Determinación de absorbancia de cafeína por UV-VIS

Introducción

¿Qué es la cafeína? La cafeína es un compuesto químico (un alcaloide del grupo de

las xantinas concretamente pertenece a la familia de las metilxantinas), que actúa
como estimulante y psicoactivo. Se encuentra de forma natural en algunos vegetales
como los granos de cacao y café, las hojas de té (teína), las bayas de guaraná
(guaranina) y mate (mateína). También se añade a gran una variedad de alimentos
como pasteles, helados, dulces, bebidas energéticas y bebidas de cola. Se encuentra,
asimismo, en combinación con la P-sinefrina en una serie de suplementos alimenticios
que se comercializan con fines adelgazantes y para mejorar el rendimiento deportivo.
Algunos medicamentos y cosméticos contienen también cafeína. Según las encuestas
cubiertas por la base de datos de consumo de alimentos de la EFSA el café constituye
la fuente más importante de cafeína de los adultos, y representa entre el 40 % y el 94
% de la ingesta total. En Irlanda y en el Reino Unido, el té es la fuente principal, y
representa el 59 % y el 57 % respectivamente de la ingesta total de cafeína. En la
mayoría de los países, el chocolate y las bebidas de cacao es la fuente predominante
de cafeína en niños de entre 3 y 10 años, seguida del té y las bebidas de cola.

Entonces, la determinación de cafeína ha adquirido mucha importancia, debido a su

uso en la industria farmacéutica y en la industria de alimentos. En todos estos casos,
el control de calidad del parámetro cafeína es necesario en los productos que la
contienen. Por esta razón, resulta importante el desarrollo de métodos instrumentales
para su determinación en diversas matrices.

En esta práctica de laboratorio vamos a describir un sistema de extracción de la

cafeína, empleando las técnicas de extracción sólido-líquido y líquido-líquido, y su
posterior cuantificación mediante métodos espectrofotométricos. Para facilitar el
aprendizaje se desarrollará y resolverá un supuesto práctico aplicado en granos de
café, hojas de té y cacao en polvo.

La cafeína pertenece al grupo de sustancias llamadas alcaloides. Se produce en

plantas como el café y el té a partir de la adenosina, que se encuentra en el ADN y el
 ARN. La cafeína se acumula en dos sistemas de anillos. Estos sistemas de anillos,
denominados purinas, se construyen a partir de una pirimidina (anillo de 6 miembros)
y un anillo de imidazol (anillo de 5 miembros). Las purinas son compuestos aromáticos
heterocíclicos. La cafeína está formada por dos grupos carbonilo y cuatro aminas
terciarias. Incluye además un grupo amida, que es un grupo funcional compuesto por
un grupo carbonilo unido a un átomo de C y un átomo de N, y un alqueno, un
hidrocarburo insaturado que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

Objetivos

Con este objeto de aprendizaje se persigue que los alumnos sean capaces de:

• Aplicar la espectroscopía UV-Visible para determinar el contenido en cafeína de las

muestras.
• Calcular la absorbancia de cafeína a partir de los datos obtenidos con el
espectrofotómetro.
• Calcular épsilon experimental.
• Determinar máxima absorbancia, límite mínimo y límite máximo.
• Graficar absorbancia vs longitud de onda.

Fundamento

La Espectroscopia UV-Visible permite analizar y cuantificar sustancias en diversas

aplicaciones científicas y tecnológicas:

Principio de la espectroscopia UV-Visible

La espectroscopia UV-Visible se basa en la absorción o transmisión de luz ultravioleta

y visible por sustancias.
 • Cuando una muestra interactúa con la luz UV o visible, ciertas moléculas
absorben fotones de energía específica.
• La cantidad de luz absorbida está relacionada con la concentración de la
sustancia en la muestra.

Instrumentación

Para realizar espectroscopia UV-Visible, se utiliza un espectrofotómetro UV-Visible.

