G.P. Microbiologia Medica 2024-I

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA SAC
GUÍA DE PRÁCTICA
Aprobado con Resolución Decanal N° 0060-2024-FCS-UPSJB
FACULTAD
ESCUELA PROFESIONAL MEDICINA HUMANA
SEMESTRE ACADÉMICO 2024-I
CICLO IV
NOMBRE DE LA ASIGNATURA MICROBIOGIA MÉDICA
Modalidad de Estudios: PRESENCIAL
Preparando el camino…
1. DATOS GENERALES
1.1. ASIGNATURA
a. Facultad CIENCIAS DE LA SALUD

b. Escuela Profesional MEDICINA HUMANA
c. Semestre académico 2024-I
d. Nombre de la asignatura MICROBIOLOGÍA MÉDICA
e. Ciclo IV
f. Código 041201
g. Modalidad Presencial
h. Tipo de curso Obligatorio
i. Pre requisitos BASES MOLECULARES Y CELULARES DE LA MEDICINA II
j. Créditos 04
k. Horas semanales Teóricas 02 Prácticas 04 Total 06
l. Duración del semestre Inicio 11/03/2024 Culminación / /
1.2. DOCENTES:
Docente responsable por Programa de Pregrado
Sede Lima – Local Chorrillos Róger Anibal Gamboa Ruíz

Correo electrónico institucional Roger.gamboa@upsjb.edu.pe
Sede Lima – Local San Borja Roger ANIBAL Gamboa Ruiz
Correo electrónico institucional Roger.gamboa@upsjb.edu.pe
Filial Ica Héctor Arotuma Granda
Correo electrónico institucional hector.arotuma@upsjb.edu.pe
Filial Chincha Edgar Andres Valencia Rojas
Correo electrónico institucional Edgar.valencia@upsjb.edu.pe
1.3. AMBIENTES ACADÉMICOS
Sede/Filial Teoría Práctica
AULA DINÁMICA GRUPAL.

Sede Lima - Chorrillos AULA UPSJB LABORATORIO DE
ENSEÑANZA
AULA DINÁMICA GRUPAL
Sede Lima - San Borja AULA UPSJB LABORATORIO DE
ENSEÑANZA
Filial Ica AULA UPSJB LABORATORIO DE
ENSEÑANZA
Filial Chincha AULA UPSJB LABORATORIO DE
ENSEÑANZA
2. SUMILLA:
La asignatura de Microbiología Médica, es de naturaleza teórico-práctico/práctico, de carácter

obligatorio, su desarrollo es de manera presencial está articulada a la competencia General: calidad
y comprensión lectora y tiene como propósito brindar al estudiante los conocimientos sobre los
microorganismos (Bacterias, Rickettsias, Clamidias, Micoplasma, Virus y Hongos), que se
relacionan con el cuerpo humano y la Salud Pública, asimismo imparte bases modernas sobre la
profilaxis y biología avanzadas, con énfasis en la proyección a la comunidad
La asignatura se desarrolla en dieciséis semanas y cuenta con tres unidades didácticas. Se inicia
con el desarrollo de la Primera Unidad: Principios básicos de la Microbiología Médica; en la Segunda
Unidad: Estudio Sistemático de Bacterias que producen enfermedades infecto-contagiosas de
importancia en la salud humana y en la Tercera Unidad: Estudio sistemático de bacterias con
características especiales, virus, hongos y priones causante de enfermedades infectocontagiosas
de importancia en la salud humana
3. INTRODUCCIÓN
En el ámbito de la salud y la medicina, la microbiología resulta de gran importancia puesto que es la
que se encarga de estudiar los microorganismos patógenos como los hongos, virus, parásitos y
bacterias que pueden generar alguna enfermedad en el ser humano.
A partir de la microbiología se estudian las enfermedades infecciosas que padece cualquier paciente
y gracias a ella se logra determinar cuál es el tratamiento más adecuado para cada enfermedad y
paciente.
Sin duda que las repercusiones que se desprenden de la Microbiología, en cuanto a la vida cotidiana
y la cantidad de aspectos que se enmarcan en ella misma, es el factor más importante de esta ciencia.
Debido a que no hay límite alguno que se excluya en lo referente a la ciencia de la salud.
4. DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES APRENDIZAJE

(LRPD-Resultados que pueden denominarse: logros, productos, desempeños)
4.1. Producto formativo de la asignatura
LRPD Artículo de revisión de un microorganismo
4.2. Producto formativo de las unidades

Unidad Producto Formativo
Informe de la revisión bibliográfica de cinco artículos científicos relacionados con
I. alguna patología ocasionada por un microorganismo
Estructura el artículo científico, indicando el problema a abordar y el control del
II. mismo
Artículo de revisión de una patología ocasionada por un microorganismo,
III. presentación y exposición del poster. Entrega final
4.3. Producto formativo de las prácticas de laboratorio
Semana Práctica Producto Formativo

Bioseguridad.
Microscopía
1 1 Coloraciones simples
Coloraciones diferenciales
Coloraciones especiales
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales,
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento.
2 2
Metabolismo bacteriano
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma)
3 3 Toxinas bacterianas
Semana Práctica Producto Formativo
Aislamiento e identificación de cocos gram positivos: género
Staphylococcus
Aislamiento e identificación de cocos gram positivos: género
4 4
Streptococcus
Aislamiento e identificación de cocos gram negativos: genero
Neisseria
Aislamiento e identificación de bacilos gram positivos: género
Bacillus
5 5 Aislamiento e identificación de bacilos gram positivos: género listeria
Aislamiento e identificación de bacilos gram positivos: género
Corynebacterium
6 6 Aislamiento e identificación de Clostridium
Aislamiento e identificación de bacilos ácido - alcohol- resistentes
7 7 genero Mycobacterium.
Aislamiento e identificación de Enterobacterias: coprocultivo
8 EXAMEN PARCIAL
Aislamiento e identificación de bacilos gram negativos: genero
9 8 Pseudomonas
Estudio e identificación de Vibrio cholerae
10 9 Estudio e identificación de Haemophilus
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: urocultivo estudio e
11 10 identificación de treponema – prueba de VDRL ó RPR.
estudio e identificación del género Leptospira
12 11 Aislamiento de virus en huevos embrionados
13 12 Diagnóstico de covid-19
14 13 Diagnóstico de la rabia
Estudio e identificación de hongos ambientales
estudio e identificación de hongos dermatofitos
15 14 estudio de hongos levaduriformes. observación de cortes
histopatológicos.
Estudio de hongos dimórficos. observación de cortes histopatológicos
16 EXAMEN FINAL
5. SISTEMA DE EVALUACION
Normada por el Reglamento de Actividades Académicas de la Universidad Privada San Juan Bautista
vigente y la Directiva del Sistema de Gestión de la Evaluación para Pregrado y Posgrado vigente.
La Nota Promedio por asignatura es igual a: La evaluación del aprendizaje es integral, continua,
acumulativa, obligatoria pertinente, valorativa y flexible. Se adecua a las condiciones y circunstancias
especificadas de la realidad de los estudiantes y del currículo de la carrera.
La evaluación de las actividades conceptuales, procedimentales y actitudinales está con relación a las
competencias, capacidades, actitudes que el estudiante debe lograr al concluir la asignatura.
El Promedio Final de la asignatura se calcula de la siguiente forma:
PF = Promedio Final
EP = Examen Parcial
EF = Examen Final
PC= Prácticas Calificadas, estas pueden darse mediante: talleres, tareas académicas, trabajos
aplicativos, etc. (considerar asistencia y puntualidad)
6. BIBLIOGRAFÍA
6.1 Bibliografía Básica:

1. Jawetz, Ernest, (2020) Microbiología Médica, Edit. McGraw-Hill, Ed. 28. Código
QW/4/J27/2020
2. Murray, Patrick R, (2021) Microbiología Médica, Edit. Elsevier, Ed. 9, Código
QW/4/M97/2021
6.2 Bibliografía Complementaria:

1. Luna Fontalvo, Jorge Alberto, (2020) Métodos analíticos de microbiología general y aplicada,
Editorial Unimagdalena; Ed.1. ELIBRO.
2. https://elibro.net/es/ereader/upsjb/128443?page=14
3. Struthres, Keith; (2018) Microbiología Clínica; Edit. Manuel Moderno; Ed. 1. ELIBRO.
https://elibro.net/es/ereader/upsjb/39793?page=1
4. Biblioteca Virtual – www.Upsjb.Edu.Pe
6.3 Base de Datos:

1. Intranet UPSJB.
2. Plataforma Upto Date https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
3. Plataforma Turnitin
4. EBSCO-Host https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
5. Scopus https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
7. GUÍAS PRÁCTICAS:
7.1 SEMANAS:
GUIA PRÁCTICA Nº 01 SEMANA 01

BIOSEGURIDAD
OBJETIVO Difusión y socialización del protocolo de bioseguridad vigente.
Conocer las medidas de bioseguridad necesarias que se debe cumplir en el

laboratorio para disminuir el riesgo biológico.
LOGRO A MEDIR Familiarizar al alumno con el uso correcto, de las medidas de barreras
necesarias para trabajar en bioseguridad.
a) MARCO TEÓRICO:
La seguridad en el laboratorio se puede definir como: “La situación carente de riesgo o con un riesgo
limitado, que resulta del cumplimiento de un conjunto de normas y prácticas para lograr este fin”
1.Medidas generales de seguridad Barrera La seguridad como prevenciónviene definida por una
serie de barreras. Si estas fallan y ocurre unaccidente, es preciso efectuar un tratamiento precoz
y adecuado paraevitar un daño mayor y posteriormente hacer un diagnóstico del fallo. Las barreras
se rompen por fallos humanos y/o errores mecánicos.
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: - Contenedores, equipo
e instrumental correcto y “buena práctica” (la técnica de trabajo ordenada v rigurosa es probablemente
la mejor protección que existe) – Uso de desinfectantes y cabinas de seguridad.
Barreras secundarias: Localizadas en el círculo del operador, incluirán:

1. La higiene personal rigurosa.
2. La vacunación
3. Programas de salud laboral.
4. Vestimenta: uso de ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
5. No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
6. No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugación, la sedimentación o el derrame
de cultivos líquidos.
7. Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lápiz a la boca.
8. No sufrir inoculación percutánea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
9. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos.
10. No colocarse o quitarse lentes de contacto.
11. No pipetear con la boca.
12. Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros patógenos
transportados por la sangre.
13. Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la infección.
En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al agua.
14. Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
15. Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de laboratorio
puedan repercutir en la comunidad.
16. Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
17. Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
18. Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para desechos
contaminados.
19. Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ESTERILIZACIÓN Existen muchos agentes químicos o

físicos para eliminar los microorganismos podemos distinguirtres grupos:
1. Agentes antisépticos: son germicidas químicos para la utilización en la piel como, por ejemplo;
alcohol, iodóforos, etc.
2. Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos en superficies einstrumentos, como, por

ejemplo: soluciones fenólicas al 3 o 5%, hipocloritos
3. Agentes esterilizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
4. Eliminación de residuos peligrosos: Todos los materiales contaminados son agentes
potencialmente infecciosos que deben ser descontaminados antes de su eliminación. Esto implica
porciones no utilizadas de las muestras de los pacientes, cultivos de las muestras cultivos
almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo, escalpelos y jeringas
con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante autoclave, incinerador o
cualquiera de los diversos métodos alternativos de tratamiento de residuos.
b) MATERIAL DIDÁCTICO:
1. Protocolo de Bioseguridad vigente.
2. Contenedores de descarte de punzocortante.
3. Guantes, gorros, mandilones, lentes
4. Autoclave (visita al laboratorio donde está el equipo)
c) ACTIVIDADES:
En la práctica observar todos riesgos que puede haber en el laboratorio y diseñar y esquematizar para
realizar un video de medida de bioseguridad.
d) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:
La práctica se desarrolla de forma grupal y de acuerdo con la metodología de la asignatura.
e) INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN:
Desarrollo de preguntas cuestionario:

1. Definición de Bioseguridad.
2. Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y terciarias.
3. ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización? (ejemplo de c/u).
4. Mencione los cuatro niveles de laboratorio de bioseguridad, justifique por qué está clasificado
en estos niveles
5. Video de máximo tres minutos: (algunas medidas de bioseguridad).
f) RESULTADOS ESPERADOS:
Que el alumno conozca y se familiarice con las medidas correctas de bioseguridad.

MICROSCOPÍA
OBJETIVO Identificar las partes del microscopio para un correcto manejo del instrumento
Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del

LOGRO A MEDIR microscopio compuesto.
Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del
microscopio.
a) MARCO TEÓRICO:
El microscopio es un instrumento que permite magnificar o ampliar imágenes de un objeto como

muestras biológicas in vivo, coloreadas u otro material de estudio cuando se observa a través de las
lentes, permite aumentar el tamaño y dar una mejor resolución.
Otros tipos de microscopios:
Microscopio de Contraste de Fases.

Su sistema está compuesto por lente ocular, anillo de fases, lente del objetivo, lente del condensador
y diafragma anular. Tiene una amplificación de 1,000 a 2,000 nm. Permite observar estructuras que no
requiere de una tinción.
Microscopio de Fluorescencia.
Se compone de un primer filtro de corte o filtro de excitación, espejo dicroico, segundo filtro de corte o
filtro de emisión, fuente de iluminación y condensador. Se observan muestras teñidas,
inmunofluorescencia directa o indirecta.
Microscopio de Interferencia.
Es un instrumento que permite la medida de la masa de regiones pequeñas y transparentes de células
vivas, obteniéndose datos de tipo cualitativo y cuantitativo. Sus componentes son, un analizador
rotable, un cuarto de longitud de onda, objetivo de interferencia, condensador, polarizador y filtro de
interferencia.
Microscopio Electrónico de Barrido.

