07/11/2018
EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO
EXAMEN EN FRESCO Y
TINCIONES
MICOLOGÍA MÉDICA
FACULTAD DE QFB-UMSNH
MC. Karla G. Domínguez González
ERRORES EN
EXÁMENES
DIRECTOS
EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO
AZUL DE ALBERT Y AZUL DE
PARKER AL 10% EN KOH AL
10%
• Se usa para observ ar las
estructuras parasitarias de
Malassezia spp., en casos
de pitiriasis v ersicolor y
dermatitis seborreica
asociada a éstas
lev aduras.
• Uso similar al del KOH
clásico.
Solución de KOH del 10-30% • Confirmación inmediata
+ Glicerol 10% de elementos fúngicos.
• Sencillo, rápido y
económico.
• Se puede observ ar al
hongo sin modificación.
• Se efectúa a partir de
productos
anatomopatológicos;
como escamas, pelos y
exudados
(expectoraciones y otros
líquidos).
EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO
NEGRO DE CLORAZOL LUGOL
• Se usa el yodo del kit de
• Se v ende en un reactiv o tinción de Gram.
comercial (Delasco®) • Útil para observ ar los
• Contiene DMS al 10% y granos de casos de
colorante y colorante de actinomicetomas
negro de clorazol. (Nocardia sp.,
Actinomadura madurae)
• Se utiliza de manera
y eumicetomas (granos
similar al KOH.
blancos).
• Ventaja: el colorante
• Da contraste a
permite v er mejor las
estructuras.
estructuras.
• Sólo se pueden oberv ar
• Quedan teñidas de color
por pocos minutos.
v erde cloro- v erde
oscuro. • Nunca mezclar con
soluciones fuertemente
alcalinas.
EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO
LACTOFENOL AZUL DE ALGODÓN LACTOFENOL DE AMANN
• Azul de algodón 0.05 g
• Glicerol 40 mL
• Glicerol 40 mL
• Fenol (cristales) 20 g
• Fenol (cristales) 20 g
• Ácido láctico 20 mL
• Ácido láctico 20 mL
• Agua destilada 20 mL
• Agua destilada 20 mL
AZUL DE METILENO
El sulfito de sodio aclara • Azul de metileno 0.3 g
rápidamente, por lo que debe
• Alcohol etílico (95%) 30
observarse antes de 3 h. casi no
mL
genera artefactos. Es una solución
higroscópica por lo que no se • Agua destilada 70 mL
puede usar luego de dos meses.
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EXAMEN EN FRESCO O DIRECTO TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA

SULFITO DE SODIO AL 10%
• Sulfito de sodio 10 mL
• Alcohol etílico 80° 25 mL
• Agua destilada 75 mL
GRAM • Útil para seudomicosis
Aclara lentamente y carece da superficiales como
actividad antifúngica, por lo que queratólisis punctata,
el material utilizado para eritrasma, tricomicosis,
observación directa se puede
y profundas, como
cultivar; debe observarse antes de
3h nocardiosis y
botriomicosis.
• Casos de infecciones
LAURILSULFATO DE SODIO por Malassezia, como
AL 5% catéteres, dermatitis
• Laurilsulfato de sodio 5 g seborreica, pustolosis,
etc.
• Agua destilada 95 mL
• Ver a 100X
GIEMSA • Extendidos o frotis de
médula ósea, sangre y
pus pueden ser teñidos
por este colorante.
• Se buscan estructuras
intracelulares
(histoplasma,
peniciliosis), las cuales
son fagocitadas por
los macrófagos y
polimorfonucleares.
• Esta tinción permite
v er las estructuras
micóticas.

TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA

ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (PAS) METAMINA DE PLATA (Gromori-Grocott)
ZIEHL-NEELSEN (ZN) • Presencia de • Tinción clásica para la • Al igual que la tinción de
actinomicetos con mayoría de los hongos. PAS, se considera de
características de • Las características rutina para la
ácido-alcohol- basófilas o eosinófilas de identificación de la
muchas estructuras mayoría de las micosis.
resistencia total o
fúngicas, permiten que al • Las estructuras micóticas
parcial, como
procesar las muestras tienden a tomar una
Nocardia spp. con esta tinción sean tonalidad negra por la
• Casos de visibles de manera clara. oxidación de la plata.
micobacterias no • Las estructuras fúngicas • Puede tener limitaciones
tuberculosas, deben intracelulares sobre estructuras
ser procesados con (endosporas de esférulas intracelulares.
esta tinción. de coccidiodomicosis o • Se utiliza de elección en
• Se puede utilizar la rinosporidiosis), pueden el Dx de neumocistosis,
verse con esta tinción. paracoccidiodomicosis y
tinción de Kinyoun.
• Actinomicetomas. mucormicosis.

TINCIONES ÚTILES EN MICOLOGÍA CULTIVO

OTRAS MEDIOS DE CULTIVO RUTINARIOS
• Fontana-Masson CALDO DEXTROSA DE
• Gridley SABOURAUD
• Mucicarmín de Meyer
• Blanco de calcoflúor • Este medio líquido es de
• Solución de DMSO utilidad para el transporte
• Sulfito de sodio al 10%
CULTIVOS Y TÉCNICAS DE de muestras tomadas con
hisopo.
• Laurilsulfato de sodio al
5%
CULTIVO • Evita la pérdida de
viabilidad del
• Microscopio de
microorganismo.
Fluorescencia MICOLOGÍA MÉDICA
FACULTAD DE QFB-UMSNH • Primocultivo de levaduras.
• Reactivación de cepas de
MC. Karla G. Domínguez González hongos por deshidratación.

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Cultivo de la Muestra (Agar) Papa-Dextrosa

BHI con/sin Antibiótico CULTIVO
 Base de pulpa de
papa.  Hongos filamentosos y Agar alpiste negro
Sabouraud Micosel, micobiótico levaduras. • Medio ideado para
 Glucosa/dextrosa Crypt ococcus
• 2% glucosa. • Harina de soya  Sangre de carnero. • Se puede diferenciar por la
• pH 6.9 • Dextrosa Como estimulante de presencia de la enzima
fenol-oxidasa de este
• Medios • Ciclohexamida y pigmento: Antibiótico:
microorganismo.
estándar. cloranfenicol  Zanahoria y bilis  Cloranfenicol, Gentamicina, • Un medio similar es el medio
Cicloheximida. DOPA o dihidroxido de
• No ideal para fenilalanina (agar Staib),
esporulación. cuyo fundamento es el
mismo.
• Puede contener
cloranfenicol o
gentamicina.

Colonias de Penicillium expansum (A) y Botrytis

cinerea (B), creciendo en medio Agar Papa
Dextrosa.

Medios enriquecidos: agar

Borelli, agar amaranto, agar CULTIVO CULTIVO CULTIVO
tierra de jardín, agar Medios diferenciales: medios cromogénicos (CHROMagar-
Agar corn meal + tween 80 al 1% Candida®, Candiselect4 ®)
Czapek-Dox
• Cuando los hongos sufren • Son medios utilizados
Formación de
pleomorfismo fúngico; el como interpretación
clamidoconidios, útil para
uso de medios bioquímica, por medio de
identificar especies de
enrriquecidos permite cambios de coloración en
Candida como C. albicans y
revertir el fenómeno y las colonias o hidrólisis de
C. dubliniensis.
estimular la producción de metabolitos.
formas microsporicas, • Son utilizados para la Id de
pigmentos y colores de especies de Candida
superficie. • Agar Borelli: Dermatofitos
• A. Harina de Amaranto: Sporothrix
sp.
• A. Tierra de jardín: Histoplasma
capsulat um, Coccidiodes immit is,
C. posadasii y Paracoccidioides
brasiliensis.
• A. Czapek Dox: Aspergillus.

