NORMA TCNICA NTC

COLOMBIANA 5201


2003-10-22




LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS.
DIRECTRICES PARA UNA DESCRIPCIN
NORMALIZADA DE ENSAYOS DE CONFIRMACIN
PRELIMINAR PARA LA DETECCIN DE RESIDUOS
ANTIMICROBIANOS








E: MILK AND MILK PRODUCTS. GUIDELINES FOR A
STANDARDIZED DESCRIPTION OF PRELIMINARY
CONFIRMATION TESTS FOR THE DETECTION OF
ANTIMICROBIAL RESIDUES


CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopcin idntica
(IDT) por traduccin de la ISO/DIS
18830 IDF 188

DESCRIPTORES: leche; producto lcteo; antimicrobianos,
antibiticos.












I.C.S.: 67.100.10

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435


Prohibida su reproduccin Editada 2003-11-11









PRLOGO



El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 5201 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2003-10-22.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 45 Leche y productos lcteos.

ALGARRA S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
ASINAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y
PREVENCIN DE LA MASTITIS
CONSEJO NACIONAL LCTEO
COOPERATIVA DE PRODUCTORES DE
LECHE DE LA COSTA ATLNTICA
EMPRESAS POLAR
INSTITUTO COLOMBIANO
AGROPECUARIO -ICA-
NESTL DE COLOMBIA S.A.
HUGO PARDO
PLASTILENE S.A.
PREPAC
PRODUCTOS NATURALES DE LA SABANA
S.A. ALQUERA
ROBIN HOOD
SERVICIO SECCIONAL DE SALUD DEL
CAUCA
TETRA PAK

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

3 M DE COLOMBIA
ANALAC
AQUALAB
ASOCIACIN NACIONAL DE INDUSTRIALES
CENTRO AGROLECHERO
COLSUBSIDIO
CONSUMIDORES COLOMBIA COCO-
COOLECHERA
COOPERATIVA DE GANADEROS DE
CARTAGENA -CODEGAN
COOPERATIVA DE LECHEROS DE
ANTIOQUIA -COLANTA-
DERILAC
DIAN
DIRECCIN INSTITUTO DEPARTAMENTAL
DE SALUD DE ARAUCA
DOALECHE ALIMENTOS S.A.
FEDERACIN COLOMBIANA DE
GANADEROS -FEDEGAN-
FRESKALECHE S.A.
GRUPO ALIVAL LTDA.
HELADOS MIMOS
ICTA -UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
INDUCOLSA S.A.










INGECAL UNIVERSIDAD CATLICA DE
MANIZALES
INSTITUTO MUNICIPAL DE SALUD
PEREIRA
INTERENZIMAS
INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA-
J. ROMERO INGENIERA
LA CAMPIA S.A.
LCTEOS ANDINA
LARKIN LTDA.
LUCTA GRANCOLOMBIANA S.A.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA
S.A.
MERCK COLOMBIA S.A.








MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL
PARMALAT -PROLECHE-
PASTEURIZADORA HOMOLAC
PRODUCTOS AMY
PRODUCTOS LCTEOS SANTO DOMINGO
RHODIA COLOMBIA LTDA.
SECRETARA DISTRITAL DE SALUD BOGOT
SENA-PLANTA LCTEOS
SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y
COMERCIO
TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS
TECNOALIMENTARIA
TOLYHELADOS
UNIVERSIDAD JAVERIANA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
MINISTERIO DE AGRICULTURA
MINISTERIO DE COMERCIO INDUSTRIA
Y TURISMO




ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN





NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 5201

1






LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS.
DIRECTRICES PARA UNA DESCRIPCIN NORMALIZADA
DE ENSAYOS DE CONFIRMACIN PRELIMINAR PARA LA
DETECCIN DE RESIDUOS ANTIMICROBIANOS







INTRODUCCIN

Debido al mtodo de deteccin, estas pruebas pueden tener limitaciones, de manera que no se
pueden usar para cuantificacin. Por ejemplo, los ensayos de receptores tienen capacidad de
deteccin para grupos de sustancias y no para qumicos en particular deteccin especfica de
grupos, no deteccin especfica de qumicos. En consecuencia, los positivos no pueden
someterse a cuantificacin sin conocer la identidad del contaminante especfico. Adems, los
ensayos basados en el examen visual del desarrollo del color no pueden medir el grado de
color y por tanto, no pueden brindar un valor cuantitativo.