• El espectrofotómetro emite luz de diferentes longitudes de onda (UV y visible)

a la muestra y mide la cantidad de luz absorbida.
• El resultado se representa como un espectro de absorción, que muestra las
bandas de absorción características de la sustancia analizada.

El control de calidad del parámetro de cafeína es necesario en los productos que la

contienen. Por esta razón, resulta importante el desarrollo de métodos instrumentales
para su determinación en diversas matrices, especialmente en alimentos. La
espectroscopia UV-Visible se usa entonces para determinar la cantidad de cafeína en
alimentos y productos, y así asegurar su calidad.

Material y equipo

Muestras estándar de cafeína (20 ml/L, 30 ml/L, 40 ml/L, 50 ml/L y 60 ml/L)

Pipeta automática

Espectrofotómetro uv-vis

Celdas especiales

Software de gráficos
Validación de Métodos

1) Linealidad

La linealidad indica la capacidad del método para mostrar resultados directamente

proporcionales a la concentración de cafeína del medio a analizar.

El intervalo de concentraciones es el intervalo definido por los niveles inferior y

superior de analito, para el que se demuestra que el procedimiento es adecuado con
la precisión, exactitud y linealidad declarada en el procedimiento descrito.

Para comprobar la linealidad, a partir de la disolución patrón se prepararon

disoluciones de cafeína descritas en la metodología y se procedió a su posterior
análisis mediante espectrofotometría UV/VIS. Debe representarse gráficamente la
señal en función de la concentración del analito. Si se observa relación lineal ésta debe
evaluarse utilizando métodos estadísticos adecuados, como el cálculo de la recta de
regresión lineal, que incorpora los diferentes orígenes de variación que puedan afectar
a las observaciones experimentales.

Con el fin de analizar este parámetro, se plantearán las siguientes tres hipótesis nulas:

- H0: b0 = 0 La recta de calibrado pasa por el origen de coordenadas.

- H0: b1 = 0 La variable “y” (absorbancia), no depende de la variable “x”

(concentración).

- H0: D.L. = 0 No existe desviación de la linealidad y el modelo lineal es correcto.

Por lo tanto, el intervalo de concentraciones se estableció confirmando que el método

analítico presenta una linealidad, precisión y exactitud aceptables cuando se aplica a
muestras con concentración del analito dentro del intervalo especificado.
 2) Exactitud

La exactitud define la concordancia del resultado experimental a los valores esperados

y aceptados como referencia.

La exactitud del método se realiza mediante la comparación de la disolución patrón de

cafeína comparándola con las disoluciones y midiendo sus absorbancias a la longitud
de máxima absorción.

A partir de dichos datos se realizarán los cálculos pertinentes y la media resultante de

los valores.

3) Precisión

La guía ICH define la precisión como la similitud entre los resultados en una serie de
medidas tomadas de múltiples muestras de la misma disolución estándar homogénea.

Se determinó comparando los resultados de las mismas disoluciones varias veces en

un mismo día, con el fin de comprobar la precisión del método de estudio y que no
existen errores aleatorios o errores sistemáticos en el proceso.

La norma ICH establece que una desviación estándar relativa (C.V.) superior al 1%
indica que existen errores sistemáticos en el desarrollo del experimento mientras que
inferior al 1% se considera un método preciso. Para ello, a partir de la dilución patrón
de cafeína, se preparará una disolución estándar con el fin de medir la absorbancia
seis veces en las mismas condiciones de operario, reactivos y espectrofotómetro con
el fin de comprobar la variabilidad entre mediciones, analizando la precisión del
método.

4) Especificidad

La especificidad del método se traduce como la capacidad del espectrofotómetro

UV/VIS para discernir la absorbancia de la cafeína en una disolución sin interferencia
de posibles excipientes, productos de degradación o impurezas.

Aunque al usar cafeína pura en disolución no se esperaba interferencias, se

comprueba comparando la medida de un blanco, la longitud de onda de máxima
absorción de cafeína y las medidas de las distintas concentraciones estándar, que no
deben modificarse por el disolvente.

Métodos para el tratamiento estadístico de los resultados.

