GUÍA RÁPIDA DE BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Área de Biología Molecular

Guatemala 2021

Ensayo SARS-CoV-2, PCR Directo.

Instrumentos y reactivos provistos por ATP DIAGNÓSTICA S.A.

EL PROPOSITO DE LA SIGUIENTE GUÍA ES SERVIR COMO DOCUMENTO DE CONSULTA BÁSICA PARA

OPERACIONES DE RUTINA CON EL ENSAYO ALLPLEX SARS-COV-2, BUSCANDO ALCANZAR LOS
SIGUIENTES OBJETIVOS.
Lograr un desempeño seguro de los experimentos de biología molecular según la configuración del
laboratorio, los reactivos e instrumentos y el equipamiento auxiliar.
Prevenir al máximo la contaminación, reduciendo pérdidas de tiempo y recursos.
Prevenir la degradación del RNA/DNA durante el trabajo rutinario, garantizando la entrega de
resultados confiables y oportunos a los beneficiarios del seguro social.
Garantizar la seguridad del personal a cargo de los ensayos mediante las medidas de bioseguridad y el
suministro del equipo de protección personal necesario.

SOPORTE Y SERVICIO
ATP Diagnóstica S.A., teléfono 2333-7645
Lic. Omar E. Lémus, celular 5515-5108
omar.lemus@atpdiagnostica.com

Lic. Estuardo Velasquez, celular 3761-4037

estuardo.velasquez@atpdiagnostica.com

Ing. Emerson Sánchez, celular 5631-4651

emerson.sanchez@atpdiagnostica.com

Ing. Marco Alejandro Vasquez, celular 3760-2842

marco.vasquez@atpdiagnostica.com

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ATP DIAGNOSTICA S.A. Guatemala 2020.
 Proceso Tiempo aproximado

Descongelar el kit de PCR (1 hora de anticipación)

Limpieza de la cabina de bioseguridad y áreas de 10-15 min.
trabajo de PCR: Cloro – Etanol – luz UV

Verificación de muestras y elaboración de lista de 5-10 min

trabajo de pacientes

Pretratamiento de muestras para Extracción Cruda 15-25 min

Extracción Cruda 10 min

Preparación de MasterMix 10 – 20 min

Carga de la lista de trabajo

CFX 96 – Procesamiento del PCR Tiempo Real 1:50hrs

Lectura e interpretación en el software 10 min

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PCR DIRECTO – EXTRACCIÓN CRUDA
1. Descongele los reactivos de la MasterMix desde el inicio del trabajo de extracción, llevándolos a la refrigeradora.
2. Encienda el Termociclador CFX-96 y su computadora (en cualquier orden).

PROCESO EN EL CFX 96
Dar doble click en el software CFX MANAGER DX.
No utilizar el Startup Wizard - cerrar con la “X”.
Dar click en File, luego Open - protocol,
seleccionar el protocolo EXT CRUDA.

Confirmar los ciclos del Protocolo en:

98°C 3 min
4°C 5 min
Aceptar con OK

PREPARACIÓN DEL PROCESO DE MUESTRAS

1. Prepare tiras de pozos suficientes para el número de muestras.
2. En la cabina de PCR agregue 45uL de agua libre de Rnasas a cada pozo.
3. En la campana de bioseguridad agite los tubos VPM de cada hisopado, abra un tubo a la vez, inclínelo y aspire
15uL del medio de transporte con una punta nueva.
4. Sirva los 15uL de cada muestra en cada pozo de PCR haciendo resuspension con la pipeta.

45uL de agua libre de Rnasas 15uL de cada muestra con puntas

Se puede usar la misma punta nuevas. Los controles no
necesitan éste pretratamiento

4. Cambie la punta entre cada muestra servida.

5. Al terminar la última muestra, tape los pozos y lleve todo el soporte y los pozos al termociclador CFX96.
6. Presione OPEN LID, cargue los pozos, presione CLOSE LID y dar inicio al protocolo EXT CRUDA.

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En la ventana Run Setup presionar “Next”.
Al cerrar el CFX96, ir al software y dar clic en START RUN.
Aparecerá una advertencia porque el protocolo no tiene etapa de lectura. Dar aceptar y seguir el proceso.
El Termociclador dará un pitido al terminar el proceso.
Mientras la corrida de Extracción Cruda se produce, debemos preparar la Master Mix en la cabina de PCR.