Dentro de un sistema integrado para deteccin de residuos antimicrobianos, se pueden usar
inmunoensayos y ensayos de receptores como los mtodos de seleccin primarios, por
ejemplo, para seleccin de compuestos que no se pueden detectar a niveles regulatorios
mediante ensayos de inhibicin microbiolgica. Estos mtodos tambin se pueden usar como
mtodos de post-seleccin para la identificacin y cuantificacin preliminar de compuestos en
muestras con resultado positivo en un ensayo de inhibicin microbiolgica. Dependiendo de si
un ensayo determinado cumple con las especificaciones dadas abajo, los inmunoensayos y los
ensayos de receptores se pueden usar para control de calidad de rutina, especialmente si se
va a determinar la ausencia/presencia de un determinado compuesto en concentraciones que
exceden un determinado nivel (por ej: lmite mximo de residuos, LMR). Las sustancias que no
son aprobadas o para las cuales no se ha fijado un LMR, pueden requerir consideracin
especfica. Para propsitos legales, en muchos pases los resultados positivos obtenidos
mediante inmunoensayos o evaluaciones de receptores requieren la confirmacin de un
fisicoqumico aceptado.


1. OBJETO

Esta norma brinda orientacin para la descripcin normalizada de ensayos de confirmacin
preliminares para la deteccin de residuos antimicrobianos en la leche y los productos lcteos.
Se busca brindar una estructura y una base para la evaluacin/validacin de ensayos basados
en la unin de un compuesto antimicrobiano con su anticuerpo especfico u otros tipos de
molculas de deteccin. Adems de los inmunoensayos, por ejemplo: el EIA (inmunoensayo de
enzimas) y el RIA (radioinmunoensayo), hay varios formatos de ensayo cuantitativos,
semicuantitativos y cualitativos basados en la unin de compuestos antimicrobianos a
receptores microbianos o a protenas receptoras. Los ensayos de enzimas y los ensayos de

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2
partculas, basados en protenas receptoras se designan en este documento como ensayos de
receptores.


2. REFERENCIA NORMATIVA

La siguiente norma contiene disposiciones que, mediante su referencia en este texto constituyen
disposiciones de esta norma. Para referencias fechadas no se aplican las enmiendas posteriores
o actualizaciones de esta norma. Sin embargo, se invita a las partes que realizan acuerdos con
base en esta norma, a que investiguen la posibilidad de aplicar las versiones ms recientes de
sta. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo
mencionado. Los miembros de ISO e IEC mantienen registros de las normas internacionales
vlidas actualmente.

ISO 13969, Milk and Milk Products. Guidance for the Standardized Description of Microbial Tests.


3. TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propsitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones:

3.1
falsos positivos
Porcentaje de resultados positivos cuando se ensayan muestras negativas.

3.2
falsos negativos
El porcentaje de resultados negativos al(los) nivel(es) de deteccin declarado(s).

3.3
especificidad
La medida en la cual la presencia de sustancias con estructuras qumicas similares a la del
analito objetivo tendr como consecuencia un resultado positivo (reaccin cruzada).

3.4
lmites de deteccin para los ensayos de calidad
El nivel de concentracin al cual se detecta un porcentaje definido de muestras, por ejemplo:
95 %, junto con el nivel de confianza respectivo.

3.5
lmites de deteccin para ensayos cuantitativos
El nivel de concentracin que da un resultado final que es estadsticamente diferente del de la
leche negativa.

3.6
precisin
Los resultados de estudios en colaboracin, si los hay a disposicin.



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3
4. INFORMACIN NECESARIA DEL FABRICANTE O QUIEN REALIZA EL ENSAYO

4.1 METODOLOGA

El fabricante o quien realiza el ensayo debe suministrar informacin concerniente a:

El principio del mtodo, por ejemplo: inmunoensayos de enzimas directos competitivos.

Descripcin del mtodo, por ejemplo: preparacin de la muestra y realizacin del ensayo.

Evaluacin de los resultados del ensayo, por ejemplo: lectura instrumental o visual, criterios
para resultados positivos o negativos.

Capacidad, por ejemplo, rendimiento de la muestra.

Requisitos especiales para muestreo, preservacin y ensayo.

Procedimiento para propsitos de aseguramiento de la calidad, incluido el uso de muestras de
control positivas/negativas.

Campo de aplicacin:

- Uso previsto del ensayo, por ejemplo: seleccin para pago por calidad de la
leche;

- Para propsitos regulatorios (deteccin de sustancias prohibidas).

