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ELISA tipo sándwich

El antígeno queda inmovilizado entre 2 anticuerpos, uno de captura y otro de detección también
conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a 2 epítopos distintos de un mismo antígeno.
El procedimiento sería el siguiente:
1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
2º Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura
3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con
el 5º paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un
anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la
detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
Los ensayos conocidos como ELISA sándwich utilizan 2 anticuerpos específicos contra el antígeno
para capturarlo a manera de emparedado (sándwich) en la placa de detección. En una 1ª etapa, el
antígeno de interés se añade a un anticuerpo primario unido a una placa. Durante una 2ª incuba-
ción, se añade un anticuerpo secundario al complejo antígeno anticuerpo primario formado en el
primer paso. El anticuerpo secundario puede estar directamente conjugado a una enzima que sólo
requiera la adición del sustrato o estar unido a un marcador que requiera la adición de un segundo
compuesto que es el que reaccionará directamente con el sustrato. Cuando se agrega un sustrato
cromogénico al ensayo para desarrollar color, las muestras con una alta concentración de antígeno
generan más señal que aquellas con una baja concentración de antígeno, lo que produce una señal
directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Para estimar la concentración
de antígeno presente en la muestra se extrapolan las mediciones con una curva de calibración.
Los ELISA sándwich son altamente específicos ya que se basan en un par de anticuerpos para la
captura y detección en lugar de fijar de manera directa el antígeno a una placa de plástico, como se
hace en el
ELISA di-
recto. Esto
permite
concentrar
el antígeno
de interés
sobre la su-
perficie de
la placa
aun cuando
esté pre-
sente en
concentra-
ciones muy bajas en la mezcla inicial.
ELISA COMPETITIVO
En este tipo de análisis, la presencia y la cantidad de un antígeno particular en una muestra desco-
nocida se determinan por su capacidad para competir con un antígeno de referencia marcado
para unión a un anticuerpo fijo en una placa. Primero, una cantidad determinada de anticuerpo
no marcado se fija a un grupo de placas y una preparación de estándar de referencia de un antí-
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geno marcado se une a ellas. A continuación se añaden diversas cantidades de muestra no marca-
das y se mide el desplazamiento del antígeno marcado, lo que genera curvas de inhibición caracte-
rísticas. Se obtiene una curva estándar al usar cantidades conocidas de antígeno no marcado idén-
ticas a las usadas en la especie marcada y una comparación con esta curva permite calcular la
cantidad de antígeno en muestras desconocidas. Durante la incubación, las muestras con alto con-
tenido de antígeno dan como resultado que el antígeno no marcado se une en mayores cantidades
que el antígeno conjugado; por lo tanto, cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para
desarrollar color, las muestras con una alta concentración de antígeno generan una señal más baja
que las que contienen una baja concentración de antígeno, lo que produce una correlación inversa
entre la concentración de antígeno en la muestra y el desarrollo de color en el ensayo. Este tipo de
reacción es uno de los pocos métodos posibles para estimar la cantidad de antígenos de bajo peso
molecular con un número limitado de epítopos o sitios de unión a anticuerpos, como moléculas
pequeñas
En los formatos competitivos, el analito sin marcar (generalmente antígeno) en la muestra se mide
por su capacidad para competir con un antígeno marcado en el inmunoensayo. El antígeno sin
marcar bloquea la capacidad del antígeno marcado de unirse, puesto que ese punto de unión en el
anticuerpo ya se encuentra ocupado.
Así, en un inmunoensayo competitivo, el hecho de que se mida menos marca en el ensayo significa
que hay más antígeno marcado (muestra) presente. La concentración de antígeno en la muestra
está inversamente relacionada a la concentración de marca que se mide en el formato competitivo

ELISA competitivo (ELISA de inhibición)

Variante más compleja de la técnica ELISA; usa un antígeno de referencia que competirá con el
antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas cantidades.
El procedimiento simplificado sería:
1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antí-
geno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antí-
geno de la muestra por unirse al anticuerpo
4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
anclado al antígeno de referencia.
6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamen-
te proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra.
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Los ensayos tradicionales de inmunoabsorción enzimática (ELISA) detectan y miden un único

analito por placa. Los inmunoensayos basados en la tecnología xMAP de Luminex utilizan bolitas
magnéticas rellenas con 2 fluorocromos y están conjugadas con anticuerpos específicos que unen
al analito de interés, que a su vez se une con anticuerpos biotinilados, detectables mediante
estreptavidina conjugada con ficoeritrina, emitiendo señal fluorescente. Se pueden detectar
teóricamente y simultáneamente hasta 100 proteínas por muestra en cada pocillo de placa ELISA
(Figura 1).
• Ventajas del método Luminex vs Elisa La tecnología luminex de alto rendimiento produce
resultados comparables a los ensayos ELISA, pero con mayor eficacia, velocidad y rango dinámico.
Los datos obtenidos son de mejor calidad, sin interferencias del muestreo, pipeteos, etc ya que
todos los parámetros se ensayan en la misma muestra a la vez. La cuantificación del ensayo
mediante fluorescencia y las incubaciones en suspensión con la muestra permiten mayor
sensibilidad y rango dinámico que en el ELISA. En los ensayos ELISA la detección se lleva a cabo
mediante reacción enzimática observada colorimétricamente. Además, el multiplexing necesita
menor volumen de muestra, menor mano de obra, y es más económico por analito analizado.

Los tumores en situación metastásica liberan células, y por tanto material genético, en el torrente
sanguíneo. La biopsia líquida —también conocida como test de ADN tumoral circulante o test de
biomarcadores basados en la sangre— detecta las mutaciones específicas de un tumor mediante una
muestra de sangre periférica. Esto evita al paciente trastornos innecesarios y representa un ahorro de
tiempo, ya que los resultados de los análisis estarán disponibles en sólo uno o dos días. Además,
dado que el procedimiento es sencillo, se podrá repetir las veces que los médicos consideren
adecuadas para controlar la evolución de una patología que no es estática sino cambiante. Conocer
mejor la biología y la genética del tumor facilita las decisiones que deban tomarse respecto al
tratamiento, que se podrá adaptar a las características específicas de cada cáncer.