Cálculo de épsilon.

En espectroscopia UV- Visible, el símbolo se refiere a la absortividad molar, también

conocida como coeficiente de absorción molar. La absortividad molar es una medida
de cuan eficientemente una sustancia absorbe la radiación electromagnética a una
longitud de onda especifica.

Este valor, representado por ε, se utiliza en la ley de Beer-Lambert, que establece la

relación entre la concentración de una sustancia absorbente, la longitud del camino
óptico a través de la solución y la absorbancia medida. La relación matemática es:

A = ε *b*c

Donde:

- A es la absorbancia,

- ε es la absortividad molar

- b es la longitud del camino óptico a través de la solución (generalmente en

centímetros),

- c es la concentración de la solución (en mol/L o M).

La absortividad molar (ε) es una propiedad específica de cada sustancia y varía con la
longitud de onda de la radiación electromagnética utilizada para la medida. Es una
medida de cuán intensamente una sustancia puede absorber la luz a una longitud de
onda particular.

Sensibilidad.

Es una medida del factor de respuesta del instrumento como una función de la
concentración. En contraste con el límite de detección, la sensibilidad de un método
es la habilidad para distinguir entre concentraciones.
Para métodos donde la respuesta con respecto a la concentración es una función
lineal, la sensibilidad es constante con respecto a la concentración y es igual a la
pendiente de la curva de calibración. Contrariamente a las funciones lineales, la
sensibilidad de métodos cuando su respuesta es no-lineal cambia con la concentración
del analito

Absorbancia Max.

La absorbancia máxima en espectroscopía UV-visible se refiere al punto en el espectro

donde una sustancia absorbe luz a la mayor intensidad. Este punto corresponde a la
longitud de onda específica en la que la sustancia muestra la absorción más alta.

La posición de la absorbancia máxima varía según la naturaleza de la sustancia y de

los grupos cromóforos de su estructura molecular. Los grupos cromóforos son
estructuras que contienen enlaces π (enlaces dobles y triples) o ciertos grupos
funcionales que pueden absorber luz en la región UV-visible del espectro
electromagnético.

Por ejemplo, para algunos compuestos orgánicos, como los compuestos aromáticos,
la absorbancia máxima suele encontrarse en la región UV, mientras que, para otros
compuestos, como los complejos de metales de transición, la absorbancia máxima
puede encontrarse en la región visible.

La identificación y caracterización de la absorbancia máxima de una sustancia son

importantes en la espectroscopía UV-visible, ya que proporciona información sobre la
estructura y composición molecular de la sustancia en cuestión.

La absorbancia máxima de la cafeína se produce a 273 nm.

Límite de Detección (LOD)

Es la cantidad mínima de analito en una muestra que puede detectarse por una única
medición, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales
indicadas, expresadas habitualmente en forma de concentración de analito
(porcentajes, partes por billón) en la muestra.
Se determina mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de
analito, estableciendo el nivel mínimo que puede detectarse confiablemente. El límite
de detección se calcula mediante la fórmula:

Dónde:

α es la desviación estándar de la respuesta de la muestra

m = es la pendiente de la curva de calibración para la linealidad

Límite de cuantificación (LOQ)

Mínima cantidad del analito en una muestra que puede ser cuantitativamente
determinada con precisión y exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis
cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa
particularmente para la determinación de, impurezas y productos de degradación.

Dónde:

σ = Es la desviación estándar de la respuesta de la muestra

m = Es la pendiente de la curva de calibración para la linealidad.

Bibliografía:

[1] European Food Safety Authority (EFSA) disponible en:

http://www.efsa.europa.eu/
[2] Repetto, M., Cameán, A.M. (2006). Toxicología alimentaria, Ed. Díaz de
Santos.

[3] Shibamoto, T., Bjeldanes, L. (2009). Introduction to food toxicology, Ed.

Elsevier

[4] Sanchez, G. Ignacio. Validación de un método analítico

espectrofotométrico para la determinación de levofloxacino. Disponible en:
Validación método espectrofotométrico