- Matriz, por ejemplo: leche a granel sin procesar, o leche tratada con calor.

a) Limitaciones con respecto a la composicin de la muestra, por ejemplo:
recuento celular y calidad bacteriolgica.


4.2 REACTIVOS DEL KIT DE ENSAYO

Se debe suministrar la siguiente informacin:

En el caso de inmunoensayos:

a) Tipo de anticuerpos (monoclonales o policlonales, de oveja, conejo o huevo).

- Tipo de antgeno usado en el ensayo (por ejemplo: conjugado antgeno-
enzima; antgeno en fase slida).

- Tipo de marcador para produccin de seales (por ejemplo: enzima:
peroxidasa, fosfatasa alcalina, radioqumica: H
3
, C
14
, I
125
, perla inerte:
perla de ltex de color, oro).

- Si es aplicable, tipo de sustrato de enzima y tipo de sustancia usada para
transformacin de la actividad enzimtica en una seal medida (por
ejemplo: perxido de hidrgeno/tetrametilbencidina).

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4
b) En el caso de ensayos de receptores microbianos:

- Tipo de etiqueta, por ejemplo: istopo radioactivo.

- Cantidad de radioactividad y requisitos de seguridad.

- Tipo de receptor (por ejemplo: anticuerpos o clulas microbianas no
viables).

c) En el caso de ensayos con protenas receptoras (por ejemplo: conjugado
receptor-enzima).

- Tipo de reactivo que compite por los sitios de unin de protenas
receptoras (por ejemplo: conjugado analito-enzima, analito de fase
slida).

- Reaccin(es) enzimtica(s) usada(s) para producir seales.

- Tipo de sustrato de enzima y tipo de sustancia usada para transformacin
de la actividad enzimtica a la seal medida.


4.3 QUMICOS ADICIONALES NO INCLUIDOS NECESARIAMENTE EN EL KIT DE
ENSAYO

Se debe establecer lo siguiente:

- La pureza y calidad de los qumicos requeridos.

- La composicin y preparacin de las soluciones.

- Las condiciones de almacenamiento y estabilidad de las soluciones.

- La calidad requerida del agua.

4.4 REQUISITOS OPERATIVOS

a) Requisitos de equipo de laboratorio:

- Lector de placa de microtitulacin.

- Fluormetro, contador de centelleo, hardware y software de computador.

- Incubadoras, pipetas de precisin.

b) Requisitos de seguridad, por ejemplo: para manejo y disposicin de residuos
radioactivos.

c) Requisitos de experiencia y entrenamiento del usuario.

d) Requisitos de control de calidad por parte del fabricante y/o usuario.


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5
4.5 ESPECIFICACIONES DE ENSAYO

Se debe indicar lo siguiente:

a) Falsos positivos: el porcentaje de resultados positivos cuando se ensayan
muestras negativas.

b) Falsos negativos: el porcentaje de resultados negativos cuando se ensaya leche
a un nivel especificado, por ejemplo: el nivel de deteccin declarado.

c) Especificidad: el grado en el cual la presencia de sustancias con estructuras
qumicas similares a la del analito objetivo tendr como consecuencia un
resultado positivo (reaccin cruzada).

d) Lmite de deteccin:

- Para ensayos cualitativos: el nivel de concentracin al cual se detecta el
porcentaje definido de muestras, por ejemplo: 95 junto con el nivel de
confianza respectivo.

- Para ensayos cuantitativos: el nivel de concentracin que da un resultado
estadsticamente diferente del de la muestra negativa.

e) Precisin (repetibilidad y reproducibilidad): los resultados de estudios en colaboracin, si
los hay a disposicin.

4.6 LITERATURA

Incluya lo siguiente:

- Manual del usuario, con una gua para solucin de problemas.

- Proveedores de instrumentos, reactivos, patrones, servicios tcnicos, soporte a
los clientes.

- Estado de reconocimiento oficial en pases especificados (si los hay a disposicin).

- Disponibilidad de material de referencia.

- Disponibilidad de mtodos de referencia validados/reconocidos
internacionalmente de ISO, IDF y AOAC International y otros.

- Disponibilidad de literatura y experiencia prctica.


5. EVALUACIN DE LOS ATRIBUTOS DEL ENSAYO INMUNO ENZIMTICO O DEL
RECEPTOR
1


5.1 PRERREQUISITOS

Vase la norma ISO 13969.