Está compuesto por un cañón de electrones (ánodo, cátodo y electroimán), sistema de
barrido y de lentes. Su resolución depende de la cantidad de electrones emitidos, contando así con un
límite de resolución. Tiene una amplificación de 100,000 a 200,000 veces y una alta resolución en 3D.
Microscopio Electrónico de Transmisión.

Está compuesto por cañón electrónico, lente condensadora, cámara de muestra, lente objetiva, lente
intermedia, proyector, pantalla fluorescente y cámara (placa fotográfica).
Utiliza electrones con una longitud de onda de 0.5 Å. Proporciona un aumento de las células de 100,000
veces aproximadamente.
FUNCIÓN DEL ACEITE DE INMERSIÓN: Se coloca sobre la laminilla cubre objeto. Se usa con el
objetivo de inmersión y éste debe tener el mismo índice de refracción. Al colocarse el aceite sobre la
laminilla se evita que los rayos de luz cuando pasan de éste al aceite se dispersen antes de llegar al
objetivo permitiendo que penetre de esta manera un gran cono de luz.
PARTES DEL MICROSCOPIO:
Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio
PARTE MECÁNICA:
• Tubo porta lentes y cremallera
• Condensador
• Tornillos macro y micrométrico
• Brazo y Pie
• Revolver
• Charnela
PARTE ÓPTICA:
• Ocular
• Lentes de condensador
• Objetivos
• Diafragma
• Espejo
SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO:
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revólver yla platina.
2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x, 15 x, y losobjetivos de 4x, 10x,
20x, 40x, y 100x.
b) MATERIALES:
• Microscopio Binocular
• Microscopio Estereoscópico
• Láminas portaobjeto.
• Laminillas cubreobjeto
• Laminas con muestra coloreadas
• Aceite de inmersión
• Alcohol Isopropílico
• Algodón
c) ACTIVIDADES
Realizar los dibujos de los materiales observados en el microscopio.
d) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
La práctica se desarrolla de forma grupal.

Reconocimiento de las partes del microscopio y con los materiales hacer uso del microscopio.

1. ¿Cuántos tipos de microscopios hay y cuáles son?
2. Esquematiza los tipos de microscopios.
3. Mencione las unidades de medidas de microscopios que existen.
4. ¿Cuándo se utiliza el aceite de inmersión?
f) RESULTADOS ESPERADOS
El alumno identifica las partes del microscopio compuesto y realiza con destreza el manejo de este
instrumento.
MÉTODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES
Conocer, adquirir la destreza de teñir e interpretar los resultados como parte de

OBJETIVO
un diagnóstico.
Realizar coloraciones: simples, diferenciales y especiales.
Diferenciar qué tipos de muestras se utilizan para cada coloración.
LOGRO A MEDIR
Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en las distintas
coloraciones y discernir si la coloración fue bien realizada.
a) MARCO TEÓRICO:
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:
• Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes ácidos
Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
• Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruroazul de metileno.
• Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina (ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno,
cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:
1) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
2) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl - Neelsen.
3) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora), Albert,
etc.
b) Material didáctico:
• Muestra con mezcla bacteriana

• Láminas portaobjetos
• Asa bacteriológica de Kolle en aro
• Colorante Azul de metileno
• Colorante Tinta China
• Colorante Azul de lactofenol
• Mechero de Bunsen
• Varillas para coloración
• Alcohol isopropílico
• Papel lente
• Algodón
• Cabina de flujo laminar
• Solución salina estéril
c) ACTIVIDADES:
Esquematice un flujo grama de lo realizado en prácticas.
d) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:
1. Realización de la extensión:
a) Producto líquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del

producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa deplatino o una pipeta de modo que
la extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede ser diluido antes
ligeramente.
b) Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua o solución salina
estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener un frotis fino
y homogéneo.
c) Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar sobre el primer tercio
de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequeña gotita de sangre. Hacer contactar con
la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinará 45 °C. La sangre alcanza
por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia la parte libre del primer
portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un solo movimiento, sin detener
ni volver atrás.
d) Órganos: seccionar un pequeño fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo seccionado
sobre un papel secante, haciendo seguidamente con esta porción una extensión o una serie
de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se obtengan preparaciones finas.
2. Secado:
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con un
mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
3. Fijación:
Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas coloraciones especiales
no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de esta es hacer adherir el frotis al portaobjetos
y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de las proteínas.
Puede ser por:
• Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas gotas
de alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor posible
e inflamar después el alcohol restante.
• Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte inferior
de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe rechazarse para
los productos patológicos puesto que altera la morfología de los elementos celulares.
• Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar
Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar cubreobjetos.
Depositar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. Descender primero el objetivo de 10x, una
vez enfocado pasar al lente de 100x sumergiéndolo en la gota, comprobar el enfoque microscópico con
el tornillo micrométrico.
EXAMEN DE LAS PREPARACIONES TEÑIDAS
A. Coloraciones simples:
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
1. Coloración azul de metileno:

a) Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor
b) Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos
c) Lavar con agua y dejar secar
d) Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro
Resultado: Los microorganismos se observan de color azul intenso.
2. Coloración de tinta china o negativa:

a) Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
b) Agregar una gota de la mezcla bacteriana
c) Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjetos
d) Observar con lente de menor y mayor aumento.
Resultado: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus neoformans
3. Coloración azul de lactofenol:
a) Colocar una gota del colorante sobre la lámina portaobjetos
b) Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
c) Cubrir con una laminilla cubreobjeto
d) Observar con lente de menor y mayor aumento
Resultado: Los microorganismos se observarán en un fondo azul – celeste

Protocolo: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados.
1. ¿Qué microorganismos se puede colorear con azul de metileno?
2. ¿Por qué la tinta china se denomina tinta negativa?
3. ¿Qué microorganismo pueden ser teñidos con la coloración azul de lactofenol?
4. ¿La tinta china es útil para el diagnóstico de que microorganismo y que muestra biológica se debe
tomar?
f) RESULTADOS ESPERADOS:
Que el alumno conozca, adquiera destreza en el manejo de las coloraciones realizadas en práctica e
interprete los resultados como ´parte de un diagnóstico.
COLORACIÓN DIFERENCIAL: COLORACIÓN DE GRAM Y DE ZIEHL-NEELSEN
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados
como parte de un diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Diferenciar qué tipos de muestras se utilizan en las coloraciones
diferenciales.
Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en las
distintas coloraciones y discernir si la coloración fue bien realizada.
a. MARCO TEÓRICO
Coloraciones diferenciales:
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de
Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente.
1.- Coloración de Gram

Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas
la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del Gram,
una de ellas es la de Kopeloff.
b. MATERIAL DIDÁCTICO
• Cepa bacteriana Gram positiva
• Cepa bacteriana Gram negativa
• Solución fisiológica al 0.85%
• Pipetas pauster de plástico
• Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff: Violeta de genciana o Cristal violeta
(colorante primario) Bicarbonato de sodio Lugol (mordiente) Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina básica (colorante de contraste)
• Mechero de Bunsen
• Papel lente
• Algodón
c. ACTIVIDADES
Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.
Desarrollo de la práctica:
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del frotis
2. Con el asa bacteriológi.ca previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o conla ayuda de la llama
débil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotasde la solución de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta que
no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero deBunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
Resultados: Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gramnegativas de
color rosado.
2.- Coloración de Ziehl-Neelsen
Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevadocontenido de

lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que es
soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula y en
esta forma resistir a la decoloración.
Material didáctico
• Láminas con frotis de bacilo tuberculoso

• Set de coloración Ziehl-Neelsen: Fucsina fenicada al 5% (colorante primario) Alcoholácido
(alcohol etílico con 3% de HCl) Azul de metileno (colorante de contraste)
• Mechero de alcohol
Actividades

d. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
7. Secar y observar con lente de inmersión.
Resultado: Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y el no ácido alcohol
resistentes se tiñen de color azul.
e. INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN
1. ¿Por qué Escherichia coli adquiere el color de la Fucsina, de qué está compuesta la paredcelular?
Explique brevemente el fundamento.
2. ¿Por qué Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no de Fucsina, dequé está
compuesta su pared celular?
3. ¿Por qué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con elazul de metileno,de qué
está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. ¿Qué otros microorganismos son considerados dentro de la clasificación BAAR?
f. RESULTADOS ESPERADOS
Que el alumno conozca, adquiera destreza en el manejo de las coloraciones realizadas en práctica e
interprete los resultados como parte de un diagnóstico.
COLORACIONES ESPECIALES
como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Diferenciar qué tipos de muestras se utilizan en las coloraciones
especiales.
Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en las
distintas coloraciones y discernir si la coloración fue bien
realizada.
a. MARCO TEÓRICO
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los
colorantes de anilina como: las espiroquetas, con estas coloraciones podemos teñir lacápsula Bacillus
anthracis (coloración de Hiss), esporas en Bacillus (coloración de Wirtz Conklin), los flagelos
(coloración de Leifson), gránulos, metacromáticos Corynebacterium (coloración de Albert), así como
también la coloración de microorganismos presentes en la sangre.
1.- Coloración de Leishman
Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de

microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Rickettsias.
• Frotis de sangre con Bartonella o bacterias variadas
• Solución de colorante Leishman
• Agua destilada tamponada
• Varilla de coloración
• Destilador de agua
c. ACTIVIDADES
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.
2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo.
Resultado: Coloración Leishman: los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro.
2.- Coloración de Vagó:

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el
método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.
Material didáctico:
• Lámina portaobjetos
• Lámina Cubreobjeto
• Palito mondadientes
• Set de coloración de Vago: Mercurio cromo al 2% y Violeta de genciana
• Asa de siembra en aro
• Microscopio estereoscópico
• Algodón
• Sarro dentario
Actividades
1. En una lámina colocar una gota de suero fisiológico al 0.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizarun frotis encapa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercurio cromo durante 3 minutos
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Resultados: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando partede la

flora normal de la boca, en forma de espiral y decolor violeta- rosado.
1. ¿Qué microorganismo puede ser teñido con la coloración de Leishman que ayude al
diagnóstico de la enfermedad conocida como?
2. ¿Qué bacteria infecciosa de forma helicoidal, puede aislar de una muestra del tubodigestivo,
que provoca diarrea con fiebre puede observarse con la coloración de vago?
3. Mencione el nombre de la espiroqueta que observa en sarro dental en una coloración devago
4. Realice un cuadro sinóptico de las coloraciones especiales estudiadas en clase
Que el alumno conozca, adquiera destreza en el manejo de las coloraciones realizadas enpráctica
e interprete los resultados como ´parte de un diagnóstico.
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES
OBJETIVO Conocer los medios de cultivos para seleccionar el adecuado
para el aislamiento de bacterias patógenas
LOGRO A MEDIR • Reconocer los diferentes medios de cultivo utilizados para el
aislamiento de microrganismos.
• Diferenciar los medios de cultivo según su clasificación.
• Interpretar y evaluar correctamente los resultadosobtenidos en los
distintos medios de cultivo.
a. MARCO TEÓRICO
Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios

especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser:simples,
enriquecidos, selectivos y diferenciales.
Tipos de medios de cultivo:
De acuerdo con su consistencia:
Líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio
líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne,
peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión
bacteriana de una determinada concentración.
Semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante
en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de
la movilidad de las bacterias.
Sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante, el agar.
Agar agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble
en agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma ungel firme entre 32 y 39ºC y
no se funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vezfundido alrededor de los 45ºC. Tiene
el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los
resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Especialmente útiles para el
aislamiento de bacterias y observación de colonias, contienen de 2 a 3 % de agar.
Según su utilización:
1. Medios Simples: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio
más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar
al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo se encuentra el agarel agar triplicase de
soja, el agar Columbia, etc.
2. Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores de crecimiento, indispensables para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros
productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores.
3. Medios selectivos: Son medios donde sólo crece un grupo de bacterias inhibe al mismotiempo
a otros grupos, contiene inhibidores, indicadores de Ph y azúcares que ayuda a identificarlo por
el metabolismo que de este. Ejemplo: agar Mac Conkey, agar Salmonella
– Shigella (SS), agar Manitol salado.
4. Medios diferenciales o metabólicos: contiene sustancias nutritivas e indicadores de pH que

permite detectar las reacciones bioquímicas específicas, ayuda a realizar la identificación de
género y especie. Ejemplo: agar Triple azúcar (TSI), agar Úrea, agar Citrato de Simmons.
• Tubos con Caldo nutritivo
• Placas con Agar simple o Agar nutritivo
• Caldo peptonado
• Agar Mac Conkey
• Agar Sangre
• Agar chocolate
• Agar Manitol salado
• Agar SS
• Agar TCBS
• Agar TSI
• Agar SIM
• Agar Citrato de Simons
• Agar Urea
• Agar LIA
• Agar MR VP
• Balanza Analítica
• Phmetro
• Mechero Bunsen
c. ACTIVIDADES
Esquematice en un flujograma lo observado en la práctica
La práctica se desarrolla de forma grupal y de acuerdo con la metodología de la asignatura.Realizar
un cuadro indicando:
a) Los medios de cultivo que se vieron en la práctica
b) El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
c) Materiales que se usan para la preparación.
d) Indicar cuál es su indicador e inhibidor según sea el caso.
• Aplicación de rúbrica
• Cuestionario:
1. ¿Cuál es su clasificación del agar chocolate según su utilidad y que microorganismo sepuede
aislar en este medio?
2. Realice un cuadro de clasificación de medio de cultivo de acuerdo con suconsistencia y su
utilidad, incluyendo dos ejemplos de estos medios
El alumno al final de la práctica debe conocer los medios de cultivos para seleccionar el más
adecuado para el aislamiento de bacterias patógenas.
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO
LOGRO A MEDIR • Realizar la siembra bacteriana de manera adecuada.
• Reconocer las características morfológicas de las colonias.
a. MARCO TEÓRICO
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las
24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximodesarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y

el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por elcual se pone en
contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra.
Existen varias técnicas de siembra, siendo las más usadas:
La siembra por estría, por dispersión agotamiento, por inoculación y por puntura. Las principales
características morfológicas que presentan las colonias son:
• Forma: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

