento del -balanza analítica probabilística
PROBLEMAS PROBLEMAS tiempo y la estratificado
ESPECIFICOS ESPECIFICOS cantidad de VARIABLE
-¿Cuál es el tiempo -Determinar el sustrato DEPENDIENTE Fracción de estrato (
óptimo de tiempo óptimo de permitirán un fh):
fermentación del fermentación del incremento de la -Rendimiento en la n 32
sustrato? sustrato velocidad de obtención de
fh= = =0.5333
N 60
-¿Cuál es la -Caracterizar el producción de biomasa rica en
caracterización sustrato a fermentar biomasa rica en proteínas Población:
biológica – química -Diseñar un proteínas. Indicadores V. D. N=50
del sustrato a utilizar? biorreactor de Muestra:
-¿Cómo diseñar un fermentación en tipo de análisis n=32
biorreactor de estado sólido escala especificado
fermentación en laboratorio.
estado sólido a escala
laboratorio?

42
 4. RESULTADOS

4.1 PROGRAMA DE SIMULACION EN MATLAB:

PASOS.

 Abrimos el programa Matlab:

 Hacemos click en el icono Librería Simulink, se abrirá dos ventanas uno donde se

encuentran los bloques principales y otra ventana donde podemos insertar los

comandos a usar.

 Los comandos a usar son: bloque step, bloque S-Function, bloque Scope, bloque

Mux, bloque y Demux.

43
 Insertamos los bloques:

 Hacemos click en el bloque S_Function y programamos según el Modelo Monod de

cinética de fermentación.

44
 4.2 RESULTADOS DE LA SIMULACION:

Grafica de resultados de tiempo vs concentración de biomasa y los cambios de entrada del

sustrato s (g/l):

Fuente: Nelson Aros, Marcelo Cifuentes, Javier Mardones (2011).Modelación, simulación y

control de procesos de fermentación

Predicción del crecimiento de Aspergillus niger correspondiente a los datos de la Fig. 9

donde se usa biomasa.

Fuente: Reyes Ocampo, M. González Brambila y F. López (2013). Un análisis del metabolismo
de Aspergillus Níger creciendo sobre un sustrato sólido

45
 5. REFERENCIAS

1 PEREZ QUILANTAN, L.M. (1996) Fermentación en estado sólido del mijo perla

(pennisetum americanum leeke) por rhizopus oligosporus para la obtención de un

producto rico en proteína.

2 T. Robinson, D Singh y P Nigam (2001). Fermentación en estado sólido: una tecnología

microbiana promisoria para la producción de metabolitos secundarios.

3 H.A. Ruiz. R.M. Rodríguez-Jasso, R. Rodríguez-Herrera. J.C. Contreras-Esquivel y C.N.

Aguilar (2007). Diseño de biorreactores para fermentación en medio sólido.

4 H. Kh. Q. Ali and M. M. D. Zulkali (2011) Design aspects of bioreactors for solid-state

fermentation: a review.

5 Hajar Kiai, Abdellatif Hafidi (2013) Chemical composition changes in four Green olive

cultivars during spontaneous fermentation.

6 Manuel Fernando Rubio-Arroyo, Pilar Vivanco-Loyo, Moisés Juárez, Martha Poisot,

and Guillermo Ramírez-Galicia (2011) Bio-ethanol obtained by fermentation process

with continuous feeding of yeast.

46
7 María Caridad Julián Ricardo, Luis B. Ramos Sánchez. Fermentación en estado sólido (I).

Producción de alimento animal.

8 J.C. Dustet, J.J. Peña, Wuilmaris Perez y Milene Díaz (2002). Evaluación de un nuevo

prototipo de bioreactor para fermentaciones en estado sólido de residuos fibrosos.

9 L.O. Miranda, A. Tomasini, A. Mejía y J. Barrios-González (1988). Efecto del mezclado y la

adición de agua y lactosa sobre la producción de penicilina por Penicillium chrysogenum

por fermentación en estado sólido.

10 María Caridad, Julian Ricardo, Luis B. Ramos Sanchez (2007). Fermentación en estado

sólido (I). Producción de alimento animal.

11 Alberto Duarte T. y Gustavo Buitrago H. Desarrollo de un equipo de tambores rotatorios

para la fermentación de subproductos agroindustriales en medio sólido.

12 Reyes-Ocampo, M. González-Brambila y F. López-Isunza (2013). Un análisis del

metabolismo de aspergillus niger creciendo sobre un sustrato sólido.

13 D. P. Bayrock and W Michael Ingledew (2001). Application of multistage continuous

fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology.

47
14 Mosleh M. Manfe, S. J. Attar, Niraj S. Topare (2011). An overview of bioreactor design for

protein and enzymes enrichement of agricultural residues by solid state fermentation.

15 María Claridad Julián Ricardo, Luis B. Ramos Sánchez y Kenia Ferrer Sifontes (2007).

Cinética del crecimiento microbiano en residuos de la industria azucarera por

fermentación en estado sólido para la producción de alimento animal.

16 http://www.uaemex.mx/Culinaria/primer_numero/maiz.html

17 http://www.fao.org/docrep/t0395s/t0395s03.htm

18 http://www.redalyc.org/pdf/620/62028007005.pdf

19 http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema_07_1_micro_industria_penicilina.pdf

20 M. en Ciencias Carolina Campos y Dr. Francisco José Fernández Perrino (2006).

Transformacion en Penicillium Chrysogenum para una sobreproduccion de penicilina G.

21 Evrim Taskin, Regin Eltem and Esra Soyak (2010). Enchancement of solid-state

fermentation for production of penicillin G on sugar beet pulp.

48