1
En estudio.

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5.1.1 Leche libre de antimicrobianos (leche negativa)

Las vacas de las cuales se va a recolectar leche que va a servir como leche negativa deben
cumplir los siguientes requisitos:

- El estado de salud clnico y subclnico debe ser bueno, con nfasis especial en
la salud de las ubres (<250 000 clulas somticas por ml).

- Los tratamientos o alimentacin con sustancias antimicrobianas se deben prohibir al
menos 8 semanas antes de la recoleccin de la leche. En el caso de tratamientos
para la vaca seca la leche no se debe recolectar antes de 60 d a partir del parto,
siempre y cuando el perodo de la vaca seca haya sido de 4 semanas al menos.

- Las vacas deben estar en el punto medio de la lactacin: > 60 d y < 200 d
despus del parto (> 5 kg de leche por da).

- El ordeo de al menos 5-7 vacas se debe combinar, para superar las variaciones
individuales en la composicin de la leche.

- El recuento viable total debe ser 10
4
de unidades formadoras de colonias por ml,
antes del proceso de preservacin (congelamiento rpido, liofilizacin). En el
caso de ensayos con el antibitico -lactam, se debe tener en cuenta la
presencia posible de -lactamasa que produce microorganismos.

5.1.2 Sustancias de ensayo

Las sustancias que se usan en el procedimiento de ensayo se deben obtener con un proveedor
reconocido, preferiblemente con un certificado analtico con una especificacin garantizada. La
concentracin requerida se debe calcular con base en las formas de cido libre o base de la
droga corregida para lograr su pureza. Se debe dar consideracin especial a sustancias con
problemas de estabilidad. A menos que se establezca algo diferente, la evaluacin de los
lmites de deteccin (vase el numeral 5.5.2) se debe realizar usando todos los antimicrobianos
y las concentraciones que el fabricante declara que el ensayo detectar.

5.1.3 Solventes

Si se requieren solventes especiales para disolver las sustancias, se debe asegurar que estos
solventes o qumicos en las muestras de ensayo no tendrn influencia en el resultado del ensayo.

5.1.4 Preparacin de las muestras de ensayo

5.1.4.1 Generalidades

Para evaluaciones a gran escala, por ejemplo, para obtener la base de datos para una
descripcin generalizada, se deben preparar todas las diluciones requeridas en un lote, para
evitar las variaciones de un da a otro en el peso, dilucin y diferencias en el estado de la
"leche negativa".

Ya que la preparacin de las muestras de ensayo es una tarea que requiere mucho esfuerzo,
puede ser apropiado emplear un laboratorio centralizado de preparacin de muestras de
ensayo, que acepte suministrar las muestras de ensayo en forma estable a los laboratorios
interesados, por ejemplo: liofilizadas.

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5.1.4.2 Seleccin de concentraciones

La seleccin de concentraciones para la determinacin de los lmites de deteccin se describe
en los numerales 5.2.2. Para propsitos de la estimacin, se debe ensayar la concentracin
que se encuentra que representa el lmite de deteccin, junto con un nivel de concentracin
ms alto y dos o tres niveles ms bajos del lmite de deteccin declarado, y la leche negativa
correspondiente. Estos datos se pueden usar para estimar una concentracin de muestras
positivas del 25 %, 50 %, 75 % y 95 %. A manera de orientacin, se recomienda dividir el intervalo
de concentracin que da como resultado muestras positivas del (50-100)% en 3 niveles - 4 niveles
a igual distancia (lineales y logartmicos respectivamente), como se demuestra en la Figura 1.

5.1.4.3 Dilucin

Las siguientes precauciones se deben cumplir cuando se preparan series de dilucin de
sustancias de ensayo:

- La preparacin de la serie de dilucin se debe llevar a cabo de manera que slo el
paso de dilucin final se prepare con leche, con el fin de evitar uniones de protenas.

- La proporcin de la solucin patrn acuosa agregada en el paso final de dilucin
de la leche, debe ser la misma para todas las muestras y 1 %.


0
100
80
60
40
20
0 Antimicrobial g/kg

Positivo NMR
esperado esperado
1,5 x positivo
Lmite de
deteccin
Rango del lmite
de deteccin
Resultados positivos %


Figura 1. Modelo de curva de respuesta de dosis para la
estimacin de lmites de deteccin


Adems, una plantilla de ensayo ptima para determinaciones cuantitativas debe usar seis
valores de calibracin.

