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FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016

LABORATORIO DE QUÍMICA

UNIDAD ACADÉMICA: Departamento de Biología y Química

CURSO: Bioquímica
PRÁCTICA Nº 020: EFECTO DEL TIEMPO DE REACCIÓN Y CONCENTRACIÓN DE ENZIMA.

1. OBJETIVOS
Determinar la actividad enzimática de la catalasa sobre el peróxido de hidrógeno.
Observar el efecto del tiempo de reacción en la actividad catalítica.
Observar el efecto de la concentración de enzima sobre la actividad catalítica.

2. CONSULTA PREVIA
Consulte y describa con el mayor detalle posible cómo es la estructura de la catalasa (puede incluir una imagen
impresa)
Cuál es el código y a que grupo de enzimas pertenece la catalasa.
Consulte para la catalasa, proveniente de cualquier especie que usted desee, cuáles son las condiciones óptimas
(pH, temperatura, etc.) para la acción catalítica de esta. A su vez debe de indicar como realizo la consulta.
Balance la siguiente reacción: H2O2 + KMnO4 + H2SO4------- > K2SO4 + MnSO4 + H2O + O2
¿Qué papel juega el ácido sulfúrico en esta práctica?

3. FUNDAMENTO TEÓRICO

Catalasa: Estructura y función

La enzima catalasa hace parte de la mayoría de organismos actuando como un mecanismo de defensa frente el
anión radical de superoxido dismutasa es la primera línea de defensa en contra del O2. Esta convierte el ion
superoxido a peróxido de hidrógeno, el cual también es una sustancia bastante tóxica para las células. Luego
actúa catalasa, siendo esta responsable de convertir el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno:

En la segunda reacción, representada arriba, el peróxido de hidrógeno sufre tanto una oxidación como una
reducción. Se piensa que es un proceso que ocurre en dos pasos y la catalasa está involucrada en ambos.
En el primer paso una molécula de peróxido de hidrógeno se reduce a agua y la catalasa es oxidada al complejo
l. la segunda molécula de peróxido de hidrógeno es oxidada en el segundo paso y el complejo l es reducido
regenerando así la catalasa:

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La reacción de descomposición sigue una cinética de primer orden dentro de tiempos de reacción cortos (<3 min)
y a altas concentraciones de enzima. Además del mecanismo descrito anteriormente, la catalasa es gradualmente
oxidada por el peróxido de hidrógeno de manera irreversible, así de grandes periodos de reacción o soluciones
diluida de enzima resulta en desviaciones del comportamiento de primer orden.
En esta práctica consta de dos partes, en la primera se obtendrán la enzima a partir de la sangre y se determinará
la cantidad óptima de enzima a utilizar así como la determinación del tiempo de reacción adecuado para los
análisis. Luego de estudiados estos parámetros, la segunda parte de la práctica consistirá en estudiar la actividad
catalítica en función de la concentración de sustrato y determinación las condiciones óptimas de trabajo de esta
enzima (pH y T) junto con la evaluación del efecto de un inhibidor sobre la actividad catalítica de la catalasa.

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos y/o montajes Materiales Reactivos
lanceta esterilizada (1) Buffer fosfatos 0.02 M, pH 7.0 (112.7 mL)
Peróxido de hidrógeno (H2O2) 0.05 M recién
Vasos de 50 mL (1)
preparada en el buffer de pH 7.0 (30 mL)
Vasos de 250 mL (1) H2SO4 6N (30 mL)
Vasos de 400 mL (2) KMnO4 0.005 M (valorado; 60 mL)
Agitador de vidrio (1) Agua destilada (20 mL)
Gradilla (1)
Tubos de ensayo 25x200 (5)
Pipeta de 1 mL graduada (1)
Pipeta de 2 mL aforada (1)
Pipeta de 10 mL graduada (1)
Pipetiador (1)
Erlenmeyer de 100 mL (5)
Bureta de 25 mL (1)
Pinza para bureta (1)
Soporte universal (1)
Sangre
Cronometro
Papel milimetrado o computador
con Excel

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5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA
Nota aclaratoria:
a. Todo el material, en especial los tubos de ensayo, deben estar muy bien lavados para evitar
interferencias.
b. Deben mezclar los reactivos COMPLETAMENTE cuando se le indique.
c. Los tiempos de medida deben ser exactos y registrados.
d. Todas las medidas deben ser hechas de la mejor forma posible utilizando el material adecuado.
e. Recuerde este laboratorio es cuantitativo y no cualitativo, por tanto su éxito está principalmente en el
cuidado y pericia con que trabaje.

5.1 Preparación del extracto de catalasa

A 20 mL de agua destilada agregue entre 4-5 gotas de sangre fresca, obtenida mediante punciones en un dedo
con una lanceta esterilizada. Este extracto contiene la enzima a ensayar y esta se debe conservar durante la
práctica en el baño de hielo y utilizarla lo más rápido posible. SOLO PREPARE ESTO EN EL MOMENTO
EXACTO QUE SE VA UTILIZAR EN CADA TUBO

5.2 Detección de la actividad enzimática

Se detectará la actividad enzimática de la catalasa (luego de agregarle ácido sulfúrico) mediante titulación del
peróxido de hidrógeno remanente en cada tubo de ensayo, empleando permanganato de potasio (0.005 M).
Determinar la ecuación y balancear la ecuación que describe el método de titulación empleado. Esta ecuación
correctamente balanceada permitirá realizar los cálculos necesarios para el desarrollo de la práctica.