• Elevación: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
• Borde: Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
• Superficie: Lisa, rugosa, granulada.
• Tamaño: Diámetro en milímetros.
• Consistencia: Cremosa, membranosa y mucoide.
• Cromogénesis: Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
• Tubos con suero fisiológico estéril
• Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
• Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
• Placas con Agar nutritivo
• Placas con Agar Mac Conkey
• Placas con Agar hipertónico de Chapman
• Tubos con Agar Sabouraud
• Tubos de 16x150 con medio Caldo nutritivo
• Agar TSI, LIA, Citrato, Úrea
• Agar Mac conkey
• Asas de siembra en aro y punta
• placa con agar hipertónico de Chapman o manitol salado con cepa de Staphylococcus.
Aureus
• placa con agar Mac Conkey con cepa de E. coli
• placa con agar de SS (Salmonella-Shigella) con cepa de Salmonella typhimurium
• placa con agar TCBS con cepas de Vibrio cholerae / Vibrio parahaemolyiticus
• Papel lente
• Gabinete de bioseguridad (Cabina Horizontal)
Cepas
• cepa de Escherichia coli

• cepa de Staphylococcus aureus
• cepa de Salmonella typhimurium
• cepa de Vibrio cholerae
• cepa de Vibrio parahaemolyticus
• cepa de Klebsiella pneumoniae
• cepa de Proteus mirabilis
c. ACTIVIDAD
Esquematice en un flujograma lo observado en la práctica.
A. Tipos de siembra:
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembraen aro. Ejemplo
agar urea, citrato, TSI, LIA
Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de

la superficie del medio de cultivo sólido que seencuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º y
continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Ejemplo Agar manitol, Agar SS
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, conayuda
del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma verticalhasta la mitad de Agar.
Ejemplo SIM, MIO, TSI, LIA
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo
hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo. Ejemplo los
medios en caldo MR-VP, peptona,nutritivo.
B. Lectura:
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de

cultivos sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos
Aplicación de rúbrica.
1. Explique por qué es más efectivo como desinfectante una solución de etanol al 75%
queel etanol absoluto.
2. ¿Cuál es la importancia de determinar para una bacteria los parámetros de CIM y CLM?
3. Describa la técnica de Kirby-Bauer.
4. ¿Qué factores intervienen o modifican los resultados de un antibiograma?
Alumno interpreta los resultados de un antibiograma de manera correcta.

METABOLISMO BACTERIANO
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza en el manejo de los medios de cultivo e
interpretar los resultados como ´parte de undiagnóstico.
LOGRO A MEDIR • Reconocer los diferentes medios y sustratos asimilados
por losmicroorganismos.
• Identificar a los microorganismos de acuerdo con su proceso
metabólico.
• Interpretar y evaluar correctamente los resultadosobtenidos en los
diferentes marcadores de identificación bacteriana.
a. MARCO TEÓRICO
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características

de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterización
final de un aislamiento bacterianodesconocido, para identificarlo anivel de género y especie se lleva a
cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y sirvan como
marcadores de identificación.
En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción dela colonia
bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e
indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
específicos.
A. Acción sobre los carbohidratos:
Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un medio
ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final de
hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilizaciónde hidratos de carbono
como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos
mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio de
color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se
manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
B. Reacciones de oxidación - fermentación de azúcares:en medio TSI (Triple SugarIron)
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro dehidrógeno
(H2S).
El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10

respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es
el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en
este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentación de glucosa únicamente.

2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos
carbohidratos.
3. No fermentación de carbohidratos.
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta
como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitadonegro insoluble de sulfuroferroso (FeS).
• Tubo con medio TSI en plano inclinado con cepas control: E. coli, Salmonella,
P.aeruginosa
• Incubador Agitador
• Papel Lente
c. ACTIVIDADES
En grupo desarrollar un cuadro sinóptico y el cuestionario con relación a la práctica
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo yestríe
la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37°C por 18 - 24 horas.
Interpretación:
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la cantidad
de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la
utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados. Estos procesos, que son
oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que, en el fondo, por no estar en contacto
con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.
3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo). La fermentación de la glucosa y
alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo que el tubo
permanece amarillo.
4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización
oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
C. Producción de ácidos y Acetil- metil- carbinol (AcetoÍna)
1. Prueba del rojo de metilo (RM)
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,
fórmico) a partir de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguenla vía de fermentación de
ácidos mixtos frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada,
como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo),
superando el sistema amortiguador del pH del medio.
2. Prueba de voges proskauer (VP)
El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la

glucosa, es metabolizado por algunos microorganismos produciendo el acetil – metil - carbinol
(Acetoína) un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol. La pruebase basa en la conversión
del acetil – metil - carbinol en diacetil a través de la acción del KOH y Oxígeno atmosférico. El
diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción catalítica del Alfa naftol y Creatinina.
• Cepa bacteriana MR positivo y negativo
• Cepa bacteriana VP positivo y negativo
• Reactivo Rojo de metilo
• Reactivo de Voges – Proskauer (Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
• Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
• Ph metro
• Incubador agitador
• Mechero Bunsen
Actividades:
En grupo desarrollar un cuadro sinóptico y el cuestionario con relación a la práctica
Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivoy negativo,

en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
Interpretación:
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,cuyo
rango de viraje está entre pH 4.4 (rojo) y 6.0(amarillo).
2. La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo-naranja.
3. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml (12 gotas) de Alfa naftol y
0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es
importante añadir los reactivos en el orden específico.
4. Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada
dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los cultivos
pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva. En la prueba
negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
D. Acción sobre las proteínas:
Producción del indol:
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco (NH3). El indol puede
detectarse en un medio rico en triptófano, observando la aparición de un color rojo (en forma deanillo
impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p-
dimetilaminobenzaldehido
Material didáctico
• Cepa indol positivo y negativo.

• Medio líquido peptonado y/o Medio SIM
• Reactivo de Kovacs (alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilaminobenzaldehido.
• Cepas bacterianas E. coli, Salmonella spp.
• Lámina portaobjeto
• Lámina cubreobjeto
• Ph metro
Actividades
En grupo desarrollar un cuadro sinóptico y el cuestionario con relación a la práctica.
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos
después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba
positiva. Las bacterias que, a pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar
el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo estauna prueba negativa.
Agar Lia (Agar Lisina Hierro)
Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina

descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de gas(CO2),
junto con la producción o no de ácidosulfhídrico (H2S).
Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. La reacción producida en la superficie

(parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH del medio es
purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidadal color púrpura. Por
contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo del tubo es amarillo y
la superficie alcalina.
Interpretación: En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
1. Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta la glucosa:

superficie purpura/fondo amarillo.
2. Descarboxilación de la lisina: Positivo (púrpura todo el medio),Negativo (superficie violeta/fondo
amarillo).
3. Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
4. Producción de gas: ruptura del medio.
5. Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.
Utilización del citrato como única fuente de carbono
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae,
las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación delos carbohidratos, utilizando
el citrato de sodio como única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,
cualquier medio que se emplee para determinar esta característica no debe contener proteínas ni
carbohidratos. El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que
constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
Principio:
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con
formación de subproductos alcalinos. El medio (citrato de Simmons) incluye citrato de sodio, un anión
como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias
que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de
amonio (NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en hidróxido de amonio (NH4OH),
detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre
pH 6.9 (verde) y pH 7.8 (azul).
• Cepa control citrato positivo y negativo.

• Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
• Ph metro
Actividades:
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría encada tubola cepa
citrato positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18 - 24 horas.
Interpretación:
Prueba positiva: Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado. Prueba
negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
Hidrólisis de la urea (Prueba de la ureasa)
Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que
hidroliza la urea, según el siguiente esquema:
El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una

alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
• Cepa patrón ureasa positiva y negativa (E. coli, Proteus)

• Medio Agar urea según Christensen
• Ph metro
Actividades:
1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa.Noinocular en el fondo.
2. Incubar durante 18 - 24 horas a 37°C
Interpretación:
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.

Prueba negativa: El medio permanece del color original.
LECTURA
PRUEBAS MEDIO DE REACTIVO Y/O (según la
BIOQUÍMICAS CULTIVO INDICADOR reacción
colorear)
TSI
(fermentación, H2
S)
MR
Rojo de Metilo
VP
Voges-Proskauer
INDOL
LIA
CITRATO
UREASA
Cuestionario
1. Mencione y esquematice seis pruebas bioquímicas explicando su fundamento
Que el alumno conozca y adquiera destreza en interpretar los resultados de los medios de cultivos
diferenciales como ´parte de un diagnóstico.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS ANTIBIOGRAMA)
Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados

OBJETIVO
• Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar

lasusceptibilidad a los antibióticos.
LOGRO A MEDIR
• Interpretar los resultados del método utilizado.
• Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada
a. MARCO TEÓRICO
Si bien es cierto muchos microorganismos son importantes para proceso vitales en el planeta, pero
muchos de estos agentes se encuentran en superficies inertes como contaminantes o pueden producir
enfermedades al hombre o a otros organismos como animales o plantas. Porlo mencionado el hombre
ha tratado de encontrar maneras para controlarlos, ya sea matándolos o simplemente deteniendo su
desarrollo. Muchas de estos microrganismos buscanestrategias como para sobrevivir en condiciones
adversas.
Entre los mecanismos existentes para controlar el crecimiento microbiano se encuentran los agentes
físicos antimicrobiano como el calor, bajas temperaturas, la filtración, desecación, presión osmótica y
radiaciones; En cuanto a los agentes químicos antimicrobianos generalmente se tiene que tomar en
cuenta la concentración, lugar de aplicación en el controlde desarrollo del microorganismo, tenemos a
los bactericidas, bacteriostáticos, antisépticos y desinfectantes.
Antibióticos: Son las sustancias químicas producidas por microorganismos y que poseen acción
antibacteriana (actúan contra las bacterias).
Quimioterapéutico. Compuestos obtenidos por síntesis química y con características antibacterianas.
Antimicrobiano: Incluye compuestos obtenidos a partir de microorganismos y los producidos por

síntesis química, muchos antibióticos se pueden obtener por síntesis después de su caracterización.
Las pruebas de laboratorio clínico de sensibilidad se utilizan para medir la actividad antibacteriana de
los antibióticos y quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. La
medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:
• Método de dilución
• Método de Difusión en Agar
Dilución en tubo:
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiéndola concentración
inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro”
bacteriano.
Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se puede
observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico bacteriano.
Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza y puede extenderse para determinar
la Concentración Letal Mínima (CLM)
Estas pruebas pueden realizarse en una microplaca y forman la base de los sistemas de pruebas de
sensibilidad automatizados.
Difusión en agar (Según Kirby- Bauer y col.):
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o
quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar el
microorganismo aislado y puro de la muestra en estudio luego se siembra sobre toda la superficie de una
placa de Agar Mueller-Hinton, (la concentración de bacterias debe ser medida con la ayuda de la escala
de Mac Farland o por espectro) y colocar luego discos de papel filtro que contienen concentraciones
diversas de los antibióticos; después de una incubación de 24 horas, se observan y se miden las zonas
de inhibición alrededor de cada discode antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el disco difiere
para los distintos fármacos.
• Placas de Agar Müller Hilton o Tripticasa soya
• Tubos con caldo nutritivo o solución salina estéril
• Tubo con cepa E. coli / S. aureus
• torundas estériles de algodón
• Asas de siembra
• Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos(sensi- disck).
• Pinzas
• Mecheros
• Tubo de Mc Farland (0.5)
• Espectrofotómetro
• placas con agar Muller Hinton sembrada con cepas y con los discos, observándose las
zonas de inhibición
• Papel lente
• Aceite de Inmersión
• Alcohol Isopropílico
c. ACTIVIDADES
1. Para la preparación del inóculo o caldo bacteriano se toma de 3 - 5 colonias y se siembraen 4 o 5
ml de caldo triplicase de soya, se incuba a 35°C por a 2 horas luego se mide turbidez para que
sea igual al estándar de Mc Farland (0.5) o hacer la medición con un espectrofotómetro.
2. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
3. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm. 4.
Incubar a 37°C durante 24 horas.
Lectura:
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano

alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados. Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos
susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis altas del antibiótico.
c) La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su
capacidad de difusión en el Agar.
d) Anotar e interpretar los resultados.
• Aplicación de rúbrica
• Desarrollo de preguntas cuestionario:
• Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en

la práctica desarrollada.
• Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en
la práctica desarrollada.
Que el alumno conozca y adquiera destreza en interpretar los resultados de los medios
decultivos diferenciales como ´parte de un diagnóstico.
TOXINAS BACTERIANAS
OBJETIVO Conocer e interpretar la acción de las toxinas y enzimas como parte de
pruebas de diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Evidenciar la acción de diversas toxinas y enzimas bacterianas.
a. MARCO TEÓRICO
Las toxinas son componentes bacterianos que dañan directamente los tejidos o ponen en marcha
actividades biológicas destructivas. Las toxinasy las actividades de otras sustancias similares se
deben a la acción de diversas enzimas degradativas que ocasionan la lisis celulary de proteínas que
se unen a receptores específicos que inician reacciones tóxicas en un tejidodiana específico.
Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas anaerobias.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo con la siguiente reacción:
La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa)de los
estafilococos (catalasa positiva).
Materiales:
• Cepas control: S. aureus, Streptococcus o Enterococcus.
• Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%.
• Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen
actividad de catalasa, por loque su presencia puede dar resultados falsos positivos.
• Cepas control: Streptococcus. pyogenes, Streptococcus pneumoniae.