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5.1.4.4 Preservacin

La preservacin de las muestras de ensayo preferiblemente se debe llevar a cabo mediante
liofilizacin, si la acepta el inventor o fabricante del ensayo bajo estudio. Se ha demostrado que
el siguiente procedimiento es viable:

- Inmediatamente despus de la preparacin, las diferentes diluciones de leche se
deben distribuir en tubos de ensayo con el volumen deseado, y se deben
congelar a 18 C 2 C en posicin inclinada.

- La liofilizacin se debe realizar tan pronto como sea posible, y a ms tardar una
semana despus del congelado rpido.

- Durante el proceso de liofilizacin, la temperatura no debe exceder los 25 C.

- Los tubos de ensayo se deben sellar hermticamente inmediatamente despus
de la liofilizacin y almacenar en la oscuridad a una temperatura de 6 C.

- Las muestras de ensayo se deben reconstituir con agua destilada. El volumen de
agua adicionado debe ser el 10% menos que el volumen de la leche que fue
liofilizada, para compensar la materia seca de la leche.

- Las muestras de leche de ensayo reconstituidas se pueden usar solamente el
da de la reconstitucin. Se deben mantener en el refrigerador entre usos, y
descartar al finalizar el da.

Las muestras de ensayo tambin se pueden preservar mediante congelamiento rpido y
mediante algunos preservativos qumicos (vase el numeral 5.2.5.3).

5.1.5 Diseo experimental

5.1.5.1 Nmero de rplicas

El diseo experimental debe ser preferiblemente un estudio codificado dirigido y debe seguir lo
ms cerca posible las instrucciones del fabricante con relacin al nmero de rplicas y
condiciones de ensayo.

El resultado de un ensayo cualitativo se debe expresar como el porcentaje de resultados
positivos del nmero total de rplicas para cada concentracin. Para el clculo de porcentajes,
generalmente se requieren de 10 rplicas - 20 rplicas a cada concentracin seleccionada. Sin
embargo, si se requiere confianza estadstica, se debe determinar el nmero apropiado de rplicas.
A manera de ejemplo, para propsitos de confirmacin se debe evaluar un mnimo de 60 muestras,
para determinar una tasa negativa del 90 % con 95 % de confianza, por ejemplo: 2 positivos o
menos, de 60 ensayados.

Los resultados cuantitativos se deben evaluar usando los mtodos estadsticos usuales para
calcular la repetibilidad. Si se usan kits de ensayo de microtitulacin, se deben usar al menos
duplicados para patrones y muestras.

5.1.5.2 Evaluacin de datos experimentales

El lmite de deteccin usualmente se define como la concentracin que da lugar a una respuesta
que es significativamente diferente de la respuesta de las muestras negativas. Para evaluacin
estadstica, es imperativo contar con un acuerdo sobre el nivel de confianza del mtodo que se

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estudia. Es comn aplicar un nivel de confianza mnimo del 95 %. Sin embargo, para cumplir esto,
se requiere un ensayo extenso y un gran nmero de rplicas en cada concentracin. Dependiendo
del uso previsto del mtodo, se puede usar un enfoque ms prctico.

En un ensayo cualitativo, la respuesta de una muestra usualmente se compara con un punto de
seleccin que puede estar basado en los resultados de patrones de control negativos o
positivos. El fabricante del kit puede suministrar los puntos de seleccin, por ejemplo: una
vlvula de corte o una marca/patrn de referencia, ya sea como una comparacin de ensayo
interna o como un calibrador de referencia externa. Se calculan o disean para distinguir una
respuesta negativa de una positiva, incluidas 2 desviaciones estndar 3 desviaciones
estndar. Para este propsito, los fabricantes de los kits de ensayo algunas veces suministran
un patrn positivo o negativo que contiene una concentracin definida y pertinente del(los)
analito(s) que el ensayo declara detectar. Esta concentracin se escoge usualmente con
respecto a requisitos reglamentarios, por ejemplo: LMR. Usando muestras de referencia, la
respuesta de la muestra se compara con el valor de corte o de referencia, para determinar si la
muestra contiene concentraciones similares o superiores a las del control positivo.

Para anlisis de datos de un ensayo cualitativo, se recomienda una presentacin grfica, en la
que el eje-x represente la concentracin de la sustancia que se estudia, y el eje-y el porcentaje
de resultados positivos (curva dosis-respuesta). La decisin de si el eje- x debe ser lineal o
logartmico depende del intervalo de concentraciones ensayadas. Si el intervalo abarca 10
2
,
es ms apropiada una escala logartmica que una lineal.

