Test With Confidence™

Guía técnica de ELISA

Guía técnica de ELISA
Contenido

1 Introducción
2 Tecnología de ELISA
3 Kits de ELISA
5 Equipo usado en los ELISA
6 Mantenimiento y calibración del equipo
7 Manejo y preparación de reactivos
8 Manejo y preparación de los componentes del kit
9 Control de calidad
10 Manejo de muestras
12 Métodos de pipeteo
15 Tiempos de las placas para ELISA
16 Lavado de las placas para los ELISA
18 Lectura de las placas y gestión de datos
19 Localización y solución de problemas de ELISA
Apéndices
23 A Procedimiento de calibración de micropipetas
24 B Tabla de control de inventario
25 C Tabla de control de laboratorio
26 D Programa de mantenimiento y calibración
27 E Revisión rápida de control de calidad
Guía técnica de ELISA
Introducción

IDEXX fabrica kits de pruebas de diagnóstico para la detección de

enfermedades en rumiantes, caballos, cerdos y aves de corral.
El ensayo inmunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
es una de las tecnologías disponibles más sensibles y reproducibles.
Estos ensayos son rápidos, simples de realizar y fáciles de automatizar.
En 1985, IDEXX lanzó el primer ELISA comercial para el diagnóstico de la
enfermedad infecciosa de la bolsa de Fabricio (infectious bursal disease,
IBD) en aves de corral, y en 1986, el primer ELISA comercial para la
enfermedad de Aujeszky/seudorrabia en ganado, con lo que mejoró la
manera en que los animales de producción son evaluados actualmente en
pruebas de laboratorio.
Al igual que con todo ensayo, la reproducibilidad y confiabilidad de los
ELISA dependen de la técnica correcta y la atención a los detalles. Esta
guía técnica de ELISA aumentará sus conocimientos de las técnicas ELISA
y le ayudará a mantener su nivel de competencia en esta metodología.
Revise el prospecto del paquete para obtener instrucciones específicas
para la realización de cada ensayo. En forma periódica, se realizan mejoras
y modificaciones a los kits y prospectos. Por lo tanto, es importante que
revise el protocolo con regularidad. Si tiene preguntas concernientes a
cualquier parte de la información siguiente, llame a Servicios Técnicos
de IDEXX para solicitar asistencia. En los Estados Unidos, llame al
1-800-548-9997 o al 1-800-943-3999. Fuera de los Estados Unidos, llame
al +1-207-556-4895 y seleccione la opción Soporte técnico de diagnóstico
en ganado y aves de corral [Livestock and Poultry Diagnostics Technical
Support]. O visite nuestro sitio web en www.idexx.com/livestockandpoultry.

1
Guía técnica de ELISA

Tecnología ELISA

El ELISA es una prueba rápida usada para la detección y cuantificación

Los formatos de ELISA proporcionan la
capacidad para:
• Evaluar simultáneamente un gran número de muestras
• Automatizar el procedimiento con robótica u otros
tipos de equipo automatizado
• Computarizar el cálculo y la preparación de
informes de resultados
de anticuerpos o antígenos contra virus, bacterias y otros materiales.
Este método puede ser utilizado para la detección de muchos agentes
infecciosos que afectan al ganado y las aves de corral.
En la tecnología ELISA, la fase sólida consiste en una placa de poliestireno
de 96 pocillos, si bien se pueden usar otros materiales. La función de la fase
sólida es inmovilizar los antígenos o anticuerpos en la muestra, ya que se
unen a la fase sólida. Después de la incubación, las placas son lavadas para
eliminar el material que no se haya unido. Luego, se agrega conjugado a la
placa y se permite su incubación.
El conjugado consiste en un antígeno o anticuerpo que ha sido marcado
con una enzima. De conformidad con el formato del ensayo, la porción
inmunológicamente reactiva del conjugado se une a la fase sólida o a la
muestra. La porción enzimática del conjugado posibilita la detección.
Se lavan de nuevo las placas y se agrega un sustrato enzimático (peróxido
de hidrógeno y un cromógeno), y se permite la incubación. Aparece color en
presencia de la enzima unida y la densidad óptica es leída con un lector de
placas ELISA.

Formatos de los ELISA

Los ELISA se dividen en tres formatos principales: indirecto, de bloqueo
(competitivo) y de captura de antígenos (directo).
Formato indirecto: En el formato indirecto, el antígeno de la muestra
queda entre el antígeno recubierto de la placa y un conjugado de globulina
anti-especie marcado enzimáticamente. La adición de un reactivo de
sustrato enzimático-cromógeno hace que aparezca el color. Este color es
directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra que
quedan unidos. Cuanto más anticuerpos haya en la muestra, más intenso
es el color en los pocillos de prueba. Este formato es adecuado para
determinar el nivel total de anticuerpos en muestras (virus de la enfermedad
de Newcastle, B. abortus, etc.)

Pasos en un ELISA indirecto

Azul

Leer densidad óptica

Anticuerpos

Detener
Agregar muestra

Lavado + conjugado

Lavado + Sustrato

Antígenos
Claro

2
 Formato de bloqueo (competitivo): En este formato, los anticuerpos de
la muestra específica compiten con, o bloquean, el anticuerpo específico
marcado enzimáticamente en el conjugado. La adición de un reactivo de
sustrato enzimático-cromógeno hace que aparezca el color. Este color es
inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra que
quedan unidos. Entre más anticuerpos haya en la muestra, menos intenso
es el color en los pocillos de prueba (CAV Ab [Chicken Anemia Virus, virus
de anemia infecciosa del pollo], CSFV Ab [Classical Swine Fever Virus,
virus de la fiebre suinos clásica], etc.)

Formato de captura de antígenos (directo): En el formato de captura de

antígenos, el antígeno de la muestra queda entre la cubierta de antígeno
de la placa y un conjugado marcado enzimáticamente. El conjugado de
anticuerpos puede ser monoclonal o policlonal. La adición de un reactivo
de sustrato enzimático-cromógeno hace que aparezca el color. Este color
es directamente proporcional a la cantidad del antígeno objetivo presente
en la muestra (CSFV Ag, ALV Ag [Aviar Leucosis Virus, virus de la leucosis
aviar], etc.).
Steps in Blocking ELISA
Pasos en un ELISA de bloqueo

transparente
Azul claro o

Leer densidad óptica

Lavado + conjugado
Anticuerpos

Agregar muestra

Lavado + Sustrato

Detener
Antígenos

Azul

Kits de ELISA

Un kit de ELISA es un conjunto de reactivos estandarizados y placas de

micropocillos fabricado para una prueba específica. Los kits de ELISA de
IDEXX podrían contener algunos o todos los componentes siguientes: placas
recubiertas (placas sólidas o de franjas), diluyente de muestras, controles,
concentrado para lavado, conjugado, sustrato y solución de parada. Los
kits se fabrican en lotes. Cada componente de cada lote de kits se optimiza
y fabrica para que funcione como unidad. Los kits aprueban numerosas
pruebas de control de calidad realizadas por IDEXX, los laboratorios de
referencia en todo el mundo o el Departamento de Agricultura de los EE. UU.
(U.S. Department of Agriculture, USDA) antes de su aprobación y puesta en venta.
NOTA: No mezcle ni use componentes de distintos números de lotes de kits.