• Placa con agar sangre de carnero.
• Incubador agitador.
• Microscopio
c. ACTIVIDADES
Realizar los dibujos de las actividades realizadas en la práctica
Procedimiento:
• Colocar sobre una lámina portaobjeto una solución de peróxido de hidrógeno al 3%.
• Colocar sobre el peróxido un asa del cultivo de S. aureus.
• Observar la presencia de burbujas (liberación de oxígeno) que indican positividad
• Realizar el mismo procedimiento con una cepa control catalasa negativa.
• Observar, esquematizar e interpretar.
Prueba del citocromo oxidasa

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena
respiratoria aerobia, transfiriendo electrones H al oxígeno con formación de agua. El sistema
citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar
a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En el laboratorio se hace
reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p- fenilendiamina (el cual
se presenta en solución, discos o tiras llamados comúnmente oxidasa).
Materiales:
• Cepa control sembrada en agar nutritivo: Pseudomonas, Neisseria
• Reactivo de oxidasa
• Papel filtro
Procedimiento:
• Colocar sobre una lámina portaobjeto o dentro de una placa de Petri un pedazo de papel filtro.
• Colocar varias gotas del reactivo oxidasa sobre el papel filtro.
• Colocar una asada del cultivo Pseudomonas o Neisseria sobre el papel con el reactivo.
• La aparición de un color negro o púrpura indica una prueba positiva.
• Realizar el procedimiento con una prueba control negativa.
Prueba de coagulasa
Los estafilococos patógenos producen una enzima capaz de coagular el plasma sanguíneo del conejo
y del humano, el cual es considerado como factor de virulencia.
Materiales:
• Cepas control: S. aureus, S. epidermidis.

• Plasma de conejo en tubo
• Estufa calibrada a 37°C
• Asa bacteriológica
• Mechero Bunsen
Procedimiento:
• Sembrar una cepa de S. aureus en un tubo conteniendo plasma de conejo

• Incubar a 37°C durante 4 h. realizar la lectura cada 30 minutos, observando la formación de
coágulos de fibrina.
• En caso de no observar el coágulo en ese tiempo, dejar incubar por 24 h.
• Realizar el mismo procedimiento con una cepa de S. epidermidis.
Demostración de hemolisinas
Las hemolisinas son toxinas que presentan actividad hemolítica. La α- hemólisis se caracteriza por
ser hemólisis parcial de los glóbulos rojos, observándose un halo opaco alrededor de las colonias. La
β-hemólisis se caracteriza por hemólisis total de los glóbulos rojos, formando un halo claro alrededor
de la colonia.
Procedimiento:
• Sembrar en una placa de agar sangre de carnero una asada de cultivo joven de S. pyogenes, S.
pneumoniae. (o muestra positiva) por el método de agotamiento por estría.
• Realizar el mismo procedimiento con otras cepas bacterianas y otros medios de cultivo
• Incubar por 18 – 24 horas a 37° C.
Aplicación de la rúbrica
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS:
STAPHYLOCOCCUS
LOGRO A MEDIR • Reconocer a los microorganismos cocos Gram Positivos
• Diferenciar a los miembros del género Staphylococcus patógenos
de los saprófitos
• Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicasy
confirmativas
a. MARCO TEÓRICO
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,
agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S.
aureus produce una enzima llamada coagulasa.
• Agar Chapman o manitol salado sembrado con cepa de S. aureus
• Agar Chapman o manitol salado sembrado con cepa de S. epidermidis / S. saprophyticus.
• Cepa de S. aureus más plasma de conejo (0.15 ml) en tubos (incubado por 24 h): control positivo.
• Cepa de Staphylococcus epidermidis más plasma de conejo (0.15 ml) en tubos (incubado por 24
h): control negativo
• Plasma de conejo (0.15 ml)
• Placas Petri con Agar sangre (AS)
• Set de colorantes para Gram
• Asa de platino en aro
• Reactivo Catalasa: Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%
• Ph metro
• Placas con agar sangre sembrada cepas de S. epidermidis con discos de novobiocina y
furazolidona
• Placas con agar sangre sembrada cepas de S. saprophyticus con discos de novobiocina y
furazolidona
• Microscopio
• Papel lente
• Alcohol isopropilico
• Varilla decoloración
• Mechero Bunsen
• Lámina cubreobjeto
• Lámina portaobjeto
c. ACTIVIDADES
Realizar los dibujos de las actividades realizadas en la práctica.
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con agar hipertónico de Chapman y agar sangre, por
el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylococcus, estudiando las
características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman (tamaño,
forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una colonia de
color amarillo e inocularlo el tubo con caldoplasma e incubar a 37ºC (Prueba de la coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertónico de Chapman o manitol salado contiene: NaCl al 6.5%y como indicador de pH el
rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novobiocina y furazolidona.
Resultados
1. Características macroscópicas de la muestra:

2. Resultado de la coloración realizada
3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus
coagula el plasma.
4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la
aparición de burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarillas (manitol
positivas) de S. aureus y S. saprophyticus; y color rosado (manitol negativas) en S.
epidermidis.
6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre
7. La novobiocina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprophyticus;
8. S. epidermidis es sensible y S. saprophyticus resistente.
Protocolo:
• Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajó, tamaño
de la colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea
conveniente.
• Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.
Cepas Muller Hilton Agar

Característica
bacterianas o Manitol sangre Coagulasa Catalasa Gram
morfológica
Trabajadas salado (AS)
Mencione las toxinas producidas por estafilococos.
¿Cuál es la importancia de realizar pruebas de sensibilidad a los antibióticos para estafilococos?
Mencione función e importancia de la Proteína A estafilocócica.
Alumnos preparan un organizador gráfico de estafilococos.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS:GÉNERO
STREPTOCOCCUS
OBJETIVO
LOGRO A MEDIR • Reconocer a los microorganismos cocos Gram Positivos
• Diferenciar a los miembros del Género Streptococcus
• Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicas y
confirmativas
a. MARCO TEÓRICO
El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield
en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H
(S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con la
coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son
patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo
humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite diferenciar
algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glóbulos rojos
que rodean a la colonia son parcialmente dañados, pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo.
Existe un reverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la
metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa
hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en presencia
o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las especies de
Streptococcus.
• Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo BHI
• Placas con Agar sangre de carnero
• Torunda estéril y bajalengua
• Tubos con Tioglicolato
• Tubos con caldo Inulina
• Discos de Bacitracina
• Discos de Optoquina
• Solución de Desoxicolato al 2%
• Tubo con NaCl al 6.5%
• Set de colorantes de Gram- Kopeloff
• Asas de Kolle, pinzas
• Microscopio Binoculara
• Papel lente
• Cabina de flujo laminar.
• Placas con Agar sangre de carnero sembrado S. pyogenes, S. pneumoniae / S. agalactiae
• Placas de agar sangre de carnero 5% más disco de bacitracina sembrada con cepa de S.
pyogenes
• Placas de agar sangre de carnero 5% más discos de optoquina sembrada con cepa de S.
pneumoniae / S. agalactiae
• Prueba de CAMP en agar sangre, sembrada con cepas de S. aureus (una raya recta) y S.
pyogenes (en ángulo recto)
• Tubos con caldo BHI NaCl 6.5% sembrada con cepa de Enterococcus
• Tubos con caldo BHI NaCl 6.5% sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 10oC sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 45oC sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 10oC sembrada con cepa de Enterococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 45oC sembrada con cepa de Enterococcus
c. ACTIVIDADES
Procedimiento:
• Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce

turbidez o sedimento.
• Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y
agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetos y
colorear por Gram.
• Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la bacitracina y el disco
de optoquina.
• Sembrar una cepa de S. aureus (línea) y de Streptococcus (ángulorecto sin tocarse) en agar
sangre.
• Sembrar las cepas bacterianas en caldo BHI o TSB
• Sembrar la cepa en el tubo con NaCl al 6.5%.
• Realizar la prueba de la catalasa.
• Realizar la prueba de desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias
de lisarse en presencia de sales biliares.
Lectura:
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son β-hemolíticos; S. viridans y S. pneumoniae son

α-hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la bacitracina y optoquina: S. pyogenes es sensible a la bacitracina
y S. pneumoniae es sensible a la optoquina.
3. Observe la hemólisis sinérgica en el área de intersección donde el factor CAMP y la B- hemolisina
se han difundido en el medio.
4. Observar el crecimiento de microorganismos en caldo BHI o TSB a 10°Cy 45°C.
5. En la solución de NaCl al 6.5%, observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)
6. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa. 7.Agregar una gota de
desoxicolato de sodio al 10% sobre una o varias colonias en la placa de Agar sangre e incubar a
35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva las colonias se desintegran o solubilizan.
Protocolo:
Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada.
Identificación presuntiva de Streptococcus
Hidrolisis Lisis por

Sensibilidad
de bilis
Organismo
Desoxicolato de
Metabolismode
Desarrollo en
NaCl 0,5%
Baitracina
la inulina
Optochin
Hipurato
Esculina
CAMP
sodio
β Hemolítico
Grupo A S R N N N N N N
S. pyogenes
Grupo B
S. agalactiae R* R P P N N P* N
Grupo C,F,G R R N N N N N N
α hemolitico
Grupo Viridans R* R N N N* N N N
S. pneumoniae R S N N N P N P*
1. Explique la importancia de la proteína M para el género Streptococcus.

2. Explique la importancia que tienen los cultivos en agar sangre en la clasificación del género
Streptococcus.
3. ¿Cuáles son y qué efecto que tienen estreptolisinas en los tejidos del hombre?
4. ¿Cuál es la importancia clínica de la identificación de Streptococcus pneumoniae?
5. Mencione otras técnicas de tinción para demostración de cápsula.
f. RESULTADOS ESPERADOS:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GÉNERO NEISSERIA
Conocer, adquirir la destreza de reconocer las colonias, interpretar los

OBJETIVO resultados como parte de un diagnóstico.
• Reconocer a los microorganismos cocos Gram negativos
• Diferenciar a los miembros del género Neisseria
LOGRO A MEDIR
confirmativas
a. MARCO TEÓRICO
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstas N.
gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En
muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de
metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que
le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de 7.2 a
7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfológicamente similares.
La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono: Glucosa,

maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el laboratorio. Se
debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recolección correcta de la muestra.

b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.
c) Selección del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.
• Placa de medio MTM (Thayer Martin Modificado) sembrada con Neisseria gonorrhoeae / N.
meningitidis
• Placa con Agar sangre sembrada con Neisseria gonorrhoeae / N. meningitidis
• Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
• Reactivo de Citocromo - oxidasa
• Reactivo de catalasa
• Agar base semisólido tripticasa-cistina (CTA) con: Glucosa, Maltosa, Sacarosa y Lactosa. al 1%
sembrado con Neisseria gonorrhoeae / N. meningitidis
• Set de coloración de Gram
• Colorante de Azul de metileno
• Asas de siembra en aro y punta
• Solución de alcohol yodado
• Algodón
• Papel lente
• Alcohol isopropilico
• Cabina de flujo laminara
c. ACTIVIDADES
1. Observar en el medio MTM, las colonias pequeñas, circulares de bordes continuos, blanco -
grisáceos, convexas, mucoides, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. gonorrhoeae
y si es N. meningitidis en agar sangre, colonias más grandes que las gonocócicas, grises y
mucoides.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2 - 3 minutos
el cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa
positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lámina
control.
4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
5. Sembrar las colonias en el medio CTA y observar los carbohidratos que utiliza. Es positiva cuando
se observa el viraje del medio de color rojo a amarillo.
Medios de Azul de
Colonias Tamaño
cultivo/muestras Gram metileno
Agar MTM
Agar sangre
Secreción
Oxidasa Catalasa
endocervical
Pruebas
bioquímicas
Utilización de
carbohidratos
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
POSITIVOS: GÉNERO BACILLUS
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados como
parte de un diagnóstico.
LOGRO A MEDIR • Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos
• Diferenciar a los miembros del género Bacillus
confirmativas
a. MARCO TEÓRICO
El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Gram positivos, formadores de esporas y que
pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedades en el
hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como “carbunco",
otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se encuentran en
el suelo, agua y aire.
La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se presenta
como un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son
grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en
largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
b. MATERIALES
• Placas Petri con Agar nutritivo sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
• Placas Petri con Agar sangre sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
• Tubos con Agar semisólido SIM sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
• Tubos con gelatina sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
• Láminas para frotis
• Reactivo de la catalasa
• Set de coloración de Gram modificado
• Set de coloración de Hiss para cápsula
• Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
• Asa de Kolle o de siembra
c. ACTIVIDADES
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
Coloración Hiss (cápsula):
1. Preparar un frotis
2. Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3. Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4. Lavar con agua corriente y secar
5. Observar al microscopio con lente de inmersión
Coloración de Wirtz Conklin (Esporas):
1. Preparar un frotis
2. Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte)
4. Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5. Lavar y secar
6. Observar al microscopio con lente de inmersión
Lectura:
En los cultivos:
• En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies
patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se observan bacilos
endoesporulados
• En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
• En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina: sólo las
especies saprofitas producen hidrólisis.
EN LAS LÁMINAS COLOREADAS:
• Gram: Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el

centro del bacilo.
• Hiss: El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro.
• Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde
PROTOCOLO: Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica
Género: Bacillus
Especie patogéna Especie saprófita

Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Hemolisis
Hidrolisis de la gelatina
Prueba de la catalasa
Fermentación de la salicina
Movilidad
POSITIVOS: GÉNERO LISTERIA
Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados como
OBJETIVO
parte de un diagnóstico.
• Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos
LOGRO A MEDIR
• Diferenciar a los miembros del género Listeria
a. MARCO TEÓRICO
El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y
presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V ó
de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo,
en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los
ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, desarrolla

bien en medios de cultivo comunes.
b. MATERIAL DIDÁCTICO:
• Tubos con medios semisólidos SIM (Motilidad)
• Placas Petri con agar sangre con cepa de Listeria monocytogenes
• Placas Petri con agar nutritivo con cepa de Listeria monocytogenes
• Tubos de 13x100 con:
• Agar urea de Christensen con cepa de Listeria monocytogenes
• Citrato de Simmons con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo rojo de fenol con glucosa con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo rojo de fenol con sacarosa con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo rojo de fenol con lactosa con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo rojo de fenol con manitol con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo rojo de fenol con salicina
• Caldo esculina con cepa de Listeria monocytogenes
• Caldo: MR- VP
• Reactivo de catalasa
• Tira reactiva de oxidasa
• Microscopio
• Papel lente
• Cámara de flujo laminar
• Alcohol Isopropilico
• Lamina porta objetivo
• Algodón
c. ACTIVIDADES
1. Hacer frotis a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina y
laminilla.
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
Lectura:
• Frotis con Gram: se observarán como bacilos: Gram positivos.
• Láminas en fresco: Se observará la movilidad peritríca, utilizando los objetivos de 40 aumentos.
• En caldo nutritivo: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
• En agar sangre: se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
• En medios diferenciales: Observar
Identificación presuntiva del género Listeria:
Protocolo:
Hemolisina + Sacarosa - VP +
Catalasa
+ Lactosa -
- Manita -
Oxidasa
- +
Urea Salicina
Citrato - Esculina +
e. INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN:
POSITIVOS: GÉNERO CORYNEBACTERIUM
OBJETIVO
• Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos
• Diferenciar a los miembros del género Corynebacterium
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se incluyen
especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las características comunes del género son:
• Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas

• Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en “letras
chinas”,
• Aerobios o anaerobios facultativos,
• Catalasa positivos,
• Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda, contagiosa y
febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe,
además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina diftérica). Es
propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias
superiores.
El género se divide en tres grupos:

Grupo I: Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales;
Grupo II: Corinebacterias fitopatógenas, y;
Grupo III: Corinebacterias no patógenas. Algunas de las especies más frecuentemente halladas en
el laboratorio clínico son: C.diphtheriae, C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale,
C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión
inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
• Cepa de Corynebacterium diphtheriae en caldo enriquecido
• Placa con Agar sangre
• Placa con Agar chocolate telurito de potasio
• Placa con Agar chocolate telurito de potasio con cepa de Corynebacterium diphtheriae
• Tubo de 13x100 con medio Pai en plano inclinado
• Set de colorante de Gram
• Set de colorante de Albert
• Tubos con Agar Urea Christensen en plano inclinado
• Caldo Rojo de fenol + Glucosa
• Caldo Rojo de fenol + Maltosa
• Asas de siembra
• Solución salina
• Papel lente
• Lamina portaobjeto
• Algodón
c. ACTIVIDADES
Procedimiento
1. Tomar el inóculo de la cepa de C. diphtheriae y realizar la siembra por el método de dispersión

agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por estrías. Incubar
por 48 horas a 37°C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.
4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo Rojo
de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
Coloración de Albert
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen de
color azul intensoy el soma bacteriano se observa muy débilmente.
Procedimiento
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.

2. Cubrir con la solución a de Albert (azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol etílico,
agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de100X
Lectura
• En la coloración Gram - Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados ensanchados
en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o dispuestos
paralelamente, en forma de “letras chinas”.
• En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro
• En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos)
observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
• Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.
• Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
• Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.
• En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con bordes
enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta hemólisis.
Bioquímica de Corynebacterium diphtheriaea
e. INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CLOSTRIDIUM
OBJETIVO Realizar la identificación de bacterias del género Clostridium.

Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos formadores de
LOGRO A MEDIR
esporas.
a. MARCO TEÓRICO
Los clostridios son bacilos grampositivos grandes que forman esporas, tienen esporas resistentes al
calor, desecación y desinfectantes. Pueden sobrevivir durante años en el ambiente y regresar a la
forma vegetativa cuando se les coloca en un medio favorable.
La forma de la célula y la localización de la espora varían según la especie, pero es poco común
observar esporas en muestras clínicas. C. perfringens es un bacilo grampositivo rectangular de gran
tamaño (0,6 a 2,4 × 1,3 a 19 mm) que rara vez forma esporas.
• Parafina líquida estéril
• Agar gelatina
• Láminas para frotis
• Batería Gram
• Set de coloración Wirtz Conklin
• Jarra anaeróbica de Brewer
• Muestras: exudado de heridas, pus, heces, cepa de E. coli, Caldos de enriquecimiento: caldo
tioglicolato, caldo carne glucosado, Agar selectivo: Agar Triptona-Sulfito-Neomicina (TSN), Agar
sangre L-D (Según Lombard-Dowell), Agar yema de huevo, Pruebas bioquímicas diferenciales:
hidrólisis de gelatina, fermentación glucosa, lecitinasa, lipasa, indol, urea, nitrato, movilidad,
hidrólisis de esculina, esporas.
• Jarra de anaerobiosis
• Papel lente
• Camara de flujo laminar
• Lamina porta objeto
• Algodón
c. ACTIVIDADES
Procedimiento:
1. Realizar la coloración Gram y Wirtz Conklin de las muestras culturas;
2. Sembrar las muestras en caldo tioglicolato y caldo carne siguiendo las indicaciones del docente.
3. A partir de los tubos de enriquecimiento extraer una asada y sembrar en los medios de
aislamiento, agar sangre, agar yema de huevo y agar TSN.
4. Incubar todos los cultivos en jarra de anaerobiosis a 37ºC, en estufa, por 24-48 horas.
Resuelva las siguientes preguntas:
1. Elabore el algoritmo para el aislamiento de C. perfringens de muestras clínicas,

2. ¿Con que objetivo las muestras fueron sembradas en caldo tioglicolato, Por qué C.
3. perfringens fue capaz de crecer en este caldo de cultivo?
4. ¿Por qué es importante la investigación de lecitinasa en C. perfringens?
5. ¿Cuál es el resultado esperado del crecimiento de C. perfringens en agar sangre?
1. Lectura de las láminas coloreadas
Gram: ver las esporas, C. perfringens son subterminales, raramente se observan;}. Wirtz Conklin:
el microorganismo se observa de color rosado y la espora de color verde.
2. Lectura en los medios de cultivo
En Agar sangre: C. perfringens, son colonias grises, opacas algo rizoides y tienden a extenderse,
con doble hemólisis
En Agar yema de huevo: observar la producción de lecitinasa por C. perfringens.
En Agar TSN observar colonias negras.
3. Realizar la lectura de la serie Bioquímica, anotar los resultados
4. Identificar las bacterias, con la ayuda del cuadro adjunto.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES
GÉNERO MYCOBACTERIUM (ACTIVIDAD DEMOSTRATIVA)
OBJETIVO Identificar bacterias del género Mycobacterium
• Reconocer a los microorganismos bacilos ácido alcohol resistentes.
Diferenciar a los miembros del Género Mycobacterium.
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
Este género está conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar,
poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamente
en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el aire,
en el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que
puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los
más frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico
específico a través de la baciloscopia. Mycobacterium leprae produce la lepra o enfermedad de
Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium
simiae, con menor frecuencia, también, son patógenos.
PRUEBAS DIAGNÓSTICAS:
Examen directo: baciloscopía
Cultivo convencional: Ogawa o Lownstein
Pruebas de sensibilidad convencionales: Método de proporciones de 1ralínea. Método de
Proporciones en placa de 2da Línea (APP)
Pruebas de sensibilidad rápidas
GENOTÍPICAS:
Sondas de ADN (Genexpert MDRplus): Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina GeneXpert: Se
evalúa la droga Rifampicina
FENOTÍPICAS
MODS: Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina
• Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
• Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. hominis
• Láminas con extensión de otras especies de Micobacterias
• Reactivos para la coloración Ziehl Neelsen (B.A.A.R.)
• Cepas patrones sembradas en medio Lowenstein Jensen o Ogawa
• Muestra: esputo positivo, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural.
• Gabinete de Bioseguridad Nivel III (Cabina Horizontal), si hay replique de cepas.
c. ACTIVIDADES
1. La práctica se desarrolla de forma grupal y de acuerdo con la metodología de la asignatura.
2. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.
3. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la lámina
portaobjetos nueva.
4. Fijar la preparación.
5. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
1. ¿Cuáles son los síntomas de la tuberculosis?
2. ¿Cuáles son las características que debe tener una muestra de esputo?
3. ¿Dónde debe ser realizada la colecta del material?
4. ¿Por qué el género Mycobacterium es conocido como bacterias alcohol acido resistentes?
5. ¿Qué características de la pared bacteriana de Mycobacterium le confieren su patogenicidad?
LECTURA:
Observar cómo los gérmenes visibles por el Gram no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen
porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en
un fondo azul.
EXAMEN MICROSCÓPICO CUANTITATIVO BACILOSCOPÍA:

Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, según el siguiente cuadro:
Negativo: No se observan bacilos en 100 campos.De 1

a 9 BAAR promedio en 100 campos
Positivo (+): Menor de 1 bacilo promedio por campo, en 100 campos. Positivo (++):
De 1 a 10 bacilos promedio por campo, en 50 campos. Positivo (+++): Más de 10
bacilos promedio por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que está en tratamiento y permite
detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS:
Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos en

grupos:
CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS ATÍPICAS (SEGÚN RUNYON)

Grupo de crecimiento lento
Crecimiento lento, colonias no pigmentadas en la oscuridad; los

I. Fotocromógenas cultivos jóvenes adquierencolor amarillo al exponerlos a la luz M.
kansasii
Crecimiento lento, colonias pigmentadas amarillentas o

II. Escotocromógenas anaranjadas en la oscuridad. M.gordonae, M. scrofulaceum, M.
flavescens, M. szulgai
Crecimiento lento, colonias generalmente nocromógenas o
III. No cromógenas débilmente pigmentadas. M. avium, M. intracellulare, M. gastri,
M. terrae, M. triviale
Grupo de crecimiento rápido
Crecimiento rápido, colonias no pigmentadas en la oscuridad; los

I. Fotocromógenas cultivos jóvenes adquierencolor amarillo al exponerlos a la luz M.
marinum
Crecimiento rápido, colonias pigmentadasamarillentas o

II. Escotocromógenas
anaranjadas o irregular. M.phlei, M. vacae, M. smegmatis
III. No cromógenas M. fortuitum, M. chelonae

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
OBJETIVO Identificar bacterias del género Mycobacterium

• Reconocer a los microorganismos Gram negativos Diferenciar a los
miembros de la familia Enterobacteriae
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los
cuales son patógenos para el hombre y causantes de enfermedades. El diagnóstico y aislamiento del
microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el COPROCULTIVO, es decir el
cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislamiento del agente patógeno
bacteriano.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas. Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados,
es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen
factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el
sistema urinario. La E. coli enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y
produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E. coli
enteroinvasiva (ECEI) y la E. coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e infección
y son productoras de endotoxinas. Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos
son exclusivas del hombre y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces
septicemias como la Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones
urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.
• Placas Petri con Agar Mac Conkey, Agar SS, agar manitol, Sabouraud
• Placas Petri con Agar Mac Conkey, Agar SS, sembrado con Escherichia coli / Klebsiella
pneumoniae, Salmonella typhimurium / Shigella flexneri, Proteus
• Tubos con medio TSI, LIA
• Placas Petri con agar manitol S.aureus
• Placas con agar Sabouraud sembrado con Candida albicans
• Tubos con caldo peptonado
• Tubos con Citrato de Simmons
• Tubos con caldo MR-VP
• Frasco con Lugol
• Reactivo para Citocromo-oxidasa
• Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
• Reactivo para Rojo de metilo
• Láminas portaobjeto y cubreobjeto
• Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
• Juego de colorantes para Gram
• Material básico para laboratorio
• Muestras: heces patogénicas, resultado de colostomia, ileostomia o contenido duodenal
• Ph metro
• Balanza de plato
• Horno Calor seco
• Autoclave
• Gabinete de Bioseguridad (Cabina horizontal)
c. ACTIVIDADES
1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a. Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. De solución
salina.
b. Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar
SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c. Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo
peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
Lectura
• Agar Mac Conkey, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las
colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
• Agar SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las
colonias que son SH2.
• En Agar manitol y Agar Sabouraud, observar el desarrollo de colonias y anotar las características.
• Agar triple azúcar hierro (TSI), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el medio
un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro
• Lisina descarboxilasa (LIA), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y
producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la producción de aminas, pH=5.2 (color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador
púrpura de bromocresol]
• Caldo peptona, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovacs
tornándose rojo grosella.
• Citrato de Simmons, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de
energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo
(color verde).
• Caldo rojo de metilo, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo.
Cuando hay producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo
color amarillo).
• Caldo Voges Proskauer, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos
cuando se le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil- carbinol. Positivo (color
rojo), negativo (color amarillo).
• Prueba citocromo oxidasa agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y observar
a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario no habrá
ningún cambio de color Coloración de Gram observar los bacilos Gram negativos.
• Suero fisiológico y lugol observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando
objetivos de 40 aumentos.
1. ¿Cuáles son los criterios para solicitar un coprocultivo?
2. ¿Cuál es el procedimiento para la toma de muestra de heces?
3. ¿Qué bacterias pueden ser aisladas en heces patógenas?
4. ¿Cuál es la importancia del uso del agar Salmonella Shiguella o agar SS?
5. ¿Por qué es importante la utilización del caldo MR-VP?
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GÉNERO

PSEUDOMONAS
OBJETIVO Identificar bacterias del género Pseudomonas
• Reconocer a los microorganismos bacilos Gram negativos.
• Diferenciar a los miembros del género Pseudomonas.
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
La especie Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con flagelos
polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes para su
desarrollo “In Vitro”.
Pseudomonas aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,

principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales,
esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo
de vida fatales.
La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.
aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceína y desarrollan
bien a 42°C.
• Pseudomonas aeruginosa en caldo nutritivo.
• Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
• Pseudomonas aeruginosa en Agar nutritivo en Placa Petri
• Pseudomonas aeruginosa en Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
• Pseudomonas aeruginosa en Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100
• Pseudomonas aeruginosa en Medio TSI
• Reactivo de Oxidasa
• Frasco con formol
• Set de colorantes Gram
• Ph metro
c. ACTIVIDADES
1. Hacer un frotis a partir de la cepa P. aeruginosa y colorear por el método de Gram.