En un mtodo cuantitativo se elabora una curva estndar y se usa para estimar la
concentracin de analito en la muestra. El eje x representa la concentracin de la sustancia
que se estudia, y el eje y representa una escala basada en, por ejemplo: absorbancia,
fluorescencia o radioactividad. La decisin de si el eje x debe ser lineal o logartmico depende
del rango de concentraciones ensayadas. Si el rango comprende 10
2
, una escala logartmica
es ms apropiada que una lineal, y se elabora una curva semilogartmica. Usando esta escala
semilogartmica, la curva estndar del inmunoensayo muestra una forma sigmoide que no se
puede evaluar usando modelos lineales. Sin embargo, existe una variedad de modelos
matemticos para describir curvas estndar del inmunoensayo, ms comnmente el modelo
logstico de cuatro parmetros y la aproximacin de una segmentacin cbica se usan para
inmunoensayos de enzimas. Ambos mtodos dan resultados comparables y al menos uno de
ellos se implementa en la mayora de programas disponibles para clculo de datos de
inmunoensayos.

En un mtodo cuantitativo, la precisin de un estimado se ve afectado en gran medida por la
ubicacin del valor de absorbancia observado en la curva de calibracin. El rango de medicin
para la curva estndar es la parte aproximadamente lineal de la curva sigmoide (concentracin
trazada en la escala log).

5.2 PARMETROS EXPERIMENTALES

5.2.1 Falsos positivos y falsos negativos

Para mtodos cualitativos, dependiendo del uso previsto del mtodo bajo estudio, puede ser
apropiado evaluar la probabilidad de resultados falsos positivos y falsos negativos. El ensayo
para determinar la probabilidad de resultados falsos positivos o falsos negativos incluye n
exmenes de la leche de ensayo negativa (vase el numeral 5.1.1) u otras muestras de ensayo
negativas apropiadas. El nmero de rplicas depende del campo de aplicacin. A manera de
ejemplo, se deben evaluar mnimo 60 muestras para determinar una tasa negativa del 90 % con un
nivel de confianza del 95 %.

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10
La probabilidad de falsos negativos a un nivel especificado se pueden obtener de la curva
dosis-respuesta para las diferentes concentraciones ensayadas. Si se requiere confianza, la
evaluacin debe seguir el procedimiento descrito para falsos positivos para la concentracin de
inters, por ejemplo: el lmite de deteccin del LMR.

5.2.2 Lmite de deteccin

La seleccin de los compuestos antimicrobianos empleados para determinar el lmite de deteccin
depende de las declaraciones del fabricante o de quien realiza el ensayo. El principio de preparacin
de las muestras de ensayo necesarias se describe en el numeral 5.1.4. La seleccin de las
concentraciones por ensayar debe ser como sigue: entre el control negativo y la concentracin que se
espera que sea positiva, se deben examinar al menos 4 concentraciones diferentes que se estima
que corresponden a 25 % positivas, 50 % positivas, 75 % positivas y 95 % positivas. Las
concentraciones seleccionadas deben incluir el lmite de deteccin declarado, y si es apropiado, las
concentraciones que corresponden a cualquier reglamentacin existente, por ejemplo, el valor del
LMR Adems, se debe ensayar una muestra fortificada con el antimicrobiano a una concentracin de
al menos el 50 % sobre la concentracin que se espera que d un 100 % de positivos.

Para ensayos cualitativos, como se establece en el numeral 5.1.5.1, son necesarias al menos
de 10 rplicas a 20 rplicas por concentracin, para calcular el porcentaje de resultados de
ensayos positivos. Si no hay requisitos definidos para confianza estadstica, se puede aplicar
un enfoque ms prctico para definir el lmite de deteccin. Una definicin podra ser que el
lmite de deteccin es la concentracin que da como resultado el 95 % de los resultados de
ensayo que se interpretan como positivos.

Usando esta definicin, el lmite de deteccin se puede expresar en dos formas (vase la Figura 1),
es decir, las concentraciones ensayadas que se acercan a un valor de 95 % (> g/kg < g/kg) o la
concentracin que corresponde a la interseccin de la curva dosis-respuesta con la lnea que
representa el 95 % de resultados positivos. Los parmetros de mayor importancia prctica son los
porcentajes de los resultados positivos obtenidos ya sea en el lmite de deteccin declarado o en el
nivel de los requisitos reglamentarios, por ejemplo, los LMR (vase tambin el numeral 5.2.1). Si se
requiere confianza estadstica, es necesario calcular el nmero apropiado de rplicas necesarias.