3
Guía técnica de ELISA
Los kits de IDEXX son fabricados en lotes conforme
a normas de calidad estrictas. Cada componente o
reactivo en un lote de kits es optimizado para que
funcione con los otros reactivos que contiene el kit.
Esto incluye mediciones de sensibilidad, especificidad
y repetibilidad. Por consiguiente, es muy importante no
mezclar reactivos de distintos lotes de kits.
Todos los componentes de un kit tienen una
fecha de caducidad.
4
Kits de ELISA continuación
Placas recubiertas
Las placas de 96 pocillos están hechas de poliestireno y están recubiertas
con un antígeno o anticuerpo inactivado. Este recubrimiento es el sitio de
unión para los anticuerpos o antígenos de la muestra. Los anticuerpos o
antígenos no unidos de la muestra son lavados después de la incubación.
Diluyente de muestras
Muchos ensayos requieren una dilución específica de la muestra. Las
muestras se añaden al diluyente de muestras y se mezclan antes de
ponerlas en las placas recubiertas.
Controles
El control positivo es una solución que contiene antígeno o anticuerpo. El
control negativo es una solución sin antígeno ni anticuerpo. Los controles
ayudan a normalizar o estandarizar cada placa. También se usan los
controles para validar el ensayo y calcular los resultados de las muestras.
En la mayoría de los kits, los controles están prediluidos y listos para
usarse. Asegúrese de seguir las instrucciones del prospecto.
Conjugado
Los conjugados de ELISA son anticuerpos o antígenos marcados con
enzimas que reaccionan específicamente con los analitos de las muestras
unidos a las placas. El conjugado no unido es lavado después de la
incubación y antes de la adición del sustrato. La densidad óptica del
sustrato colorimétrico es directamente proporcional a la cantidad de enzima
unida que está presente.
Sustrato
En el caso de los conjugados de peroxidasa, el sustrato es una mezcla
de peróxido de hidrógeno y un cromógeno que reacciona con la porción
enzimática del conjugado para producir el color.
Concentrado de lavado
El concentrado de lavado es una solución tamponada que contiene
detergente, usada para quitar mediante lavado los materiales de las placas
que no están unidos.
Solución de parada
La solución de parada detiene la reacción enzima-sustrato y, con ello, la
aparición del color.
 Equipo usado en los ELISA

El equipo para los ELISA está ampliamente disponible. Hay disponibilidad

de lectores, lavadores y pipetas como sistemas manuales o automatizados.
Es amplia la variedad de equipo disponible. Cuando
Algunos de los factores que afectan la selección del equipo son el número y
compre un lector de placas, llame a Servicios Técnicos
tipos de pruebas y muestras, la capacitación técnica y las consideraciones
de IDEXX para asegurarse de que el software xChek*
de personal o financieras. A continuación, se delinean brevemente algunos
tiene la interfaz apropiada.
equipos disponibles para realizar los ELISA.

Pipetas
• De canal único y de volumen fijo y ajustable (1–20 µL, 10–100 µL,
20–200 µL, etc.)
• Multicanal, de 8 y 12 canales
• Unidades dispensadoras semiautomatizadas
• Sistemas totalmente automatizados que pueden procesar placas múltiples
Pipetas de canal único y multicanal

Diluidores
• De canal único
• Multicanal
• Unidades dispensadoras automatizadas

Sistemas de lavadores
• Sistemas manuales que lavan una hilera o columna por vez
• Sistemas semiautomatizados que manejan una franja o placa por vez
Sistema de lavado semiautomatizado • Sistemas totalmente automatizados que pueden procesar placas múltiples

Lectores de placas de ELISA

• Lectores manuales que leen una hilera o pocillo por vez
• Lectores semiautomatizados que leen una placa por vez
• Sistemas totalmente automatizados que pueden procesar
simultáneamente múltiples placas

Otros
• Cámara de humedad (no se requiere para todos los ELISA)
Sistema de lavado manual • Selladores de placas para ensayos que tienen períodos de incubación
prolongados (para evitar la evaporación)

Lector de placas

5
Guía técnica de ELISA
No se olvide de etiquetar las pipetas con la fecha de
calibración y llevar un registro de la calibración y el
mantenimiento de todo el equipo.
Pipeta con etiqueta de calibración
6
Mantenimiento y calibración del equipo
El mantenimiento y la calibración de su equipo de laboratorio es
sumamente importante para obtener resultados precisos y reproducibles.
Debe usar el Programa de mantenimiento y calibración (Apéndice D) como
guía. Ajuste las rutinas de mantenimiento de conformidad con el número de
ensayos diarios que se realizan en su laboratorio. Siempre consulte la guía
del fabricante de su equipo para obtener sus recomendaciones.
Protocolos de calibración
Es necesario que el equipo siempre esté calibrado apropiadamente. El
equipo que está fuera de calibración puede producir resultados falsos o
inexactos. Consulte el Programa de mantenimiento y calibración (Apéndice
D) y las instrucciones del fabricante para obtener el protocolo de calibración
adecuado y la frecuencia requerida.
Opciones de calibración de pipetas
• Ejecute el método gravimétrico delineado en el Apéndice A.
• Use un sistema comercial de calibración automatizado, como PCS®, que
produce Artel. Consulte el Apéndice A, Procedimiento de calibración de
micropipetas para obtener más información.
• Envíe la pipeta al fabricante; consulte el manual del propietario para
obtener las instrucciones.
• Envíe la pipeta a un servicio de calibración de pipetas.
Enviar las pipetas para servicio es benéfico cuando resulta necesaria su
reparación o mantenimiento. Sin embargo, hacerlo significa que se tenga
solamente un nivel limitado de control de calidad, que se puede aumentar
con la calibración interna.
La técnica del operador y el entorno de laboratorio son dos variables
críticas, que determinan cómo se comporta una pipeta cuando se usa
en su mesa de trabajo. Un programa de control de calidad completo
debe incluir el análisis cuantitativo de estos efectos. Es beneficioso
tener un método en aplicación que le permita realizar verificaciones de
funcionamiento rutinarias a intervalos regulares de sus propias pipetas.
Al hacerlo, podrá realizar un seguimiento de las pipetas que se estén
desviando fuera de los límites de tolerancia. Cuando esto ocurra, la pipeta
con falla debe enviarse para mantenimiento correctivo o reparación por
un servicio calificado, antes de que ponga en entredicho los datos y la
productividad de su laboratorio.