2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas conocidas.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
Pruebas primarias de identificación:
Prueba de Oxidasa: oxidasa positivo

Oxidación/fermentación de la glucosa: Se utiliza el medio Hugh y Leifson y se siembra por puntura y
por duplicado, cubriendo uno de los tubos con parafina liquida estéril, de manera tal que se aislé de
la presencia de O2
Producción de lisina descarboxilasa: Agar LIA vira a color violeta (Indicador purpura de
bromocresol) cuando se produce la enzima, transformando la lisina en cadaverina (pH alcalino).
Producción de pigmentos: las colonias crescen sobre Agar King. Muchas espécies de
Pseudomonas producen un pigmento difusible de diferentes colores.
Pruebas complementarias:
Para diferenciar entre espécies es recomendable realizar las pruebas de Indol, hidrólisis de gelatina,
MR-VP, producción de arginina dihidrolasa, ureasa, reducción de nitratos, acción sobre la leche
tornasolada, sensibilidad a O/129 y motilidad (coloración de flagelos).
Completa la tabla en anexo, realiza los esquemas de los revisado en práctica.
CARACTERÍSTICAS Pseudomonas aeruginosa

Agar Mac Conkey
TSI
Agar nutritivo – pigmento
Prueba de Citocromo –
oxidasa
Solubilidad cloroformo -
piocianina
Agar semisólido
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE
OBJETIVO Identificar bacterias del género Vibrio

• Reconocer a los microorganismos bacilos Gram negativos.
• Diferenciar a los miembros del género Vibrio.
LOGRO A MEDIR
confirmativas
a. MARCO TEÓRICO
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las
de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus, causante
de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas, celulitis; y
V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas
o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin
cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato,
sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
• Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus
• Tubos con TSI
• Tubos con LIA
• Tubo con Caldo peptonado
• Tubo con MR-VP
• Tubo con Citrato de Simmons
• Desoxicolato de sodio al 0.5 %
• Set de coloración de Gram
• Muestras: heces diarreicas u otras muestras clínicas, pescado, alimentos a base de produtos
hidrobiológicos, água marina o Dulce
• Microscopio
• Papel lente
• Algodón
c. ACTIVIDADES
Procedimiento y lectura:
1. En Agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares,
de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a partir de la
utilización de la sacarosa)
2. En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto
verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)
3. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la
sacarosa, no produce H2S.
4. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol.
5. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.
6. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol
7. Oxidación y fermentación de la glucosa presenta metabolismo fermentativo, acidificando el medio
Hugh Leifson sin producción de gas
8. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio
9. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
10. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de Desoxicolato
sobre una lámina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V.
cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una
cuerda larga” que se torna más pegajosa después de 60 segundos más.
11. Para el caso de Vibrio cholerae es necesario la utilización de un sueropolivalente para la
identificación del serogrupo O1 y sueros monovalentes para los serotipos Ogawa e Iwaba.
Medios Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus

Acidez en superficie y Acidez en superficie y
TSI profundidad profundidad
LIA Positiva Positiva
VP 10-50% Positiva Negativo
MR Negativo Negativo
Indol Positiva Positiva
Citrato Negativo Negativo
Urea Negativo Negativo
Oxidasa Positiva Positiva
Catalasa Positiva Positiva
Prueba de la cuerda Positiva Negativo
1. ¿Qué medios cromogénicos existen para la identificación de Vibrio cholerae, explique el

fundamento de estos.?
2. ¿Cuál es la interpretación de una prueba de “Cuerda positiva” para Vibrio Cholerae?
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HAEMOPHILUS
OBJETIVO Identificar bacterias del género Haemophilus
• Reconocer a los microorganismos coco - bacilos Gram negativos.
Diferenciar a los miembros del género Haemophilus.
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
Haemophilus es un coco bacilo gramnegativo pequeño que mide 0,2-0,3 por 0,5-0,8 µm, inmóvil, no
formador de esporas, En la tinción de Gram pueden verse pleomórficos y Gram variables. Se describe
satelitismo, ya que crece alrededor de colonias de S. aureus hemolítico (fuente de factor V).
• Cepa de Haemophilus influenzae en caldo nutritivo.
• Caldo Tripticasa soya en tubo de 16 x 15
• Agar nutritivo en Placa Petri
• Agar chocolate
• Agar sangre
• Factor de crecimiento X y V
• Discos de sensibilidad: cloranfenicol, trimetropin-sulfametoxazol, ampicilina.
• Peróxido de hidrógeno
• Caldo úrea
• Agar úrea
• Set de colorantes Gram
• Láminas portaobjeto
• Microscopio
• Papel lente
• Algodón
c. ACTIVIDADES
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Haemophilus influenzae y colorear por el método de Gram.
2. Sembrar la cepa de H. influenzae en los dos medios de cultivo y con los factores de crecimiento.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
4. Lectura de placas en agar sangre, agar chocolate y medición de los halos de inhibición.
¿Por qué se utiliza el agar chocolate para el aislamiento de Haemophilus?
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO

OBJETIVO Aplicar la técnica del urocultivo para identificar microorganismos. causantes
de infecciones del tracto urinario (ITU).
LOGRO A MEDIR Reconoce a los microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario
(ITU).
a. MARCO TEÓRICO
El urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patógenos
causantes de una infección urinaria.
Para la obtención de muestras debe considerarse:
a. La recolección debe ser con un mínimo de contaminación.

b. Establecer el momento óptimo para la recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad
de recuperar microorganismos causales.
c. Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo necesarias.
d. Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.
e. La muestra debe ser procesada dentro de las 2 horas después de haber sido obtenida o debe
refrigerarse a 4 °C (máximo 24 horas) hasta su procesamiento. Si tardará más de 30 minutos en
llegar al laboratorio, la muestra debe ser colocada en un envase rodeado de hielo.
Normalmente la orina es estéril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminación por
lo que se realiza de rutina el urocultivo cuantitativo, con el que se discrimina si la muestra es patológica
o se contaminó durante la toma de la muestra:
1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml, se considera como contaminantes, siendo la
muestra negativa.
2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infección urinaria.
3. Si el número de gérmenes oscila entre 10,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será
necesario repetir el cultivo.
Como se indicó, la orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la
recolección para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el
antibiograma correspondiente.
• Muestra de orina correctamente recolectada
• Sedimento de orina
• Agar Mac Conkey, medio hipertónico de Chapman (agar Manitol), agar saboraud, en placas.
• Tubos con medio TSI, LIA, caldo peptonado, MR-VP, agar citrato deSimmons,
• agar urea de Christensen.
• Tubo de suero fisiológico 0.85%
• Asas calibradas de 10 ul o 100 ul
• Pipetas de 1 ml estériles
• Bocal con desinfectante
• Baño Maria
• Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
• Serie de colorantes de Gram
• Láminas portaobjetos y laminillas
• Refrigeradora
• Papel lente
• Mechero Bunsen
• Algodón
c. ACTIVIDADES
PROCEDIMIENTO PRIMER DÍA:
1. Estudio de las características macroscópicas. Describir el aspecto de la orina: Color (amarillo,

oscuro, castaño o incoloro). Señalar si la orina es clara o turbia.
2. Estudio de las características microscópicas
a. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al microscopio
con objetivos de 10X y 40X
b. Realizar un frotis y colorear por el método de Gram y Ziehl- Neelsen
3. Siembra de la muestra de orina:
a. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersiónagotamiento en las placas
con agar Mac Conkey, agar Manitol y agar Sabouraud.
4. Método de asa calibrada: seguir el siguiente procedimiento
5. Esterilizar el asa calibrada de 10 l o 100 l, en el mechero y luego enfriarlo. Introducirlo en la
orina total (no centrifugado).
6. Agitar con la misma asa la muestra de orina y tomar una cantidad (0.01 l, 0.001 l) para el
sembrado.
7. Se siembra esta muestra de orina en las placas de agar Mac Conkey y otra con el agar nutritivo.
8. Una vez solidificado el agar, incubar a 37°C por 18- 24 horas
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales, cilindros.
2. En los frotis coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes (en caso de
infección por Mycobacterium).
SEGUNDO DÍA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de agar MacConkey el crecimiento

de colonias lactosa positivas; en las placas de agar manitol, el desarrollo de colonias resistente
a altas concentraciones de sales, y en el agar Sabouraud, si hay presencia de levaduras.
2. En la siembra por asa calibrada, observar el desarrollo bacteriano en las placas y contar el
número de colonias. Se establece el número de unidades formadoras de colonias (UFC), que en
este caso por utilizar una asa calibrada de 10 l o es 100 l, se multiplica por 100 o 1000
respectivamente.
3. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar laspruebas diferenciales en la serie bioquímica
respectivamente: TSI, caldopeptonado, MR-VP, citrato de Simmons, LIA y úrea de Christensen.
Incubar a 37°C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana. El antibiograma se realiza tomando 5 colonias del agar Mac Conkey, se prepara una
suspensión en un tubo con suero fisiológico al 0.85%, y se determina la concentración mínima
inhibitoria (MIC) del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del
antibiótico alcanzado en el suero o en foco de infección. El método de disco-difusión estandarizado
[Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el laboratorio.
1. Elaborar el algoritmo empleado para el aislamiento e identificación de los agentes causales de
las infecciones del tracto urinario (ITU).
2. ¿Por qué es importante la correcta toma y transporte de la muestra de orina para el urocultivo?
3. ¿Por qué es importante incluir el agar Mc ConKey en el urocultivo?
4. Tomando en cuenta la observación del sedimento urinario, ¿cuándo se considera que el paciente
presenta una ITU?
Se espera que el estudiante conozca la utilidad de la técnica del urocultivo para identificar
microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario (ITU), incluyendo el antibiograma.
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL (Venereal

Disease Research Laboratory) o RPR (Rapid Plasma Reagin)
OBJETIVO Aplicar la prueba de VDRL o RPR para de determinación de sífilis.
• Reconocer a los microorganismos espirilares.
• Diferenciar a los miembros del género Treponema.
LOGRO A MEDIR
confirmativas.
a. MARCO TEÓRICO
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares móviles,
dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres géneros de
microorganismos patógenospara el hombre: Treponema (T. pallidum, causa la sífilis, T. pertenue,
produce elpián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebrerecurrente,
B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira, que comprende más de veinte especies,
origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis, produce el síndrome de Weill.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 2  de ancho y 5 a
15  de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de anilina y es
difícil su cultivo en medios artificiales.
• Suero problema
• Laminas excavadas
• Antígeno VDRL o RPR
• Pipetas graduadas
• Baño maría
• Microscopio binocular
• Alcohol 70°
• Algodón
c. ACTIVIDADES
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
Observación directa: Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos
tisulares) pueden observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles
características.
Inmunofluorescencia: usando suero anti-treponema marcado con fluoresceína.
Pruebas serológicas para sífilis: estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no
treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey).
Prueba de floculación (VDRL): el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene 0.03% de
cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba está basada en que las partículas
del antígeno lípido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina
con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antígenos).
Prueba de aglutinación (RPR): en la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las "reaginas"
presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por acción de
estas con el antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partículas de carbón. La
reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de
carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el
agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra.
PROCEDIMIENTO (VDRL)
• Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero inactivado (baño María a 56°C x 30 minutos) sobre la
lámina excavada.
• Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos.
• Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de flóculos cuando la
reacción es positiva.
PROCEDIMIENTO (RPR)
I. PRUEBA CUALITATIVA
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada uno de
los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico provisto: muestra o controles 1
gota (50 l). Con el extremo cerrado del gotero distribuirla muestra uniformemente en todo el círculo.
Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo: reactivo A 1 gota
(17 l)
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con agitador
rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación al cabo de
este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados.
II. PRUEBA SEMICUANTITATIVA

Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de la
misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última dilución
que se observe reactiva.
RESULTADOS
N (No reactivo) ……………….. Ausencia de flóculos
RD (Reactivo débil) ……………….. Flóculos pequeños
R (Reactivo) ……………….. Flóculos medianos y grandes
Cuestionario:
1. Elaborar el algoritmo empleado para la aplicación del VDRL.
2. ¿Por qué se utiliza el microscopio de campo oscuro para observar la presencia de los
treponemas?
3. ¿Por qué para las pruebas de VDRL y RPR se utiliza como antígeno la cardiolipina purificada del
corazón de buey?
4. ¿Qué función cumplen las partículas de carbón presentes en la prueba del RPR?
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de las pruebas de VDRL y RPR
empleadas para el diagnóstico de laboratorio de la sífilis.
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DEL GÉNERO LEPTOSPIRA

