“VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS
CUANTITATIVOS Y CUALITATIVOS
(ISO 16140-3 e ISO 16140-4) ”

“Expositora: Cinthia Anyela Ramos Ynjante”

Lima, 23 de Abril 2023

BV_C2_Internal
 VERIFICACIÓN DE LOS ITEM ALIMENTARIOS PARA
EL MÉTODO DE SALMONELLA SPP EN EL PRODUCTO
“PECHUGA DE POLLO” (PROTOCOLO 3)

BV_C2_Internal
 I. DETERMINACIÓN DEL eLOD50 (PROTOCOLO 3)

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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NÚMERO DE RÉPLICAS (PROTOCOLO 3)

Material de referencia
con concentración
conocida

No precisa conocer el LOD50 del método validado

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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VERIFICACIÓN DE ARTÍCULOS ALIMENTARIOS
(PROTOCOLO 3)

5 UFC /
BLANCO
porción

Referencia: ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
VERIFICACIÓN DE ARTÍCULOS ALIMENTARIOS
(PROTOCOLO 3)

5 UFC /
BLANCO
porción

BAJO BLANCO Referencia: ISO 16140-3: 2021

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INOCULACIÓN DE PORCIONES PARA LA VERIFICACIÓN DE
ARTÍCULOS ALIMENTARIOS (PROTOCOLO 3)

5 UFC/ml

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 INOCULACIÓN DE PORCIONES PARA VERIFICACIÓN DE
ARTÍCULOS ALIMENTARIOS (PROTOCOLO 3)

El material de referencia se
prepara para garantizar un
inóculo de 3 UFC a
5UFC/porción de ensayo.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 VERIFICACIÓN DE ARTÍCULOS ALIMENTARIOS
(PROTOCOLO 3)

EL RESULTADO CUMPLE EL CRITERIO

DE ACEPTACIÓN

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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VERIFICACIÓN DE ARTÍCULOS ALIMENTARIOS (PROTOCOLO 3)

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Evaluación de Resultados – Protocolo 3

• El nivel en blanco no producirá un resultado positivo.

• El nivel de contaminación de las porciones deberá estar 3 UFC y 5
ufc/porción de prueba.
• Si el nivel de contaminación es > 5 ufc/porción de ensayo, los
resultados no podrán utilizarse y se repetirá el experimento.
• Si el nivel de contaminación es < 3 ufc/porción de prueba y se cumple
el límite de aceptabilidad.
• No se determina ningún eLOD mediante el protocolo 3. Los
resultados se evaluarán en función del número de positivos
encontrados de los siete réplicas analizados

BV_C2_Internal
LÍMITES DE ACEPTABILIDAD Y RESULTADOS

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 TALLER 2
VERIFICACIÓN DE LOS ITEM ALIMETARIOS
(PROTOCOLO 3)
1. ¿Realizar la verificación de los item alimentarios (usando
el protocolo 3) para el método de Salmonella ISO 6579-
2017 en los siguientes productos: Cacao en polvo, Quinua
roja, Galleta con relleno y alimento balanceado?

2. ¿Indicar si los resultados obtenidos cumplen el criterio de

aceptación según la tabla 16 de la ISO 16140-3?

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PARÁMETROS A EVALUAR PARA LA VERIFICACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS
(Características de performance requerido)

Desviación
estándar de
reproducibilidad
intralaboratorio
(SIR)

Desviación
estimada
(eBias)

Referencia: ISO 16140-3: 2021 Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de referencia y métodos alternativos validados

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II. PROTOCOLOS PARA LA VERIFICACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS

El protocolo de verificación de métodos cuantitativos, al contrario

que en el caso anterior, requiere de 2 protocolos diferenciados
para las dos etapas.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 A) VERIFICACIÓN DE LA IMPLEMENTACIÓN DE MÉTODOS
CUANTITATIVOS