Etiquete el kit con la fecha en que fue recibido.
La contaminación de reactivos podría poner en
entredicho los resultados de la prueba. Etiquetar los
depósitos de reactivos y usar un depósito distinto
para cada reactivo ayudará a minimizar el riesgo.
Depósitos etiquetados
Manejo y preparación de reactivos
Recepción de kits
Cuando reciba los kits de ELISA, registre la fecha en la Tabla de control
de inventario (Apéndice B) y en las cajas de los kits. Inspecciónelos en
busca de daños y almacénelos a 2–8 °C. Cuando use kits de su inventario,
aplique el método de primeras entradas, primeras salidas (PEPS). En otras
palabras, use antes los kits más antiguos (o que caducarán primero). Los
componentes individuales de los kits podrían tener fecha de caducidad
más lejana que la fecha real indicada en el exterior de la caja del kit. Sin
embargo, debe tomar como referencia la fecha de caducidad indicada en
la etiqueta exterior del kit. Si no usa un kit en su totalidad, marque la fecha
en que lo abre y cada fecha de uso en lo sucesivo. De este modo, puede
realizar un seguimiento de cuántas veces es movido o pasa del refrigerador
a temperatura ambiente. Minimice el número de tales ciclos al acumular las
muestras en grupos más grandes siempre que sea posible.
Manejo general de reactivos
Asegúrese de revisar el prospecto para obtener las pautas de manejo y
preparación de reactivos. En algunos kits de prueba, se recomienda que
todos los reactivos y placas sean estabilizados a temperatura ambiente
(18–26 °C) antes de su uso, mientras que otros indican que solamente
reactivos específicos sean llevados a temperatura ambiente. Cuando sea
necesario llevar un kit a temperatura ambiente (18–26 °C), sáquelo del
refrigerador y saque los componentes del kit de la caja al menos 2–3 horas
antes de iniciar el ensayo.
Mida todos los reactivos con recipientes esterilizados o limpios. Tenga
cuidado de medir únicamente lo que necesita para el número de placas
que procesará. Esto ayudará a conservar la integridad de los reactivos.
No devuelva los reactivos a los frascos de existencias originales.
Recomendamos ampliamente el uso de pipetas y depósitos desechables
en el manejo de reactivos, para minimizar el riesgo de contaminación. Sin
embargo, en el caso de que decida reutilizar algún dispositivo desechable,
use un depósito separado para cada reactivo y asegúrese de etiquetarlos.
Además, lave y enjuague bien los pocillos con agua desionizada o
destilada luego de cada uso. Cambie y deseche los depósitos desechables
con la mayor frecuencia posible. Por ningún concepto use el mismo
depósito para conjugado y sustrato, incluso si ha sido lavado.
7
Guía técnica de ELISA
Consulte el prospecto del paquete para obtener los
detalles específicos del kit que está usando.
No intercambie componentes entre números de
lotes de kits, incluso si los kits son de tipo similar.
Los resultados de la prueba podrían verse afectados
adversa y gravemente.
Selle, etiquete y almacene las placas usadas parcialmente en una bolsa
con desecante.
8
Manejo y preparación de los componentes del kit
Placas
Muchas placas de ensayo son empacadas de manera individualizada con
un desecante. Si usa una placa parcial, aspire todo el líquido de los pocillos
usados y cúbralos con cinta selladora. Almacene la porción no usada de
placas con varios desecantes en una bolsa resellable nueva.
Diluyente de muestras y concentrado de lavado
Asegúrese de que el diluyente de muestras y el concentrado de lavado
estén a temperatura ambiente (18–26 °C) antes de usarlos. En general,
son los frascos más grandes de un kit y los que requieren más tiempo
para equilibrarse. Si en el concentrado de lavado todavía se observa la
formación de cristales después de que alcance temperatura ambiente,
inviértalo varias veces para mezclarlo.
Controles
Muchos kits son formulados con controles prediluidos. Sin embargo, con
algunos se requiere que los diluya en la misma forma que la muestra. Los
controles deben ser añadidos a la placa con el mismo método y al mismo
tiempo que las muestras.
Conjugado
Si el kit requiere que prepare una solución de conjugado de “trabajo”,
asegúrese de seguir al pie de la letra las instrucciones. Prepare únicamente
lo que necesitará de inmediato y no guarde la solución que sobre
para su uso futuro. Si los conjugados se contaminan o se almacenan
inadecuadamente, podrían perder su actividad enzimática o tener un
aumento evidente de fondo. Muchos kits incluyen un conjugado listo para
usarse.
Sustrato
Nuestros kits de ELISA incluyen un sustrato listo para usarse. La actividad
enzimática del sustrato es puesta en entredicho si se expone a la luz o tiene
contacto con metal. Proteja esta solución al almacenarla en un recipiente
oscuro hasta que esté lista para usarla.
Solución de parada
Asegúrese de usar la solución de parada que se incluye en el kit. Siga
todas las precauciones de seguridad indicadas en el prospecto. La
solución de parada debe estar a temperatura ambiente antes de usarla. Si
todavía observa la formación de cristales en la solución de parada después
de alcanzar temperatura ambiente, inviértala varias veces para mezclarla.
A temperaturas más bajas, la solución de parada podría cristalizarse.
Antes de usarla, asegúrese de que esté completamente disuelta y sea
transparente.
 Control de calidad

Controles internos
Registro de control IBV de septiembre
Recomendamos usar controles de ensayo internos para supervisar el
Control/valores a densidad óptima

0.4
0.35
0.3
funcionamiento de los kits y las técnicas ELISA con el tiempo.
0.25
0.2
Generalmente se reciben los sueros en cantidades pequeñas, por lo que
0.15 será necesario realizar controles mediante la agrupación de muestras.
0.1
0.05
Recolecte por separado las muestras negativas y las positivas. Cuando
0 haya recolectado cantidades suficientes de unas y otras, agrupe las
1 0 5 7 9 11 13 15 17 19 21 20 25 27 29
Dia muestras similares. Mezcle bien las muestras agrupadas. En pequeñas
Controle positivo Controle negativo cantidades, realice la dilución seriada de sueros positivos en sueros
negativos. Ensaye cada dilución conforme al protocolo estándar del
Tabla de registro de controles
kit (misma dilución de muestra que la descrita en el prospecto del kit).
Seleccione la dilución que sea más comparable con los valores de muestra
a positivo (sample-to-positive, S/P) o muestra a negativo (sample-to-
negative, S/N) que desee supervisar. Prepare grandes cantidades de
dicha dilución. Prefiltre los controles preparados mediante el uso de una
membrana de filtro de 0,45 micrones; luego, puede optar por filtrar con
una membrana de filtro de 0,20 micrones (opcional). Ponga una pequeña
cantidad del control recién preparado (volumen suficiente para 1–2
pruebas) en viales herméticos, etiquételos, féchelos y almacénelos en
congelación a –70 °C si es posible. Lleve un registro de esta preparación en
un cuaderno de notas, para su consulta.
A fin de usar este control, descongélelo, mézclelo y dilúyalo de la misma
manera que una muestra de rutina. Procéselo en cada placa junto a
los controles del kit. No congele de nuevo el control interno. Puede
almacenarlo por 3–5 días a 4 °C.

Registre y grafique la temperatura del laboratorio Registre los resultados en la Tabla de control de laboratorio (Apéndice C)
como ayuda para aclarar resultados cuestionables. y grafíquelos. Toda variación o tendencia debería alertarlo a que revise su
técnica y las medidas de control de calidad.