OBJETIVO Conocer las características del género Leptospira y los métodos diagnósticos
de la leptospirosis.
LOGRO A MEDIR
• Reconocer a los microorganismos espirilares
• Diferenciar a los miembros del género Leptospira
• Identificar a los microorganismos mediante pruebas serológicas

generales y moleculares
a. MARCO TEÓRICO
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µmy 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos
semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la familia Leptospiraceae, orden Spirochetales;

comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi, L.
santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y más de 200 serovares saprofitos
comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades
antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de
restricción o la composición de su DNA.
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores
y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente
etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser directo
(orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material contaminado. La
puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas incluyendo la
conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y coloración
de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al microscopio de campo
oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos enriquecidos con suero de conejo o carnero al
8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en condiciones de aerobiosis. Se hacen
observaciones semanales, hasta cuatro semanas, dado el lento crecimiento de las leptospiras.
Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
• Aislamiento de la leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina)

en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.
• Evidencia serológica en sueros pareados del paciente (15 días de diferencia), con incremento
cuádruple del título de diagnóstico inicial de 1:100. Se utiliza la técnica de referencia MAT
(Técnica de Aglutinación Microscópica).
• Cultivo de leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado
• Lámina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
• Papel lente
• Mechero Bunsen
• Láminas portaobjeto
• Varillas para coloración Gram
• Algodón
c. ACTIVIDADES
La práctica se desarrolla de forma grupal y de acuerdo a la metodología de la asignatura.
Observación del crecimiento en cultivo:
En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las leptospiras en todo el
tubo y la formación de un anillo blanquesino a unos milímetros de la superficie del medio.
En la observación al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como filamentos
blancos sobre un fondo negro; realizan rápidos movimientos de translación, rotación y alrededor de
su eje.
Observación con coloraciones:

En la coloración de Kiktenko, las leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta enfondo incoloro,
presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los extremos en
forma de semigancho y con las espiras bien unidas. Con la coloración de Fontana Tribondeau, se
observan de color marrón.
Cuestionario
1. Indique el tipo de muestra que se utiliza para el aislamiento de las leptospiras,
2. considerando el momento ideal para su toma, según la fecha de inicio de los síntomas.
3. ¿Por qué se utiliza el microscopio de campo oscuro para observar la presencia de las
leptospiras?
4. Cuáles son las coloraciones empleadas para la observación microscópica de las leptospiras y
por qué se emplean cada una de ellas.
5. Cuáles son los principios de la prueba confirmatoria de referencia MAT (Técnica de aglutinación
microscópica).
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los métodos diagnósticos de la leptospirosis.
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS COLOREADAS
OBJETIVO Conocer los diversos métodos de aislamiento de los virus.
LOGRO A MEDIR • Diagnosticar la infección por virus.
• Conocer los diversos métodos de aislamiento directo o indirecto
• Demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como
se deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el
ser humano
a. MARCO TEÓRICO
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos).
En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano; debido
a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado,
los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las enfermedades
producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.). Dado que los
virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y multiplicación deben
necesariamente utilizar los sistemas de las células que parasitan y por ello se denominan parásitos
intracelulares obligados.
En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las
infecciones virales, así como drogas antivirales específicas para muchos virus.
Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican en
el interior de las células vivas, para su cultivo in vitro es necesario el empleo de métodos especiales
en el laboratorio de virología, tales como:
Métodos indirectos:
a) Cultivos víricos en tejidos humanos o animales: Los virus necesitan células vivas para replicarse.
Muchos virus se replican de forma activa en cultivos celulares. Los sistemas de cultivo celular son
monocapas de células vivas que sostienen el crecimiento de los virus. La replicación del virus se
detecta mediante el efecto citopático en la monocapa celular. Se denomina efecto citopático a las
alteraciones morfológicas características visibles en una línea susceptible debido a la replicación del
virus. Existen varios sistemas celuares, siendo las líneas celulares continuas más utilizadas las HeLa
y la HEp-2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7151762/)
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad alantoidea y saco

vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, hámsters, monos)
d) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones:
Inmunohistoquímica.
Métodos indirectos:
a. Serología o demostración de anticuerpos frente al virus: ensayos inmunoenzimáticos (ELISA).

b. Detección de ácidos nucleicos: La hibridación in situ (HIS) y la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
• Huevos embrionados de 7-9 días.
• Huevos embrionados de 10-12 días.
• Lamina de células normales, rabia, Enterovirus –Virus polio, Herpes simple, Citomegalovirus,
adenovirus en células HEP-2
• Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.
• Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
• Colorante azul de metileno al 1% con agua destilada
• Frascos con alcohol yodado
• Algodón
• Ovoscopio
• Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
• Equipo de disección (pinzas, tijeras curvas, guantes)
• Líneas celulares LLC-MK2, Vero-76 o Vero-6
• Medio Eagle modificado Dulbecco´s (DMEM).
• Suero bovino fetal (SBF) al 10%
• Penicilina-estreptomicina al 1%.
c. ACTIVIDADES
AISLAMIENTO VIRAL CON HUEVOS EMBRIONADOS
COLORANTE POR VÍA ALANTOIDEA:

a. Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos fertilizados de 10-12 días.
b. Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevosembrionados.
c. Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de 45° e
inocular 0.2 ml de colorante.
d. Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33- 35°C por
2-4 días, luego cosechar y observar.
INOCULACIÓN POR VÍA AMNIÓTICA:
a. Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días.

b. Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del embrión
y hacer una perforación rectangular de 0.5cm, con el punzón.
c. Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
d. Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana amniótica,
formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de
metileno o del inoculo problema.
e. Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
f. Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 3335°C
por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
INOCULACIÓN DEL SACO VITELINO:
a. Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo
embrionado de 6-7 días.
b. Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.
c. Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la
aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
d. Sellar la abertura.
Vías de inoculación según el tipo de virus
https://microbiologyinfo.com/techniques-of-virus-cultivation/
Vías de inoculación más comunes
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión (efecto

citopático). Estas estructuras pueden encontrarse en el citoplasma y su localización es específica de la
enfermedad viral. Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto citopático) como conglomerados de
virus asociados a una reacción de la célula infectada.
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:
1. Cultivo de células normales: coloreadas con Hematoxilina eosina (HE),no se tiñe de rosado el
citoplasma.
2. Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusioneseosinófilas
intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración celular,
el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el borde de la célula.
4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las inclusiones
eosinófilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
2. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en “ojos de
lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).
3. Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las inclusiones
basófilas intranucleares.
Cuestionario:
1. Indica las ventajas y las desventajas de la técnica de aislamiento viral con la técnica de huevos
embrionados.
2. Indica las ventajas y las desventajas de la técnica de aislamiento viral con la técnica de cultivo
celular.
3. Dibuja los efectos citopáticos producido por los siguientes virus:
a. Virus de la rabia
b. Virus Polio
c. Citomegalovirus
d. Adenovirus
Al culminar la práctica, los estudiantes identifican los métodos de aislamiento viral
DIAGNÓSTICO DE COVID-19
OBJETIVO Aislar el virus SARS-CoV-2 a partir de una muestra clínica para la confirmación
del diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Disponer del aislamiento el virus SARS-CoV-2, a partir de la muestra de un
paciente.
a. MARCO TEÓRICO
Los coronavirus pertenecen a la familia Coronaviridae, que tiene dos subfamilias, una de las cuales
son los Orthocoronavirinae, que son virus ARN de una sola cadena de sentido positivo. El tamaño de
los genomas varía entre 26 a 32 kilonucleótidos, siendo uno de los virus de tipo ARN positivos de
mayor tamaño (Zheng, 2020). Tienen una nucleocápside de simetría helicoidal con una envoltura que
tiene unas estructuras glicoproteícas que parecen una corona de puntas (por ello llamado coronavirus)
y es el más insidioso entre su clase. El virus puede medir de 120 a 160 nm de diámetro (Cortellis,
2020, p.15).
Los coronavirus pueden producir enfermedades respiratorias y digestivas tanto en aves, como en
mamíferos, incluyendo al hombre, en el cual pueden producir enfermedades, desde un resfriado
común a cuadros más severos como bronquitis, bronquiolitis y neumonía. El cuadro clínico complica
fundamentalmente el aparato respiratorio inferior y, aunque se producen muchas infecciones por este
grupo de virus, ya se han descrito dos epidemias grandes, el síndrome respiratorio agudo grave por
coronavirus (SARS-CoV) en el 2002 y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) en el
2012, hasta que en diciembre del 2019 apareció en China el SARS-CoV-2 o COVID-19 (Sun et al.,
2020b).
Fig 1. Morfología ultraestructural del coronavirus.

Fuente: CDC
• Muestra biológica: Aspirado nasofaríngeo y sangre.
• Líneas celulares LLC-MK2, Vero-76 o Vero-6 (líneas continuas de células).
• Medio Eagle modificado Dulbecco´s (DMEM).
• Suero bovino fetal (SBF) al 10%.
• Penicilina-estreptomicina al 1%.
• QIAamp Viral RNA Mini Kit™
• qScript XLT 1-Step RT-qPCR Tough Mix™
• Kit Rapid Diagnostic Test.
• Lanceta retractil.
• Algodón.
• Alcohol medicinal.
• Plumón indeleble.
• Frascos de cultivo celular 25 cm2.
• Micropipetas automaticas
• Microscopio binocular
• Microscopio Estereoscópico
• Gabinete de Bioseguridad Nivel III (Cabina Horizontal)
c. ACTIVIDADES
PROCEDIMIENTO:
a. Muestra
• Aspirado nasofaríngeo.
• Sangre
Toma de muestra:
- Recolectar con sonda.
- Siempre en solución
salina 0.85% (1.5-2.0 ml).
Toma de muestra:
- Desinfectar el dedo.
- Pinchazo en el dedo
con la lanceta.
b. Aislamiento viral
• Trabajar en un laboratorio nivel de bioseguridad 3 (BSL-3).

• Emplear las líneas celulares LLC-MK2, Vero-76 o Vero-E6 con susrespectivos
controles(sin inoculo).
• Colocar las células en frascos de cultivo conteniendo DMEM (Dulbecco’s Modified
EagleMedium) + SBF 10% + penicilina-estreptomicina 1%.
• Habiendo alcanzado una confluencia celular del 80%.
• Inocular 80 µL de la dilución del aspirado nasofaríngeo (en 1ml DMEM).
• Incubar a 37 °C con 5% de CO2. durante 90 minutos.
• Agitar suavemente cada 15 minutos.
• Subcultivar el inoculo en 5mL de medio DMEM + 2% SBF + 1% penicilina-
estreptomicina.
• Observar diariamente al microscopio invertido el efecto citopático.
c. Detección por PCR-RT
• Extraer RNA viral a partir del aspirado nasofaríngeo y del sobrenadante del
cultivo celular mediante el QIAamp Viral RNA Mini Kit™
• La transcripción inversa y posterior amplificación del genoma viral se hizo en un
solo paso empleando el qScript XLT 1-Step RT-qPCR Tough Mix™ con los
oligonucleótidos y sondas específicos para el gen N1.
d. Prueba inmunocromatográfica
• Obtener la muestra de sangre por punción capilar.

• Verificar la fecha de vencimiento del dispositivo de prueba (kit).
• Codificar el casette, colocar la hora de inicio de la prueba y hora final.
• Dispensar una gota de sangre extraída en el pozo de muestra redondo (10 µl).
• Añadir dos gotas del diluyente en el pozo correspondiente.
• Realizar la lectura de resultados en 10 minutos.
Cuestionario:
1. ¿Por qué el aislamiento viral debe realizarse en un laboratorio de bioseguridad grado 3?
2. ¿Cuál etapa del COVID es el adecuado para realizar el aislamiento del SARS-CoV-2?
Justifique su respuesta.
3. Indique las ventajas y desventajas de la PCR_RT para el diagnóstico del COVID.
4. Indique las ventajas y desventajas de la prueba inmunocromatográfica para el diagnóstico del
COVID.
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de los métodos de diagnóstico del
COVID-19.
DIAGNÓSTICO DE LA RABIA - OBSERVACIÓN DE LÁMINAS
OBJETIVO Detectar el virus de la rabia mediante la técnica de inmunofluorescencia
directa e inoculación en animales delaboratorio.
LOGRO A MEDIR • Conoce la técnica de inmunofluorescencia directa para detectar el virus
de la rabia.
• Conoce la técnica de inoculación en animales de laboratorio paraaislar el
virus de la rabia.
a. MARCO TEÓRICO
La rabia es una enfermedad neurológica mortal que afecta una amplia variedad de hospederos
mamíferos incluyendo al hombre, y su transmisiónestá asociada a especies hospederos, comúnmente
carnívoros y quirópteros. Aunque la vacunación y la terapia con anticuerpos es efectivaen el
tratamiento post-exposición, se estima al menos 59 000 muertes humanas anuales causada por rabia
canina, siendo las áreas más afectadas África y Asia.
El virus se encuentra en el sistema nervioso, saliva, orina, linfa, leche y sangre. Puede cultivarse en
embriones de pollo, ratones recién nacidos, así como en cultivo de células de riñón de hámster o de
células diploides de origen humano.
El diagnóstico de rabia debe realizarse por medio de estudios de laboratorio, ante todo, mediante
inmunofluorescencia directa, que se ha considerado la prueba ideal. Además, la lesión histopatológica
de la rabia es patognomónica, es decir, la presencia de cuerpos de Negri en el citoplasma de las
neuronas confirma el diagnóstico. No obstante, en muchos casos el diagnóstico se hace clínicamente
debido a que durante elinicio del cuadro clínico se presentan los signos característicos que le confieren
el nombre de “derriengue” a la enfermedad.
En el Perú, los principales reservorios del VR son los canes (rabia urbana)y murciélagos hematófagos,
Desmodus rotundus (rabia silvestre), los cuales mantienen ciclos independientes de transmisión.
Según los reportes del Laboratorio de Zoonosis Virales del Instituto Nacional de Salud (INS), 80 casos
de rabia urbana fueron notificados en los departamentos de Madre de Dios, Piura, y Puno, durante el
periodo 2010-2014; cinco casos en humanos, nueve en diversas especies (bovino, llama, y gato) y 66
casos en canes, este último con un promedio de 14 casos al año.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE CEREBRO, CEREBELO Y MÉDULA
• Tijera de disección.
• Bisturí.
• Pinzas diente de ratón.
• Placa Petri
• Guantes de cirugía.
• Mandil.
• Recipiente con desinfectante (solución jabonosa).
TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENO RÁBICO
• Solución salina tamponada, pH 7,2-7,4.