PREPARACIÓN DE LA MASTER MIX

1. Con guantes nuevos, prepare un vial Ependorff libre de Dnasas.
CUIDADO CON EL
2. Calcule cuánto volumen debe preparar de la MasterMix según el número de muestras. USO CORRECTO
3. Dispense los volúmenes calculados de SARS2 MOM + EM8 + Rnase free Water + RP-V IC2 DEL PRIMER Y
en un vial de microcentrífuga de 1.5mL. SEGUNDO TOPE
4. Tape y agite el vial de la MasterMix con vórtex, centrifugue por 30 segundos y devuelva a la
campana de PCR.
5. Limpie sus guantes con etanol, prepare y rotule una o varias tiras de 8 pozos sin tocar el
interior de los pozos o las zonas de cubierta interna de las tapaderas.
6. Transfiera 15uL de la MasterMix al interior de los pozos, utilizando la misma punta o
cambiándola si fuera necesario.
7. Transfiera 5uL de las muestras provenientes de la extracción cruda (además un pozo para el
control positivo y el control negativo) al interior de cada pozo, utilizando una punta de
pipeta nueva entre cada muestra. Puede resuspender los 5uL de muestra con los 15uL de
MasterMix en cada dispensado. Cambie la punta entre cada paciente!!!
8. Cierre los pozos asegurándose de que estén completamente en su sitio y llévelos al CFX-96.

Por cada muestra (pacientes + controles):

5uL de SARS-2 MOM
5uL de Buffer EM8
4uL de Rnase-free Water
1mL de RP-V IC2 (control interno)

Transferir 15uL de la Master Mix a

cada pozo de la tira nueva

Luego transferir 5 uL de cada muestra de la

Extracción Cruda, control negativo y control
positivo a cada pozo de la nueva tira

Control Positivo Control Negativo

Nueva tira de pozos para el RT-PCR

Tape y lleve los pozos con MasterMix y

muestras al termociclador….

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PROCESO EN EL CFX 96
En el software CFX MANAGER DX cerrar la ventana de la
extracción cruda.
Dar click en File, luego Open - Protocol,
y dar doble click al protocolo SARS COV 2.prcl

Confirmar que los tiempos y temperaturas

coinciden con el inserto.

Luego dar click en Plate.

Paso Ciclos Temperatura Duración

1 1 50°C 20 min

2 1 95°C 15 min

3 1 95°C 10 seg
1 60°C 15 seg
4
Etapa de lectura
1 72°C 10 seg
5
Etapa de lectura
6 GOTO 3. 44 ciclos más.

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 En la ventana PLATE, dar click en Create New.
Se abre la ventana PLATE EDITOR. En dicha seleccionar los pozos (columnas) donde los
pacientes y controles están colocados.

Identificar las muestras en SAMPLE TYPE:

Unknown

Marque los fluorocromos:

FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670

(Todos los pozos marcados deben mostrar los

cuatro fluorocromos)

Identificación de Muestras:
Clic en cada posición de la placa.
Clic en el campo Sample Name.
Teclear o escanear el ID de la muestra + Enter.

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IDENTIFICACIÓN DE CONTROLES
Dar clic en la posición del Control Negativo
según su ubicación en la placa.

Luego dar clic en Sample Type e identificar

como: Negative Control

Repetir dando clic en la posición del Control

Positivo.

Clic en Sample Type e identificar como:

Positive Control

Identificación de Muestras:
Clic en cada posición
Clic en el campo Sample Name
Teclear o escanear el ID de la muestra + Enter.

(En la siguiente página se explica otra forma de

ingreso de muestras para listas de trabajo
numerosas)

Al generar la lista de trabajo habitualmente se marcan

columnas completas.

Si se desean eliminar columnas completas o algunos pozos,

puede marcarlos en la pantalla y omitirlos presionando el
botón Clear Wells.

En la siguiente página se muestra otro método de ingreso de la lista de trabajo, ideal para cuando el
laboratorio dispone de códigos de barras para la ID de muestras.