Supervisión de la temperatura
Registro de temperatura de septiembre

Los ELISA son muy sensibles a los extremos de temperatura. Trate de

Grados Celsius

mantener la temperatura del laboratorio en 18–26 °C. Evite procesar

ensayos bajo o cerca de corrientes de aire, ya que estas podrían causar
enfriamiento, evaporación o calentamiento excesivos. Además, no procese
los ensayos bajo la luz solar directa, ya que esta podría causar evaporación
Dia y calentamiento excesivos. Las mesas de trabajo frías podrían afectar el ensayo
y deben evitarse mediante la colocación de varias capas de toallas de papel
Tabla de registro de la temperatura del laboratorio u otro material aislante bajo las placas del ensayo, durante la incubación.
Registre y realice un seguimiento de la temperatura durante cada ensayo. Si
la temperatura en su laboratorio fluctúa de la mañana a la tarde, regístrelo
en la tabla de control. En el caso de que tenga condiciones difíciles de
controlar, es una buena idea usar una cámara de control de temperatura
para incubar las placas. Usar cubiertas para placas de ELISA ayuda a
controlar la evaporación y prevenir derrames accidentales.

Revisión de control de calidad

Use la Revisión de control de calidad (Apéndice E) para solucionar
cualquier problema. 9
Guía técnica de ELISA
Muestra de jugo de carne
Extraiga la muestra del área indicada.
Muestra de sangre
Extraiga la muestra del área indicada.
Muestra de leche
Extraiga la muestra del área indicada.
10
Manejo de muestras
Calidad de las muestras recibidas
La calidad de las muestras puede tener efecto significativo en los resultados
finales del ensayo. Muchos laboratorios no tienen opción alguna en lo
referente a la calidad de las muestras recibidas. En muchos casos, la
formulación del diluyente de muestras compensa las variaciones en la
calidad de las muestras.
La contaminación micótica o bacteriana macroscópica puede tener efectos
adversos en los anticuerpos u otros componentes proteínicos de la muestra
y podría causar un efecto indeseable en los resultados de la prueba.
Si la calidad de la muestra es altamente cuestionable, se recomienda
encarecidamente obtener una nueva muestra, cuando sea posible.
Muestras de suero/plasma: Las muestras de suero con hemólisis mínima
(color rojo claro) y lipemia moderada (aspecto lechoso) quizá tengan
efectos mínimos o nulos en los resultados del ELISA. Evite usar muestras
con hemólisis considerable (color rojo oscuro) o que sean extremadamente
lipémicas. Revise el prospecto del paquete para obtener información.
Cuando el suero está sobre el coágulo, tenga cuidado de no aspirar
ninguna parte del material coagulado o células sanguíneas.
Muestras de jugo de carne: Las muestras de jugo de carne deben estar
tan limpias como sea posible. Retire los desechos y lípidos de la muestra
cuando pipetee.
Muestras de leche: Las muestras de leche entera pueden utilizarse
después de la centrifugación durante 15 minutos a 2.000 x g o pueden
dejarse toda la noche si están refrigeradas (2–8 °C). La muestra destinada
al ensayo debería ser extraída de debajo de la capa de crema.
Muestras de yema de huevo: Recolecte las muestras con una jeringa de
tuberculina limpia y mezcle bien las muestras diluidas mediante agitación.
Otros tipos de muestras: Consulte el prospecto del paquete para obtener
información sobre el manejo, la preparación y el almacenamiento de otros
tipos de muestras (p. ej., albúmina, hisopos cloacales).

Evite los ciclos de congelación-descongelación
numerosos, que podrían dañar los anticuerpos o
antígenos de la muestra. Recomendamos no más
de 3–5 ciclos.
Hemólisis clara
Hemólisis oscura
Muestra descongelada sin mezclar
Las proteínas se asientan en el
fondo del tubo; mezcle antes de
extraer la muestra
Manejo de muestras continuación
Almacenamiento de muestras
Asegúrese de almacenar correctamente las muestras. En general, las muestras
de suero se deben refrigerar a 2–8 °C durante no más de 3–5 días. Si es
necesario almacenar las muestras más tiempo, deberían ser extraídas del
coágulo y congeladas a un mínimo de -20 °C. Asegúrese de que todas las
muestras almacenadas estén etiquetadas y selladas correctamente, para
prevenir la evaporación. La evidencia de liofilización (concentración de la
muestra) puede ser apreciable en la forma de cristalización y es común en
los congeladores con deshielo automático. Se la debería evitar, ya que lo más
probable es que ponga en entredicho la integridad de la muestra.
Uso de muestras congeladas
Las muestras congeladas se pueden descongelar a temperatura ambiente
o en un refrigerador. Es necesario mezclar bien todas las muestras
descongeladas antes de su dilución, para asegurarse de que las proteínas se
dispersen en toda la muestra. Mézclelas al agitarlas suavemente o invertirlas
cuando menos cinco veces. La formación de espuma o la mezcla excesiva de
las muestras causarán la desnaturalización de las proteínas séricas.
11
Guía técnica de ELISA

Métodos de pipeteo

Use el pipeteo normal (forward) para la preparación de
diluciones de muestras, y el pipeteo invertido, para la
adición de controles, reactivos y muestras diluidas.
Dos métodos de pipeteo usados para los ELISA son el método normal
(forward) y el método invertido. No todas las pipetas permiten realizar el
pipeteo invertido. Consulte detalles en las instrucciones incluidas con la pipeta.
Use el pipeteo normal (forward) para la preparación de diluciones de
muestras, y el pipeteo invertido, para la adición de controles, reactivos y
muestras diluidas.
El pipeteo cuidadoso es decisivo para lograr resultados exactos.
Familiarícese con la pipeta y con ambos métodos antes de procesar
pruebas reales. Asegúrese de usar la pipeta y la punta (capacidad de
volumen) correctas para el volumen que se transfiere.

Técnica de pipeteo
1. Lleve el volumen calibrado de la muestra a la punta.
2. Toque la pared del tubo con la punta para eliminar el líquido excesivo.
3. Asegúrese de tener el volumen apropiado de muestra en la punta.
Cuando usa una pipeta multicanal, si están vacíos los pocillos de la placa
posicione las puntas en la esquina inferior de cada pocillo, en contacto
con el plástico. Si los pocillos de la placa contienen líquido, posicione las
puntas por arriba del líquido, en contacto con el plástico.

Pipeteo de una muestra

Lleve el volumen calibrado de la Es necesario eliminar la Toque la pared del tubo con la Asegúrese de tener el volumen
muestra a la punta. gota en la punta. punta para eliminar el líquido apropiado de muestra en la punta.
excesivo.