Consiste en determinar la desviación estándar de reproducibilidad

intralaboratorio (SIR) mediante el análisis duplicado de un alimento
que se analice habitualmente por el laboratorio y que no presente
una especial complejidad en su análisis.
Los análisis se deben realizar bajo condiciones de reproducibilidad
disponibles en el laboratorio; es decir mediante diferentes analistas,
lotes de medios de cultivo y equipos ( pipetas, incubadoras, etc.).
Dichos duplicados deben repetirse al menos en diez ocasiones.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 A) CÁLCULO DE LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

A partir de los diez resultados duplicados (en valor logarítmico) se

estima el valor del SIR:

Los resultados obtenidos para ese alimento se comparan con el valor de la

desviación estándar de reproducibilidad (SIR), obtenido a partir de la
validación del método que se va a evaluar.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 CONTAMINACIÓN
ARTIFICIAL

Referencia: ISO 16140-3: 2021 (Anexo D.1)

BV_C2_Internal
Protocolo para determinar la
desviación estándar de
reproducibilidad
intralaboratorio (SIR)

Referencia: ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
CÁLCULO DE LA LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

• Caso práctico: El laboratorio usuario ha examinado 12

muestras de laboratorio de tiramisú para determinar la
concentración de Enterobacterias (según la norma ISO
21528-2) siguiendo el protocolo de estudio que se indica en
la tabla anterior.

• Se obtuvieron los resultados (calculando ufc/g en las

proporciones para análisis A y B de la muestra de
laboratorio) que se indica en la tabla siguiente.

BV_C2_Internal
CÁLCULO DE LA LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
• Los resultados de las muestras de laboratorio 1 y 11 no se
pueden utilizar porque uno de los recuentos fue
demasiado alto ( resultado “>”) o demasiado bajo (por
debajo del rango de recuento permitido según la norma
ISO 7218). Se dispone de los resultados de diez muestras
de laboratorio para el calculo.

• A partir de las 10 muestras de laboratorio restante, el SIR se

puede calcular como se muestra a continuación.

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
 CÁLCULO DE LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021 BV_C2_Internal

• El valor de SIR calculado de 0.18 se compara con los resultados del
estudio de validación (datos tomados de la norma 21528-2). La tabla
12 enumera los valores de SR obtenidos de este estudio de validación.

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
• El experimento está diseñado para no considerar el efecto del
articulo (alimentario). El SIR resultante se compara con el SR de
uno de los artículos (alimentarios) ensayados en el estudio de
validación. En este ejemplo, el valor medio más bajo de SR fue
0,18 (para pienso).

• El SIR obtenido en el estudio de verificación (0,18) se evalúa frente

al 2 x SR (2 x 0.18) obtenido en la ´validación.

• Dado que el SIR del estudio de verificación (0,18) es menor de 0,36

(2 x 0,18), la conclusión es que cumple el limite de aceptabilidad
para la verificación de la implementación.

Nota: Cuando solo se determina un valor de SR durante el estudio

de validación, el valor de SR se compara con este valor.

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021

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 CÁLCULO DE LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

SIR: CONFORME

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021

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 TALLER 3
CÁLCULO DEL SIR
1. ¿Calcular el SIR para el método de Staphylococcus
coagulassa positivo ISO 6888-1:2021 para el producto
carne, según la ISO 16140-3: 2021?

2. ¿Indicar si el valor del SIR cumple el criterio de aceptación

según la tabla 16 de la ISO 16140-3?

BV_C2_Internal
CÁLCULO DE LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO (SIR)

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 B) VERIFICACIÓN DE PRODUCTOS ALIMENTARIOS

• La verificación de alimentos de alimentos se realiza mediante la

desviación estimada (eBias), que también se puede expresar como la
exactitud o sesgo estimado, es decir, la diferencia entre el valor de
referencia obtenido sin matriz y el resultado de los alimentos inoculados
con dicho valor de referencia.

• Para ello, se debe contar con 5 alimentos de diferentes categorías que

sean complejos de analizar y supongan un reto que se va a verificar.
Cada alimento se inocula a 3 niveles (de acuerdo con los niveles
habitualmente analizados por el laboratorio.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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B) DETERMINACIÓN DE LA DESVIACIÓN ESTIMADA (eBIAS)

• Para cada nivel de contaminación, se analiza cada alimento empleando

un lote diferente en dos porciones (A y B), y también se realiza una
porción de análisis sin alimento (referencia).