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 IDENTIFICACIÓN DE MUESTRAS NUMEROSAS

Clic en la función Spreadsheet View/Importer

Doble clic en el campo Column
Verificar que las columnas tengan datos A1, B1, C1, etc.

Clic en el primer campo Sample Name, escanear el código

de barras de las muestras
Presionar la flecha hacia abajo y continuar con las siguientes
muestras.

Guardar la lista de trabajo con OK.

Guardar el archivo de la placa, el software solicitará un
nombre, puede ingresar la fecha e iniciales de usuario y
guardar con OK.

De la ventana PLATE presione la opción Next. Cargue la Placa de PCR o los pozos al CFX96.

Presione START RUN.

El software pide guardar el nombre de la corrida.

Sugerencia: dejar los datos asignados por el
software y agregar las iniciales del usuario.

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Al terminar el ensayo, ir a Export – Seegene Export

Para la exportación, elija una ubicación de la capeta Documentos.

Puede crear una Nueva Carpeta y asignar un nombre sencillo como: PCR Directo Abril 2021

Dar click en OK. El software generará automáticamente carpetas QuantStep4 y QuantStep 5.

Repita la exportación y dar OK.

A CONTINUACIÓN ES IMPORTANTE NO CERRAR ÉSTAS VENTANAS DEL CFX MANAGER !!

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Minimizar el software CFX Manager. Dar doble click en el programa SARS-CoV-2 Viewer, dar OK al
mensaje de advertencia y luego ir a la opción: Archivo - Abrir y dar click en Open para abrir el archivo de
la lectura anteriormente guardada en la carpeta QuantStep4.

SARS-CoV-2 Viewer

Allplex SARS-CoV-2 Assay

Ubicar el archivo exportado en la etapa previa:

Documentos – Resultados [mes/año] y QuantStep4
Después de abrir el archivo, verificar que se esté
analizando en Allplex SARS-CoV-2 Assay (extraction free)
en la ventana Product.

REGLAS DE VALIDACIÓN DE RESULTADOS

Haber guardado el archivo desde el paso anterior con la opción No
Baseline Substraction antes de hacer Seegene Export.

Verificar los resultados de cada pocillo, verificando que el control

interno (IC) esté válido en todas las muestras.

Observar los colores en la placa, verificando el resultado como

negativo, positivo o inválido.

Comprobar que el control positivo sea detectable para los 3 genes y

el Control Interno.

Comprobar que el control negativo no tenga ninguna señal. No

obstante si debe tener fluorescencia del Control Interno (HEX).

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REGLAS DE VALIDACIÓN DE RESULTADOS

Gen E positivo: Presuntivo Positivo para SARS-COV-2.

Cualquiera de los otros genes positivos: Positivo para SARS-CoV-2
Ausencia de fluorescencias en FAM, CALRED610 y QUASAR670, pero presencia del control interno en HEX: Negativo.

No se consideran válidas las curvas con C(t) superiores al ciclo 40.

Se recomienda tomar nueva muestra en pacientes con C(t) muy cercano a 40 (por ejemplo 38.5-39.99) pues dichos
valores son demasiado cercanos al punto de corte de resultados negativos. Puede tratarse de pacientes que ya cursaron
la infección y están depurando su sistema respiratorio de partículas virales no infectivas.

Si desea imprimir, dar click en el cuadrito de la izquierda de los

resultados y seleccione:
Archivo – Imprimir.

Puede eliminar la impresión de la “portada” del reporte.

Indique la impresora predeterminada y OK.

AL FINAL DE LA RUTINA DE TRABAJO

Abra el equipo y descarte las tiras de PCR. Cierre el equipo con el botón, nunca con las manos.
Cierre el software SARS-COV-2 y el software CFX96 MANAGER.
Apague el termociclador con el botón trasero.
Realice limpiezas generales según necesidad (ver Guía de Descontaminación).
Verifique que no haya quedado reactivo sin refrigerar/congelar.
Realice todas las tareas administrativas.
Asegúrese que ningún reactivo de PCR quede a temperatura ambiente o en refrigeración.
Todos los reactivos de PCR se guardan a temperaturas inferiores a -20°C.

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