Pipeteo adecuado

Posición correcta para vaciar reactivos en pocillos vacíos

cuando se usa una pipeta multicanal: en la esquina inferior de
cada pocillo

Posición correcta para vaciar reactivos en pocillos que

contienen líquido cuando se usa una pipeta multicanal: por
arriba del líquido

12
 Métodos de pipeteo continuación
Pipeteo normal (forward) y preparación de la muestra
1. Coloque una nueva punta en una pipeta de canal único y asegúrese de
que esté bien apretada.
2. Presione el émbolo hasta la primera parada.
3. Algunos fabricantes recomiendan humedecer previamente la punta
mediante la aspiración y expulsión de un poco de la muestra. Revise las
instrucciones incluidas con la pipeta.
4. Lleve el volumen calibrado de la muestra a la punta y haga pausa por
un segundo, con la punta todavía en la muestra. Tenga cuidado de no
colocar la punta a una profundidad excesiva en la muestra.
5. Toque la pared del recipiente de la muestra con la punta para eliminar el
exceso de líquido en el exterior de la punta.
6. Vacíe la muestra en el diluyente medido presionando el émbolo más allá
de la primera parada hasta la segunda parada. Tenga cuidado de no
colocar la punta a una profundidad excesiva en el diluyente de muestras.
Para muestras de 10 µL o menos: Después de de vaciar la muestra en el
diluyente, enjuague la punta de la pipeta en el diluyente presionando 2–3
veces el émbolo antes de expulsar la punta.
7. Mezcle las muestras en una pipeta multicanal antes de vaciar las
muestras en la placa. Puede hacerlo si presiona el émbolo 3–6 veces.
8. Expulse la punta en un recipiente para desechos.

Pipeteo invertido con una pipeta multicanal

1. Ponga puntas nuevas en la pipeta. Asegúrese de que estén bien
apretadas y derechas.
2. Presione el émbolo más allá de la primera parada, a la mitad de la
distancia hacia la segunda parada.
3. Extraiga el líquido con un movimiento lento, teniendo cuidado de no
introducir burbujas de aire en las puntas. Revise la constancia del
volumen en las puntas.
4. Toque el borde del depósito de reactivo con las puntas para eliminar el
exceso de líquido en el exterior de las propias puntas.
a. S
 i están vacíos los pocillos de la placa, posicione las puntas en la
esquina inferior de cada pocillo, en contacto con el plástico.
b. Si los pocillos de la placa contienen líquido, posicione las puntas por
arriba del líquido, en contacto con el plástico.
Puntas dobladas: es necesario reemplazarlas
5. Vacíe lentamente el líquido en los pocillos presionando el émbolo hasta
la primera parada. Asegúrese de no salpicar líquido fuera de los pocillos
y de que no queden gotas en las puntas.
6. Para repetir, sostenga el émbolo en la primera parada y continúe con el
paso 3.
7. Deseche las puntas en un recipiente para desechos.
NOTA: En el pipeteo invertido, se usa más reactivo/volumen
(= “volumen muerto”).

13
Guía técnica de ELISA

Métodos de pipeteo continuación

Sistemas de dilución automatizados y ensayos competitivos

Se usa más reactivo/volumen en los equipos
En el caso de los sistemas y ensayos en que se usan muestras limpias
automatizados que en los semiautomatizados. Revise
o factores de dilución más bajos, se puede colocar directamente la
las instrucciones del fabricante en cuanto al purgado y
muestra en los pocillos de las placas recubiertas.
acondicionamiento del sistema.
Siga la secuencia que aparece a continuación:
1. Agregue el diluyente a la placa.
2. Agregue la muestra al diluyente.
3. Mézclelos al golpear suavemente la placa o con el pipeteo repetido.

14

A fin de minimizar el tiempo de incubación entre los
controles y las muestras, coloque los controles en un
rack con las muestras y agréguelos a la placa con una
pipeta multicanal.
Utilice varios temporizadores cuando incube placas múltiples.
Tiempos de las placas para ELISA
Adición de muestras y controles
Las incubaciones para placas de ensayo se deberían cronometrar con
la mayor precisión posible. Es usual que el proceso de adición de las
muestras a la placa sea el que requiere más tiempo. Cuando se agregan
muestras a la placa, es de fundamental importancia minimizar el tiempo
entre la primera y la última muestra.
Use una pipeta multicanal siempre que sea posible para minimizar
el intervalo entre el inicio y el fin de la placa. Si el intervalo se vuelve
demasiado prolongado o es interrumpido mientras añade muestras a la
placa, ponga un control positivo o su control interno al final de la placa y
compare estos resultados con los controles que están al inicio de la placa.
A fin de tener un control más estricto de la diferenciación de tiempo desde
cuándo se añaden los controles y muestras, puede poner los controles en
un tubo que esté colocado en un rack con las muestras. Luego, use una
pipeta multicanal y ponga los controles en la placa al mismo tiempo que
agrega las muestras.
Procesamiento de placas múltiples
Al cronometrar placas múltiples, es importante realizar un seguimiento del
intervalo de tiempo entre la primera y la última placa del proceso. Mantenga
suficientemente pequeño el tamaño de los lotes para que los procesos no
se sobrepongan. No es conveniente estar lavando una placa (a menos que
lo haga un lavador automatizado) cuando se necesita añadir el conjugado
a otra. De ser posible, use un temporizador para cada placa.
15
Guía técnica de ELISA
Después de aplicar los golpecitos a las placas,
revise las toallas de papel en búsqueda de color. La
presencia de este último indicaría que no se lavaron
apropiadamente las placas y que podría haber todavía
reactivos en los pocillos o alrededor de estos.
Proliferación microbiana en el tubo
de sistemas de lavado: es necesario
reemplazarlos
16
Lavado de las placas para los ELISA
Sistemas automatizados o semiautomatizados
En general, un sistema de lavado automatizado o semiautomatizado que
funcione correctamente proporcionará un lavado más constante que los
métodos manuales. Revise que todas las agujas de vaciado proporcionen
un chorro estable y uniforme, y que en todos los puertos de aspiración sea
uniforme la aspiración.
Asegúrese de que se lave y se mantenga correctamente su sistema de
lavado. Consulte la sección de Mantenimiento y calibración de equipo en
esta guía (página 6) y el manual del propietario para obtener información
sobre el mantenimiento adecuado. La técnica de lavado de placas debe
ser constante de una placa a otra y de una hilera a otra en una placa. Evite
los tiempos de lavado prolongados, a menos que estén recomendados
específicamente en el prospecto.
Prepare la solución de lavado de conformidad con el prospecto. Use
solamente la solución de lavado incluida con el kit o recomendada para este.
Aspire los reactivos de la placa antes de vaciar la solución de lavado.
Siga las recomendaciones específicas del prospecto en cuanto al número
de lavados que debe usar en cada paso de un ensayo. En muchos
ensayos, se requieren aproximadamente 300–350 µL por pocillo para
cada lavado. Tenga cuidado de llenar los pocillos más arriba que el nivel
de los reactivos. No permita que rebosen los pocillos. Si ocurre esto, los
resultados de la prueba podrían ser inválidos.
No permita que la placa se seque entre los lavados y antes de la adición de
reactivos.
Después de la aspiración final, aplique golpecitos suaves para eliminar el
líquido remanente sobre varias capas de toallas de papel.
Tenga mucho cuidado al inspeccionar los pocillos cuando ensaye muestras
de leche, albúmina, sangre total o yema de huevo. Dada su composición
de proteínas o grasas, estos tipos de muestras a veces son más difíciles de
lavar de los pocillos y podrían requerir el número máximo recomendado de
ciclos de lavado.
 Lavado de placas para los ELISA continuación