• Para cada nivel de inoculación y alimento, se estima la desviación

estimada como la diferencia entre el valor medio de las porciones A y B
(con alimento) y el valor de referencia (sin alimento).

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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B) DETERMINACIÓN DE LA DESVIACIÓN ESTIMADA (eBIAS)

Pasos a seguir:
1. Seleccionar 5 categorías de alimentos desafiantes.
2. Caracterizar el inóculo para realizar la contaminación artificial.
3. Contaminar artificialmente usando 3 niveles de contaminación.
- Diferentes lotes por cada nivel de contaminación
- Cada nivel se debe realizar por duplicado
4. Realizar la siembra de cada nivel contaminado.
5. Sembrar una muestra control para conocer el recuento de la muestra
sin contaminar de forma artificial.

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SELECCIÓN DE ITEMS DE ALIMENTOS PARA EL CÁLCULO DEL
SEGO ESTIMADO (eBIAS)
Selección ítems de alimentos: Seleccionar un ítem (El más desafiante) por
cada categoría, teniendo en cuenta el alcance del laboratorio (PASO 1)

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VERIFICACIÓN DE ARTÍCULOS (ALIMENTOS) – TABLA 4

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 CARACTERIZAR PRELIMINAR DEL INÓCULO
• Realizar una enumeración preliminar de la suspensión microbiana que se
utilizará para la verificación del método, a fin de proporcionar una estimación
del nivel del inóculo que se utilizará (PASO 2)

5 x 107 5 x 106 5 x 105 5 x 104 5 x 103 5 x 102 5 x 101 5 x 100

ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL

5 x 107
ufc / mL
50 ufc 5 ufc

Referencia: ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
 CARACTERIZACIÓN DEL INÓCULO
• Realizar la enumeración de la suspensión microbiana utilizada para la
contaminación de las muestras (PASO 2)

5 x 107 5 x 106 5 x 105 5 x 104 5 x 103 5 x 102 5 x 101 5 x 100

ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL ufc / mL

5 x 107
ufc / mL
50 ufc 5 ufc

Referencia: ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
CONTAMINACIÓN ARTIFICIAL DE LAS MUESTRAS
DISEÑO EXPERIMENTAL (PASO 3)

BV_C2_Internal
 CONTAMINACIÓN ARTIFICIAL DE LAS MUESTRAS
DISEÑO EXPERIMENTAL (PASO 3)

Referencia: ISO 16140-3: 2021 BV_C2_Internal

 Protocolo para
determinar la
desviación estimada
(eBias)

NOTA: Este protocolo debe repetirse en total 3 veces para cada alimento, con tres niveles de inóculos diferentes. Referencia: ISO 16140-3: 2021

BV_C2_Internal
 PROTOCOLO PARA DETERMINAR LA DESVIACIÓN
ESTIMADA (eBIAS)

Protocolo para
determinar la
desviación estimada
(eBias)

V
V

(PASO 4)

Referencia: ISO 16140-3: 2021 BV_C2_Internal

 CÁLCULO PARA DETERMINAR LA DESVIACIÓN
ESTIMADA (eBIAS)

C
C

CC
eBIAS: CONFORME

Referencia: ISO 19036: 2019; ISO 16140-3: 2021 BV_C2_Internal

CÁLCULO PARA DETERMINAR LA DESVIACIÓN ESTIMADA (eBIAS)

BV_C2_Internal
 RESUMEN DE PROTOCOLO DE VERIFICACIÓN

Referencia: ISO 16140-3: 2021

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 TALLER 4
CÁLCULO DEL SESGO (eBIAS)
1. ¿Calcular el sesgo (eBIAS) para el método de
enterobacterias ISO 21528-2 para los productos harina
de carne - hueso y quinua roja, según la tabla de la ISO
16140-3: 2021?

2. ¿Indicar si los resultados obtenidos para el sesgo (eBIAS)

cumple el criterio de aceptación según la tabla 16 de la ISO
16140-3: 2021?

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BV_C2_Internal