Para ensayos cuantitativos, el lmite de deteccin se define generalmente a medida que la
concentracin da origen a un resultado significativamente diferente del resultado de las
muestras negativas, es decir, usualmente la concentracin que corresponde al valor medio de
las muestras negativas, menos y ms tres desviaciones estndar, respectivamente.

5.2.3 Especificidad

La especificidad del ensayo describe el grado en el cual la presencia de sustancias con una
estructura qumica o partes estructurales similares a la del analito original en una muestra
tambin dar como resultado una unin, y as se obtiene un resultado positivo en el sistema de
ensayo (reaccin cruzada). Como ejemplo, los metabolitos del analito original pueden
reaccionar con el anticuerpo producido contra el compuesto matriz. La especificidad del ensayo
es un resultado de una reaccin especfica antgeno-anticuerpo o analito-receptor y no se debe
mezclar con la interferencia no especfica (vase el numeral 5.2.5). Para determinar la
reactividad cruzada de una determinada sustancia, sta se debe ensayar a una concentracin
de aproximadamente 100 veces el lmite de deteccin de la(s) sustancia(s) objetivo.

Para ensayos cuantitativos, la especificidad se calcula despus de la determinacin de las
concentraciones de la sustancia objetivo (T
s
) y la sustancia con reaccin cruzada [C
s
] requerida para
una reduccin del 50 % de la seal de ensayo, en comparacin con la del estndar de control
negativo, usando la siguiente ecuacin: % de reactividad cruzada relativa = [T
s
] / [C
S
] x 100. Se deben

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11
indicar todas las reacciones cruzadas significativas (> 1 %) de un inmunoensayo. En caso de duda,
las sustancias se deben ensayar para determinar la reactividad cruzada, en una concentracin que
corresponda al mayor nivel de concentracin de la curva estndar. Para propsitos de cuantificacin
no se pueden usar ensayos con reacciones cruzadas significativas.

5.2.4 Vida til de los kits de ensayo

Para el examen de la variacin de la respuesta de ensayo durante todo el perodo de vida til
declarada de las sustancias de ensayo, el nmero de rplicas y la evaluacin siguen el
procedimiento descrito en el numeral 5.1. Los exmenes se realizan al menos tres veces (al
comienzo, al 50 % o cada 6 meses a partir de la fecha de fabricacin, y al final de la vida til).
Las condiciones de almacenamiento deben seguir las especificaciones del fabricante/inventor
del kit de ensayo.

5.2.5 Susceptibilidad a la interferencia (resistencia)

5.2.5.1 Procedimiento de ensayo

Para investigar los factores de influencia potencial dentro del procedimiento de ensayo, por
ejemplo, variaciones en los reactivos, condiciones de incubacin y volumen de la muestra, se
deben preparar muestras de ensayo con combinaciones de sustancia/concentracin
seleccionadas de acuerdo con el numeral 5.1. El protocolo experimental, que incluye algunas
desviaciones definidas con respecto al procedimiento de ensayo correcto por examinar,
depende de la experiencia del panel de evaluacin.

5.2.5.2 Propiedades/composicin de la leche

Los resultados de los inmunoensayos y de los ensayos de receptores podran estar
influenciados por muchos factores asociados con la composicin/propiedades de la leche, por
ejemplo, la calidad bacteriolgica, contenido de clulas somticas, contenido de grasa y calidad
de la grasa, estado del pH y de lactacin del animal (por ejemplo: lactacin tarda).

En este examen, teniendo en cuenta las limitaciones descritas por el fabricante, se deben
considerar las siguientes preguntas:

- Pueden estos factores dar lugar a falsos resultados positivos, por ejemplo, por
un contenido elevado de clulas somticas?

- Pueden estos factores conducir a falsos resultados negativos, por ejemplo, por
un efecto de enmascaramiento debido a la -lactamasa que produce
microorganismos?

- Pueden estos factores conducir a falsos resultados positivos/negativos, por
ejemplo, por cualquier efecto debido a la cantidad o calidad de la grasa de la
leche?