Sistemas manuales o semimanuales

Trabaje rápidamente, de modo que sea mínimo el tiempo de lavado entre el
primer pocillo/hilera y el último. Si el tiempo es excesivo, los pocillos vacíos
podrían secarse y los últimos pocillos tendrán tiempo de incubación más
prolongado que los primeros.
Se debería evitar el lavado mediante pipetas multicanal o frascos de lavado
si es posible, ya que con ellos el lavado es insuficiente y el resultado es un
fondo alto e inconstante.
Asegúrese de aspirar todo el líquido de los pocillos mediante la colocación
de las agujas de aspiración en el fondo y las esquinas de los pocillos
mismos. No raspe la superficie de la placa, ya que al hacerlo retirará el
antígeno/anticuerpo unido a la superficie y con ello causará resultados
inconstantes o inexactos. Después de la aspiración, no se debe permitir que
se sequen los pocillos antes de la adición del reactivo siguiente.
Después de aplicar los golpecitos a las placas, revise las toallas de papel en
búsqueda de color. La presencia de este último indicaría que no se lavaron
Desbordamiento de la placa: puede contaminar otros pocillos
apropiadamente las placas y que podría haber todavía reactivos en los
pocillos o alrededor de estos.

Posición adecuada de las agujas del lavador manual para vaciar la solución Posición adecuada de las agujas del lavador manual para la aspiración de
de lavado líquido

17
Guía técnica de ELISA

Lectura de las placas y gestión de datos

Lectura de las placas

El último paso en un ELISA es leer e interpretar los resultados. En muchos
ensayos, la densidad óptica (cantidad de color) de la solución en la placa
se lee con un espectrofotómetro, comúnmente denominado lector de placas.
Son numerosos los modelos y fabricantes de lectores de placas; consulte
las instrucciones del fabricante para obtener los detalles de funcionamiento.
En el prospecto, se especifica la longitud de onda requerida para el ensayo.
En muchos ensayos, se especifica la lectura de absorbancia a 450 nm o
650 nm. Muchos ensayos se optimizan mediante el uso de un lector de
placas equipado con filtro de 650 nm. Aunque se pueden usar otros filtros,
darán por resultado valores más bajos de densidad óptica (DO). El uso de
filtros de 630 nm o 620 nm reducirá los valores de DO de los controles y
muestras; pero lo hará de manera equivalente en toda la placa. El uso de
estos filtros alternativos no afectará los resultados de la prueba.
Se deberían leer las placas tan pronto sea posible después de añadir
la solución de parada. Las lecturas de absorbancia podrían cambiar si
transcurre tiempo excesivo entre parar la reacción y leer las placas.
Gestión de datos
IDEXX proporciona el software xChek* para ayudarle en la recopilación
y gestión de los datos de sus ensayos ELISA. El software xChek es
compatible con los lectores de placas más usados, para leer la placa,
envíe las densidades ópticas a la computadora y calcule los resultados.
Un representante de Servicios Técnicos de IDEXX puede brindarle más
información acerca de este software.