5.2.1 Determinación del volumen de enzima

Rotule adecuadamente los tubos de ensayo
Siga el esquema de trabajo mostrado en la tabla 1, adicionando los reactivos en cada tubo de acuerdo al orden
propuesto. MEZCLE MUY BIEN.
Esperare el tiempo indicado (1 min) para añadir el ácido. MEZCLE MUY BIEN.

TITULACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE PERMANGANATO

1. Para la titulación debe transferir el contenido de cada tubo a un Erlenmeyer debidamente rotulado (utilice
uno para cada tubo)

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2. Agregue gota a gota el permanganato de potasio de la bureta al Erlenmeyer para titular el peróxido de
hidrógeno remanente hasta el punto final.
3. El punto final de la titulación se alcanza cuando aparece un color rosado permanente (30s).
4. Registre el volumen utilizado de KMnO4 para cada tubo y realice los cálculos indicados para completar
la tabla 2.
5. Realice una gráfica de concentración de enzima versus actividad enzimática (micromoles de H2O
descompuestas/min/mL de enzima).
6. A partir de esta gráfica determine cuál es el volumen de enzima óptimo. Este será el valor de volumen de
enzima que se emplea a lo largo de la práctica.

Nota: Se recomienda que realice medidas tubo por tubo, es decir solo debe empezar con el siguiente tubo cuando
la titulación del tubo anterior.
Tenga en cuenta: preparar los tubos del A al G con los reactivos: buffer fosfato y H2O2 en buffer
(cantidades indicadas respectivamente); cuando los tenga listo en ese momento preparar la enzima y
agregarla por ej. Tubo A esperar tiempo y agregar H2SO4 y titular enseguida. Así mismo para los demás
tubos (solo se agrega la enzima, tiempo y ácido en el tubo que se va a titular de inmediato)

Tabla 1. Evaluación del efecto de la concentración de enzima

Reactivo (mL) Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E Tubo F Tubo G

Buffer fosfato 10,2 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5

Enzima 0,3 0,5 1 1,5 2 2,5 3,0
H2O2 en buffer 2 2 2 2 2 2 2
Tiempo (min) 1 1 1 1 1 1 1
H2SO4 6N 2 2 2 2 2 2 2
Vol KMnO4 gastado
mol H2O2 iniciales
mol H2O2 residuales
mol H2O2 descompuestas
mol H2O2 descompuestas/ min/mL de
enzima

5.2.2 Determinación del tiempo óptimo de reacción

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Rotule adecuadamente los tubos de ensayo

Siga el esquema de trabajo mostrado en la tabla 2, adicionando los reactivos en cada tubo de acuerdo al orden
propuesto. MEZCLE MUY BIEN
Espere el tiempo indicado para añadir el ácido (en este caso varía según el tubo). MEZCLE MUY BIEN
TITULACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE PERMANGANATO
Para la titulación debe transferir el contenido de cada tubo a un Erlenmeyer debidamente rotulado (utilice uno
para cada tubo)
Agregue gota a gota el permanganato de potasio de la bureta al Erlenmeyer para titular el peróxido de hidrogeno
remanente hasta el punto final.
El punto final de la titulación se alcanza cuando aparezca un color rosado permanente (30s).
Registre el volumen utilizado d KMnO4 para cada tubo y realice los cálculos indicados para completar la tabla 2.
Realice una gráfica de tiempo de reacción versus actividad enzimática (micromoles de H2O2
descompuestas/min/mL de enzima).
A partir de esta gráfica determine cuál es el tiempo de reacción óptimo. Este será el tiempo que se empezara a
lo largo de la próxima práctica.
Nota: Se recomienda que se realice medidas tubo por tubo, es decir solo debe empezar con el siguiente tubo
cuando ya haya terminado el análisis completo anterior.
Tabla 2. Evaluación del tiempo de reacción
Reactivo (mL) Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E
Buffer fosfato 10 10 10 10 10
H2O2 en buffer 2 2 2 2 2
Enzima 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Tiempo (min) 0 1 2 4 6
H2SO4 6N 2 2 2 2 2
Vol KMnO4 gastado
mol H2O2 iniciales
mol H2O2 residuales
mol H2O2 descompuestas
mol H2O2 descompuestas/
min/mL de enzima

7. RESULTADOS
Serán entregados, de la forma en que el docente expuso la metodología de presentación de informes de
laboratorio.

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8. CUESTIONARIO PARA EL INFORME

Diseñe un protocolo de laboratorio que le permitan determinar los siguientes parámetros para la catalasa: a.
Temperatura b. pH óptimo, c. Constante de Michaelis (Km) y velocidad máxima (Vmax), d. Efecto de un inhibidor
sobre la actividad enzimática.
9. BIBLIOGRAFÍA
Kimbrough, D.R.; Magoun, M.A.; Langfur M.A Laboratory Experiment Investigating Differente Aspects of catalase
Activity in an Inquiry- Based Approach, J. Chem. Educ. 1997, 74 (2), 210.

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