5.2.5.3 Preservacin de la muestra

Las muestras de ensayo que se van a ensayar para determinar residuos de antibiticos podran
preservarse mediante la adicin de qumicos, por ejemplo: cido brico, o congelacin rpida.
A menos que el fabricante/inventor no la tenga en cuenta, la influencia de los preservativos
qumicos y el riesgo de falsos resultados positivos/negativos se deben examinar a la
concentracin establecida, pero tambin a concentraciones menores y mayores. Las muestras
de ensayo se deben analizar antes de su preservacin, y despus de preservacin y

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almacenamiento. Ya que la adicin de preservativos puede cambiar el nivel de los resultados,
en consecuencia las muestras de control se deben preservar.

5.2.6 Deteccin de sustancias involucradas

Se debe usar material de referencia de instituciones reconocidas, por ejemplo, el BCR
2
. De las
muestras de leche que contienen una concentracin conocida, se deben preparar muestras de
ensayo con concentraciones de acuerdo con el numeral 3.1, mediante diluciones adecuadas
con leche negativa. Un mtodo ms prctico es usar leche de pruebas de tratamiento con
varias vacas a las que se les suministra drogas para uso agrcola. Para comparacin, es
necesaria la cuantificacin del compuesto administrado en las muestras de ensayo, mediante
un mtodo fisicoqumico cuantitativo validado.

5.2.7 Recuperacin

Si en el procedimiento de ensayo se incluyen la extraccin de la muestra y la purificacin del
extracto, se debe indicar la eficiencia de este procedimiento (recuperacin).

5.2.8 Estudios en colaboracin

Para estudios en colaboracin, las muestras de ensayo se deben preparar en un laboratorio de
acuerdo con el numeral 5.1.4. Las muestras de ensayo se deben despachar con los kits de
ensayo bajo las condiciones apropiadas, al menos a 8 laboratorios participantes en el caso de
ensayos cuantitativos, y al menos a 15 en el caso de ensayos cualitativos. La seleccin de las
combinaciones sustancia/concentracin debe seguir lo establecido en el numeral 5.1. Las
muestras de ensayo se deben codificar y cada combinacin sustancia/concentracin se debe
analizar al menos de 10 veces a 20 veces (lectura de ensayo visual), o de 3 veces a 5 veces
(ensayo con escala de medicin) en cada carga del kit de ensayo. Es obligatorio un protocolo
experimental estricto.


6. CATEGORIZACIN DE LOS PARMETROS MEDIDOS

6.1 APLICABILIDAD PARA EL USO PREVISTO

Los parmetros evaluados del ensayo que se examina, posiblemente obtenidos de diferentes
investigaciones llevadas a cabo en diversas ocasiones, se recogen, hasta donde sea posible,
en forma de tablas. Esta informacin se encuentra en la primera parte de la descripcin, que
tambin sirve como la base para la segunda parte. La segunda parte describe estas categoras
y evala la informacin con consideracin especial al campo de ensayo declarado/propuesto.

NOTA Los expertos deberan evaluar constantemente nuevos datos o la informacin disponible sobre este tema.

Considerando el hecho de que la elaboracin de los diferentes atributos toma algn tiempo,
especialmente cuando se tienen que estudiar perodos de almacenamiento, por ejemplo, para
la determinacin de la vida en estantera, el reporte que comprende la categorizacin de los
atributos elaborados se debe dar en secciones, dentro de un cierto lapso de tiempo.

2
BCR es la abreviatura para: BCR Reference Materials (European Commission): direccin IRMM, 2440
Geel, Belgium.

Esta informacin se da para conveniencia del usuario y no constituye respaldo de ICONTEC a los productos.


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13
6.2 RECOMENDACIONES PARA REPORTES

Para reportes consecutivos, se recomienda el siguiente orden:

Seccin 1

- Recuperacin (vase el numeral 5.2.7)

- Lmite de deteccin (vase el numeral 5.2.2)

- Probabilidad de falsos positivos/negativos

- Especificidad (vase el numeral 5.2.3)

Seccin 2

- Susceptibilidad a la interferencia (resistencia) (vase el numeral 5.2.5)

- Deteccin de sustancias involucradas (vase el numeral 5.2.6)

Seccin 3

- Vida til de los kits de ensayo (vase el numeral 5.2.4)

- Estudios en colaboracin y precisin (vase el numeral 5.2.8)

Seccin 4

- Anexo A, B, etc.


DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk and Milk Products.
Guidelines for a Standardized Description of Preliminary Confirmation Tests for the Detection of
Antimicrobial Residues. Geneve, ISO/DIS: 2001 (ISO 18330).