La interfaz del software xChek* con el lector de placas de ELISA

18

Fondo alto o aparición de color excesivo (lecturas de densidad óptica [DO] alta)
Posibles causas
Se usó agua de baja calidad para lavar las
placas o para preparar la solución de lavado.
La solución de sustratos se ha deteriorado.
Hubo lavado insuficiente o funcionamiento
deficiente del lavador.
Hay contaminación microbiana en el sistema
de lavado.
Lave el sistema contenido una formulación de
lavado alternativa.
El lector no funcionaba bien o no se borró
correctamente; esta es una posible causa si
las lecturas de DO fueron altas sin que el color
fuera oscuro.
La temperatura del laboratorio fue muy alta o
muy baja.
Los reactivos fueron mezclados entre sí,
se contaminaron o fueron preparados
incorrectamente.
Localización y solución de problemas de ELISA
Esta información tiene como fin ayudarle a solucionar problemas con el
procedimiento de su ELISA. Si necesita asistencia, comuníquese con
Servicios Técnicos de Diagnóstico de Ganado y Aves de Corral [Livestock and
Poultry Diagnostics Technical Services] de IDEXX al 1-207-556-4895, opción
2, o al 1-800-548-9997, opción 2.
NOTA: Las condiciones descritas aquí podrían no ser pertinentes a cada kit
de ELISA, ya que los requisitos de funcionamiento varían con cada ensayo.
Asegúrese de revisar las especificaciones en el prospecto.
Acciones recomendadas
Revise la calidad del agua. Si es cuestionable, trate de sustituirla con una
fuente de agua alternativa, como agua destilada embotellada, para el
lavado de placas o la preparación de la solución de lavado.
Asegúrese de que el sustrato sea incoloro antes de añadirlo a la placa.
Trate de usar el número máximo de lavados recomendado para el ensayo.
Asegúrese de que se vacíen cuando menos 350 µL de solución de lavado
por pocillo para cada lavada. Verifique el funcionamiento del sistema
de lavado. Haga reparar el sistema si hay goteo o vaciado o aspiración
deficientes en cualquier puerto.
Limpie la contaminación microbiana al irrigar el sistema con una solución
diluida de lejía (10% por volumen), seguida de un gran volumen de agua
destilada o desionizada. Prepare el sistema con la solución de lavado
adecuada antes de usarlo. Podría ser necesario cambiar los tubos si la
contaminación es significativa.
Asegúrese de que cada solución de lavado sea etiquetada
adecuadamente. Prepare el sistema por completo cuando cambie de
soluciones.
Verifique el funcionamiento del lector con una placa de calibración y revise
la alineación de la lámpara. Verifique el procedimiento de borrado, si
corresponde, y repita el borrado.
Mantenga la temperatura ambiente a 18–26 °C. Evite procesar ensayos
cerca de fuentes de calor, bajo la luz solar directa o expuestas a corrientes
de aire.
Asegúrese de que se hayan utilizado los reactivos correctos, de que las
soluciones de trabajo hayan sido preparadas correctamente y de que no
se haya producido contaminación.
19
Guía técnica de ELISA
Localización y solución de problemas de ELISA continuación
Aparición de color insuficiente (lecturas de densidad óptica [DO] bajas)
Posibles causas
La temperatura del laboratorio fue muy alta o
muy baja.
Se preparó incorrectamente la solución
de lavado o se usó la solución de lavado
incorrecto.
El sistema de lavado tuvo contaminación
microbiana o contenía una formulación de
lavado alternativa.
Se usaron demasiados ciclos de lavado.
Los períodos de incubación fueron
excesivamente breves.
Los reactivos y placas estaban muy fríos.
Los reactivos estaban caducos o se mezclaron
con los de un número de lote distinto.
Se usó el conjugado erróneo, se preparó
incorrectamente el conjugado o se ha
deteriorado.
La placa de ensayo fue leída a una longitud de
onda incorrecta o el lector fallaba.
Se diluyó el control positivo (únicamente para
el formato indirecto).
El kit ha sido sometido a ciclos excesivos.
Las placas del ensayo fueron puestas en
entredicho o usadas previamente.
20
Acciones recomendadas
Mantenga la temperatura ambiente a 18–26 °C. Evite procesar ensayos
bajo las rejillas del acondicionador de aire o cerca de ventanas frías.
Asegúrese de usar la solución de lavado recomendada para el kit y de que
sea preparada correctamente. Etiquete cada solución de lavado específica
para prevenir el uso de la solución incorrecta.
Limpie la contaminación microbiana al irrigar el sistema con una solución
diluida de lejía (10% por volumen), seguida de un gran volumen de agua
destilada o desionizada, y luego prepare el sistema con la solución de lavado
apropiada. Asegúrese de que cada solución de lavado sea etiquetada
adecuadamente. Prepare el sistema por completo cuando cambie de soluciones.
Manténgase dentro del intervalo recomendado para el número de ciclos
de lavado. Trate de usar el número mínimo de lavados recomendado para
el ensayo.
Siga el protocolo para los tiempos de incubación. Cronometre por separado
cada placa para garantizar que los períodos de incubación sean exactos.
Asegúrese de que las placas y reactivos estén a temperatura ambiente
sacándolos del refrigerador, además de sacar los componentes de los kits
fuera de las cajas de kits, al menos 2–3 horas antes de comenzar el ensayo.
Verifique las fechas de caducidad y los números de lote de los reactivos.
Asegúrese de que el conjugado que se usa sea el que se incluía el kit
y que todos los conjugados sean los específicos del kit y lote. Si es
necesaria la preparación de un conjugado de trabajo, asegúrese de que
el concentrado y el diluyente se mezclen en volúmenes apropiados. No
prepare la solución de trabajo con anticipación excesiva ni guarde la
porción no utilizada para su uso futuro. Si no es necesaria la preparación
de conjugado, asegúrese de vaciar únicamente la cantidad necesaria para
uso inmediato y no devuelva la porción no usada al frasco de existencia.
Verifique la longitud de onda correcta para el ensayo y lea de nuevo la
placa. Verifique la calibración del lector y la alineación de la lámpara.
No diluya los controles, a menos que se especifique en el prospecto.
Revise los registros para ver cuántas veces se ha sacado el kit del
refrigerador. Revise si el kit fue dejado sobre una superficie de carga u otra
área durante un tiempo excesivo o a temperaturas extremas.
Asegúrese de refrigerar las placas en bolsas selladas con un desecante para
mantener la estabilidad. Prevenga la formación de condensación sobre las
placas al permitir que se equilibren a temperatura ambiente mientras estén
en el envase. Si se usan placas parciales, asegúrese de rotular los pocillos usados
para prevenir su reutilización; cúbralos con cinta selladora y use los pocillos
restantes tan pronto sea posible. No almacene placas usadas parcialmente
con otras placas. Incluya un desecante en la bolsa de almacenamiento.
 Localización y solución de problemas de ELISA continuación
Los replicados en una placa muestran reproducibilidad baja
Posibles causas
Se dedicó un tiempo excesivo para agregar
las muestras, los controles o los reactivos a la
placa de ensayo.
La pipeta multicanal no funcionó
adecuadamente.
Hubo lavado inconstante o falla de
funcionamiento del sistema de lavado.
Hubo distribución inadecuada de anticuerpos
en la muestra.
No apareció el color
Posibles causas
Se usaron reactivos en el orden incorrecto o se
omitió un paso del ensayo.
No se añadieron muestras al diluyente
(solamente en el formato indirecto).
Se usó el conjugado erróneo, se preparó
incorrectamente el conjugado o se ha
deteriorado.
Acciones recomendadas
Asegúrese de que todos los materiales estén preparados y listos para
usarlos rápidamente. Use una pipeta multicanal para agregar simultáneamente
los reactivos a pocillos múltiples. Coloque los controles en un rack con las
muestras y viértalos en la placa al mismo tiempo que las muestras.
Verifique la calibración de la pipeta y revise que las puntas estén bien
apretadas. Asegúrese de todos los canales de la pipeta viertan volúmenes
iguales.
Verifique el funcionamiento del sistema de lavado. Haga reparar el sistema
si hay goteo o vaciado/aspiración deficientes en cualquier puerto.
Si se descongeló o refrigeró la muestra, asegúrese de que sea mezclada
antes de la dilución. También es necesario mezclar las muestras diluidas
antes de agregarlas a la placa.
Acciones recomendadas
Revise el protocolo del ensayo en el prospecto y repita el ensayo.
Verifique que se hayan agregado las muestras al diluyente.
Asegúrese de que el conjugado que se usa sea el que se incluía en el
kit y que todos los conjugados sean los específicos del kit. Todos los
conjugados tienen especificidad de kit y lote. Si es necesaria la preparación
de un conjugado de trabajo, asegúrese de que el concentrado y el diluyente
sean mezclados en volúmenes apropiados. No prepare la solución de
trabajo con anticipación excesiva ni guarde la porción no utilizada para su
uso futuro. Si no es necesaria la preparación de conjugado, asegúrese de
vaciar únicamente la cantidad necesaria para uso inmediato y no devuelva
la porción no usada al frasco de existencia.
21
Guía técnica de ELISA
Reproducibilidad baja de una placa a otra
Posibles causas
Hubo tiempos de incubación inconstantes de
una placa a otra.
Hubo lavado inconstante de una placa a otra.
La pipeta no funcionaba bien.
Los controles y muestras del kit estaban a
temperaturas distintas.
Se estaban usando reactivos de lotes de kits
distintos.
22
Solución de problemas de ELISA continuación
Acciones recomendadas
Cronometre cada placa por separado para asegurarse de que las placas
tengan períodos de incubación constantes.
Use el mismo número de lavados para cada placa. Verifique el
funcionamiento del sistema de lavado. Haga reparar el sistema si hay goteo o
vaciado/aspiración deficientes en cualquier puerto.
Revise la calibración de la pipeta. Verifique que las puntas de la pipeta
estén bien apretadas antes de su uso y que todos los canales extraigan y
viertan volúmenes iguales.
Asegúrese de permitir que transcurra tiempo suficiente para que el
diluyente de muestras, las muestras y los controles del kit alcancen
temperatura ambiente. Para ello, retírelos de la caja del kit. Los volúmenes
más grandes requerirán más tiempo para equilibrarse. Si se usa un
baño María para acelerar el proceso, asegúrese de que se mantenga a
temperatura ambiente; no use un baño de agua caliente para los controles,
muestras o diluyente.
Si se procesan simultáneamente dos lotes de kits distintos, asegúrese de
etiquetar las bandejas de reactivos, etc., de modo que todos los reactivos
de un lote se usen con las placas correspondientes.
Apéndice A: Procedimiento de calibración de micropipetas

Materiales
En el caso de las etiquetas de volumen ajustable, se • Pipeta • Balanza analítica • Vaso de precipitado
deberían realizar calibraciones cuando menos para • Agua desionizada o • Recipiente de pesaje • Termómetro
dos ajustes, un volumen bajo y un volumen alto, a los destilada
parámetros usados comúnmente.