• Conjugado antirrábico diluido 1/5 con CRN al 20%.
• Conjugado antirrábico diluido 1/5 con CVS al 20%.
• Acetona Q.P.
• Aceite de inmersión (Merck) ND 1,515 o glicerina pura.
• Portaobjetos pavonados en un extremo.
• Pipeta de transferencia o gotero.
• Agua destilada.
• Destilador de agua.
• Beaker de 1000 ml.
PRUEBA BIOLÓGICA DE INOCULACIÓN EN RATONES (Video Demostrativo de la Práctica)
• Cinco a ocho ratones albinos suizos cepa Balb-C (21 días y 11-14 g de peso).
• Mortero y pilón (fríos).
• Diluyente (agua destilada, 2% suero equino, 1000 UI penicilina y 2 mg de estreptomicina/ ml).
• Tubo de ensayo 12 x 75.
• Jeringa (tuberculina) de 1 ml (una jeringa por muestra).
• Aguja 27 x 1/2’’.
• Recipiente para descartar agujas.
• Pinza y tijera.
• Jaulas de ratones de metal o polipropileno con sus respectivas rejillas.
• Refrigeradora
• Centrifuga
c. ACTIVIDADES
OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE CEREBRO, CEREBELO Y MÉDULA (VIDEO DEMOSTRATIVO
DE LA PRÁCTICA)
1. Sujetar con una pinza diente de ratón la piel de la parte posterior de la cabeza y realizar un corte
con la tijera aperturando la piel, para luego extender el corte longitudinalmente hasta la altura de
las órbitas de los ojos.
2. Sujetar con la pinza diente de ratón la cabeza del animal tomándolo por las órbitas y penetrar por
la parte posterior del cráneo con la punta de la tijera, cortando alrededor del cráneo.
3. Retirar la tapa del cráneo, dejando de esta manera expuesto el cerebro.
4. Con la tijera a medio abrir, levantar el cerebro cortando la base, teniendo la seguridad de incluir
el cerebelo al momento de retirar la masa encefálica.
5. Rotular la muestra con el código correspondiente.
TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIÓN

DE ANTÍGENO RÁBICO ((VIDEO DEMOSTRATIVO DE LA PRÁCTICA)
PROCEDIMIENTO
1. Codificar las fichas con el código del laboratorio y el respectivo día de procesamiento, así como
su ingreso en el registro de muestras para diagnóstico de rabia.
2. Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se procederá a realizar un lavado utilizando
suero fisiológico (solución salinaestéril 0,09%).
3. Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo.
4. Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolución caudal cortando
paralelamente a la línea que divide ambos hemisferios. El corte se extenderá de 3 a 5 cm hacia
delante, profundizándose hasta ubicar el ventrículo lateral a nivel de una estructura de color
blanco nacarado en forma de cuerno, que sobresale lateralmente del suelo del ventrículo. Esta
estructura es el hipocampo o asta de Ammon, que al corte transversal muestra una estructura
típica de contorno espiralado (“pionono”).
5. Se realizarán dos cortes más, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el cerebelo, siempre
procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm.
6. Realizar dos láminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo.
7. Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel secante o filtro y
éste sobre un bajalengua.
8. Tomar un portaobjeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una cruz. Realizar dos
impresiones en cada lámina procurando que la impronta no sea muy gruesa. Si la impronta fuera
muy gruesa, se podrá adelgazar presionando la impronta sobre el papel filtro.
9. Colocar las láminas secas en un coplin con acetona fría (-20ºC) por un mínimo de 30 minutos.
10. Una vez seca la impronta, se procederá a delinear los bordes de ambas improntas con un
corrector líquido (liquid paper).
11. Diluir el conjugado antirrábico previamente titulado 1/5 con la suspensión de CRN o agua
destilada.
12. Diluir el conjugado antirrábico con la suspensión de CVS 1/5.
13. Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la improntamás cercana del extremo
pavonado o que contenga el código.
14. Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la improntamás alejada del extremo
pavonado.
15. Llevar a la estufa a 37°C por 30 minutos.
16. Lavar con solución salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por10 minutos.
17. Lavar con agua destilada.
18. Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersión o glicerina pura, sin colocar laminilla a la
impronta.
19. La observación de las láminas se iniciará en el extremo superior izquierdo y proseguirá hacia la
derecha y luego hacia abajo, asegurando la observación ordenada de toda la impronta.
PRUEBA BIOLÓGICA DE INOCULACIÓN EN RATONES PROCEDIMIENTO
1. Ingresar los números de muestra en el formato de registro de ratones (fecha de inoculación, fecha
de termino de prueba y resultado de IF).
2. Lavar las muestras con solución fisiológica o con agua destilada, si ésta ha sido recepcionada
con glicerina al 50% .
3. Colocar en un mortero estéril 0,3 g de la muestra (incluyendo asta, corteza y cerebelo) y
homogenizar.
4. Agregar 1,2 mL de diluyente y homogenizar nuevamente, obteniendo una suspensión al 20%.
5. Vaciar en un tubo de ensayo 12 x 75 mL.
6. Dejar reposar por una hora en la refrigeradora, aunque también se pueden preparar las
suspensiones la tarde anterior, dejándolo refrigerado para que el virus drene de las células.
7. Centrifugar a 4ºC a 2000 r.p.m. por 10 minutos.
8. Mantener permanentemente las suspensiones en frío.
9. Inocular 0.03 a 0.025mL a la altura de la sien del ratón.
10. Examinar diariamente a los ratones por 21 días.
11. Anotar en la ficha cada día el número de ratones normales, enfermos o muertos.
12. Generalmente los ratones inoculados con muestras positivas empiezan a manifestar los primeros
síntomas a partir del décimo al décimo segundo día de inoculación. Primero mostrarán
erizamiento, seguido de parálisis progresiva, postración y muerte.
13. Una vez que estén postrados, se sacrifican con cloroformo en un envase hermético y se les
extrae el cerebro.
14. Realizar la prueba de inmunofluorescencia directa para la detección del antígeno rábico.
Cuestionario:
1. ¿Qué grado de bioseguridad debe tener el laboratorio que realice la toma de muestra
2. para el diagnóstico de la rabia? Justifique su respuesta.
3. ¿Por qué se utiliza como muestra para el aislamiento del virus de la rabia el hipocampo,
corteza cerebral y cerebelo?
4. ¿Cuáles son las ventajas de desventajas de la técnica de inmunofluorescencia directa para
la detección del antígeno rábico?
5. ¿Cuáles son las ventajas de desventajas de la prueba biológica de inoculación de ratones
para el diagnóstico de la rabia?
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de los métodos de diagnóstico de rabia.
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVO Reconocer a los hongos ambientales causantes de infeccionesrespiratorias
y alérgicas.
LOGRO A MEDIR • Reconocer las características macroscópicas de los cultivos de los
principales hongos ambientales.
• Reconocer las características microscópicas de los principales hongos
ambientales.
a. MARCO TEÓRICO
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a expensas
de la materia inerte existente, la mayoría se encuentra como saprofito, otros pueden ser causantes
de inducir hipersensibilidad así como también ser responsables de infecciones. Entre los hongos
ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,
Helmintosporium, Rhodotorula.
• Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Rhodotorula
y Helmintosporium.
• Láminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
• Papel lente
• Mechero Bunsen
• Algodón
c. ACTIVIDADES
1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio
aéreo, aspecto de la colonia, producción depigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscópico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las características
microscópicas de cada uno de los hongos preparados en las láminas con azul de lactofenol.
CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES:

Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo con la especie en: amarillo, verde azufrado,
marrón o negro.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas que forman conidióforos no tabicados que se ensanchan
en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde
salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en cuyo extremo se hallan
los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium
Colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado ó violeta en la superficie.
Microscópicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidióforos, macroconidias septadas y
alargadas, fusiformes.
Rhizopus
Colonias de micelio aéreo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisáceo. Microscópicamente
presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos 121 sporangióforos que
terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio aéreo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias hialinas
agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada
de color gris.
Microscópicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre
conidióforos cortos y nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.
Realice un dibujo de las imágenes observadas en el microscopio de las estructuras de cada uno de
los hongos ambientales estudiados.
Al culminar la práctica, los estudiantes reconocerán las características macroscópicas y microscópicas
de los hongos ambientales estudiados.
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS
OBJETIVO Reconocer a los hongos dermatofitos causantes de infecciones micóticas.
Reconocer las características macroscópicas de los cultivos de los hongos

LOGRO A MEDIR
dermatofitos.
a. MARCO TEÓRICO
Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del cuerpo
como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los invaden,
son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más comunes en los
humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum y
Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o Pitiriasis
versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso de los cabellos,
barba y bigote.
Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum
gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).
• Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M.canis, M. gypseum y E.
floccosum.
• Lámina con azul de lactofenol de cada uno de los hongosmencionados.
• Láminas preparadas de M. furfur en hidróxido de potasio al 20%.
• Láminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.
• Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)
• Microscopio Estereoscopio
c. ACTIVIDADES
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos preparados
en láminas.
CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio aéreo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento
de color púrpura. Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a
veces puede observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento
amarillo- pardusco. Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esféricas
agrupadas, pueden presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con pigmentación
amarillo- castaño al reverso. Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas,
clamidosporas, e hifas en raquetas septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela. Al microscopio se observan hifas
septadas, macroconidios con tabiques transversales en número de 4-6, rara vez se observan
microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia. Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y
con pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse microconidias y
clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3- 4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)

Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas
agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnóstico se da por el
examen directo de la muestra.
Piedraia hortai
Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que
envuelven completamente el tallo piloso.
Realiza un dibujo de las imágenes observadas en el microscopio de las estructuras de cada uno de
los hongos dermatofitos estudiados.
de los hongos dermatofitos estudiados.
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES. OBSERVACIÓN DE CORTES

HISTOPATOLÓGICOS.
OBJETIVO Reconocer a los hongos levaduriformes causantes de infecciones agudas y
crónicas en diferentes órganos en el ser humano.
LOGRO A MEDIR • Reconocer las características macroscópicas de los cultivos de los hongos
levaduriformes.
• Reconocer las características microscópicas de los hongoslevaduriformes.
• Identificar los hongos levaduriformes en cortes histopatológicos.
a. MARCO TEÓRICO
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutáneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras
especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o mucosas, aparato
genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar
infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre la infección primaria es casi
siempre pulmonar.
• Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.
• Láminas de Candida albicans en Agar harina de maíz.
• Láminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
• Cortes histológicos con C. albicans y C. neoformans.
• Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)
• cabina de flujo laminar
• Papel lente
• Mechero Bunsen
• Lamina cubreobjeto
• Algodón
• Asa micológica
• Azul de lactofenol
c. ACTIVIDADES
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y
consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el agar
harina de maíz, tinta china.
3. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en los
cortes histológicos.
CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES

Candida albicans: Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
En el Agar- almidón - arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican a
Candida albicans. En los cortes histopatológicos observar la presencia de filamentos cortos y
levaduras en las lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto
mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la levadura
y el fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones,
las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.
los hongos levaduriformes estudiados.
de los hongos levaduriformes estudiados, tanto en láminas de cultivo como en cortes histopatológicos.
ESTUDIO DE HONGOS DIMÓRFICOS. OBSERVACIÓN DE CORTES HISTOPATOLÓGICOS.

Reconocer a los hongos dimórficos causantes de infecciones mucocutáneas
OBJETIVO
y/o sistémicas en el hombre y algunos animales.
LOGRO A MEDIR Reconocer las características macroscópicas de los cultivos de los hongos.
a. MARCO TEÓRICO
Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporógena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su
fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la para coccidioidomicosis, infección crónica, granulomatosa de la piel,

mucosa, ganglios y vísceras. Es más frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporógena, que se desarrolla principalmente
sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de
murciélagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma benigna
pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la esporotricosis en el hombre y algunos animales,
el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales contaminados
con el hongo. La infección está localizada preferentemente en los ganglios linfáticos.
• Cultivo en agar Sabouraud y agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.
• Microcultivos coloreados con azul de lactofenol
• Cortes histológicos infectados por estos hongos.
• cabina de flujo laminar
• Papel lente
• Mechero Bunsen
• Lamina cubreobjeto
• Algodón
• Asa micológica
• Azul de lactofenol
c. ACTIVIDADES
1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
2. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos.
3. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos presentes en los cortes
histopatológicos.
CARACTERÍSTICAS DE LOS HONGOS DIMÓRFICOS
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotis coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células esféricas
u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con
microconidias esféricas o piriformes.
En agar infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.
Microscópicamente se observan células esféricas, agrupadas en forma de rosetas.
Histoplasma capsulatum
En frotis o cortes histológicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en los
histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeñas, redondas u ovaladas de 1-3 micras de
diámetro.
En agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscópicamente

se observan hifas tabicadas con escasa producción de microconidias y gran cantidad de
macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa “Clamidospora tuberculada”.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón claro.
Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeñas, blanquecinas presentando
posteriormente un aspecto húmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a
negro.
Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en gemación

ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
los hongos dimórficos estudiados.
de los hongos dimórficos estudiados, tanto en láminas de cultivo como en cortes histopatológicos.

G.P. Microbiologia Medica 2024-I

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c. Semestre académico 2024-I

d. Nombre de la asignatura MICROBIOLOGÍA MÉDICA

h. Tipo de curso Obligatorio

i. Pre requisitos BASES MOLECULARES Y CELULARES DE LA MEDICINA II

k. Horas semanales Teóricas 02 Prácticas 04 Total 06

l. Duración del semestre Inicio 11/03/2024 Culminación / /

Docente responsable por Programa de Pregrado

Sede Lima – Local Chorrillos Róger Anibal Gamboa Ruíz

1.3. AMBIENTES ACADÉMICOS

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