Sistema de calibración automatizado Procedimiento

El sistema de calibración de pipetas ARTEL PCS es®
1. A fin de prevenir resultados erróneos debidos a la evaporación,
un sistema de instrumento/reactivo automatizado que recomendamos humidificar la cámara de la balanza analítica al menos
se diseñó para facilitar la verificación frecuente y a 2 horas antes de la calibración. Esto puede lograrse al colocar en la
intervalos regulares del funcionamiento de las pipetas cámara un vaso de precipitado pequeño lleno con agua a la mitad, con
y la técnica del operador. Si desea obtener más todas sus puertas cerradas.
información, llame a ARTEL, al 1-888-406-3463 o al 2. Siga las instrucciones del fabricante para la limpieza y lubricación de las
1-207-854-0860, o visite su sitio web, en artel-usa.com. pipetas antes de la calibración.
3. Se debe mantener constante la temperatura ambiente, con diferencial de
±0.5°C, preferentemente en 18–26 °C.
4. Permita que un volumen suficiente de agua desionizada o destilada
alcance temperatura ambiente y tome una lectura de temperatura.
5. Registre el peso inicial del recipiente de pesaje o ponga a cero la balanza.
6. Use una punta nueva de pipeta cada vez que vierta material, pipetee agua
en el recipiente de pesaje y registre el peso. Repita este paso 10 veces.
7. Calcule el volumen usado en cada vez.

Cálculos
1. Calcule el volumen real entregado del siguiente modo:
Peso del agua
Volumen =
Densidad del agua
Densidad del agua a 16–21 °C = 0,998 mg/µl
Densidad del agua a 22–25°C = 0,997 mg/µl
2. Calcule la media (mean, M), la desviación estándar (standard deviation,
SD) y el coeficiente de varianza (coefficient of variance, CV) de 10
volúmenes para determinar la precisión de la pipeta.
3. Determine la exactitud de la pipeta como sigue:
(1-[Diferencia entre el volumen declarado y real/Volumen declarado,]) X 100 =
exactitud (%)

Especificaciones recomendadas
1. Precisión: CV ≤5,0%
2. Exactitud: ≥95%

Etiquetado
Etiquete la pipeta con la fecha de calibración, las iniciales del técnico, la
precisión y la exactitud. Además, registre estos datos en un cuaderno de
notas de laboratorio o registro para almacenamiento a largo plazo.

23
24
Tipo de kit Número de lote Número de kits recibidos Fecha de recepción Fecha de caducidad Comentarios
Guía técnica de ELISA

Apéndice B: Tabla de control de inventario

 Número
Números Control Control Control Control Control Control Temperatura
Fecha Técnico de lote Comentarios
de placas negativo positivo interno interno interno interno ambiente
del kit

Apéndice C: Tabla de control de laboratorio

25
Guía técnica de ELISA

Apéndice D: Programa de mantenimiento y calibración

Procedimiento Diariamente Semanalmente Mensualmente Trimestralmente Anualmente

Pipetas
Limpiar el exterior
Revisar calibración
Limpiar el interior y las juntas

Diluidor
Irrigar el sistema con agua desionizada
Purgar el sistema
Revisar calibración*
Irrigar jeringas
Revisar/cambiar tubos Revisar Cambiar

Arandela
Irrigar el sistema con agua desionizada cuando
se usan soluciones de lavado que no sean el
agua desionizada y cuando se cambia entre
tipos de soluciones de lavado
Revisar trampas, filtros y espuma
Revisar las agujas de aspiración y vaciado en
búsqueda de goteo y desechos
Revisar los tubos y frascos en búsqueda de
proliferación microbiana
Descontaminación: irrigar el sistema con lejía o
una solución de alcohol*
Revisar calibración: purgar el sistema
Limpiar el exterior
Ejecutar el “ciclo de limpieza” con
agua desionizada*
Revisar/cambiar tubos Revisar Cambiar

Lector
Placa de calibración**
Alineación de lámpara Después de reponer la bombilla
Limpiar elementos ópticos
Limpiar el exterior

*Consulte la guía del fabricante para obtener las instrucciones específicas de su marca y modelo.
**Llame a Servicios Técnicos de IDEXX o al fabricante del lector para obtener recomendaciones sobre la calibración de placas.

26
Apéndice E: Revisión rápida de control de calidad

Supervisar y realizar un seguimiento del funcionamiento del ensayo en

tablas de control de calidad proporciona indicios para saber cuándo es
necesario solucionar problemas. La siguiente es una lista para que revise
si tiene problemas con su ELISA. Si ha seguido todos los pasos indicados
abajo y todavía tiene problemas con su ensayo, comuníquese con
Servicios Técnicos de Diagnóstico de Ganado y Aves de Corral [Livestock
and Poultry Diagnostics Technical Services] de IDEXX al 1-207-556-4895,
opción 2, o al 1-800-548-9997, opción 2.

Equipo
Tener al día el mantenimiento preventivo
Calibrar y limpiar las pipetas
Calibrar el lector
Desinfectar y mantener el sistema de lavado

Reactivos
Controlar el inventario: PEPS
Inspeccionar componentes
Llevar los componentes a temperatura ambiente
Prevenir la contaminación
Verificar el almacenamiento apropiado

Técnica
Supervisar la calidad de las muestras
Verificar la preparación de los reactivos
Verificar el mezclado adecuado de las muestras
Verificar el pipeteo adecuado
Revisar los tiempos: procesar placas múltiples
Revisar el lavado de las placas de ensayo
Usar controles internos: seguimiento de resultados

Otros
Supervisar la temperatura del laboratorio
Usar elementos desechables y depósitos esterilizados
Supervisar el funcionamiento del ensayo; anotar en un registro

27
Guía técnica de ELISA

Notas

28
Notas

29
Guía técnica de ELISA

Notas

30
Oficina central de Oficina central en Europa Oficina central en Asia
IDEXX Laboratories, Inc. IDEXX Europe B.V. IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive Scorpius 60 Building F 3F-5 N.° 88, Rei Hu Street
Westbrook, Maine 04092 2132 LR Hoofddorp Nei Hu District
EE. UU. Países Bajos 11494 Taipei
Tel.: +31 23 558 70 00 o Taiwán
Tel.: +1 207 556 4890 o
+1 800 548 9997 +00 800 727 43399 Tel.: +886 2 6603 9728
Fax: +1 207 556 4826 o Fax: +31 23 558 72 33 Fax: +886 2 2658 8242
+1 800 328 5461

© 2012 IDEXX Laboratories, Inc. Todos los derechos reservados. • 09-80259-00-ESL-A4

IDEXX y Test With Confidence son marcas registradas o marcas comerciales registradas de IDEXX Laboratories, Inc. o sus
filiales en los Estados Unidos de América u otros países. La política de privacidad de IDEXX está disponible en idexx.com.