CULTIVO TÉCNICAS DE CULTIVO TÉCNICAS DE CULTIVO

Técnica de Resiembra
Agar Lowenstein-Jensen
LEVADURAS: Técnica de MICROCULTIVO
Se colecta y transfiere con asa de
• Se utiliza para tener platino bacteriológica y se siembra en
primoaislamientos de estría simple o cruzada, de pendiendo Técnica especializada para
actinomicetos, como de las necesidades; YA SEA PLACA O estimular que los hongos
Act inomadura, TUBO. generen estructuras de
St reptomyces por sus reproducción debido a la
exigencias nutricionales, escasez del alimento y así
así como Micobacterium. poder lograr una correcta
identificación del mismo.
H. FILAMENTOSO:
Se trata de recolectar parte del
micelio con un asa micológica y
transferirlo a un medio en tubo o
placa tratando de enterrar un poco
parte del mismo haciendo una
rasgadura o una rasgadura en forma
de cruz para crecimiento radial.

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MICROCULTIVO
MICROCULTIVO

MICROCULTIVO

MICROCULTIVO MICROCULTIVO MICROCULTIVO

MICROCULTIVO
TÉCNICAS DE CULTIVO
Cultivo sobre pelo
En una caja de Petri, se pone
tierra húmeda y se depositan
pelos o cabellos sanos: Este
procedimiento permite aislar
dermatofitos del suelo y
estudiar sus formas sexuadas.
MORFOLOGÍA MICROSCOPICA
Análisis de un fragmento del cultivo
Consiste en tomar un
fragmento de la colonia,
dilacerarlo y observarlo con
azul de lactofenol. Es el
método habitual, pero puede
destruir los aparatos esporíferos
y dificultar la identificación.

Método de la cinta adhesiva trasparente

Permite observar las estructuras fúngicas
casi sin alteración. Se recorta un pequeño
cuadrado de cinta y se adhiere a la parte
terminal del asa de platino, después se
aplica la parte adhesiva sobre la colonia y
luego se coloca sobre un portaobjetos con
una gota de colorante y cubreobjetos.

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INOCULACIÓN EXPERIMENTAL
Inoculación plantar en ratón
Los animales más utilizados para
este ensayo, son: cobayo, conejo,
ratón, hámster, rata, palomas u
otras aves. Son útiles para el
estudio de diversas micosis como:
• Dermatofitos
• Pitiriasis versicolor,
• Dermatitis seborreica,
• Tiña negra, esporotricosis,
• Cromoblastomicosis
• Actinomicetoma,
• Histoplasma,
• Coccidioides
• Blastomicosis,
• Paracoccidioidomicosis,
• Candidosis,
• Criptococosis
• Aspergilosis
PRUEBAS INMUNOLÓGICAS
Determinación de antígenos:
GLUCANOS
• Son componentes esenciales de la
pared celular de especies de
Aspergillus, Candida y Pneumocystis;
el 1-3-β-D-glucano se libera al
momento de la infección
(exoantÍgeno); por tanto, su
valoración sérica determina una
probable infección fúngica como
aspergilosis, candidosis y
neumocistosis.
Se sostiene con firmeza la cabeza del ratón,
colocándolo sobre malla de alambre y se
inmoviliza al asir la cola y las orejas; se
sostiene con firmeza la pata derecha y se
inserta la aguja en el cojinete plantar y se
inyectan 0.05 a 0.08 ml de la suspensión con
el hongo.
PRUEBAS
INMUNOLÓGICAS
MICOLOGÍA MÉDICA
FACULTAD DE QFB-UMSNH
MC. Karla G. Domínguez González
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INOCULACIÓN EXPERIMENTAL INOCULACIÓN EXPERIMENTAL
Inoculación Intraperitonial Inoculación Intratesticular
Se presiona la cavidad abdominal
Se sostiene el animal de la misma
manera, se flexiona la cabeza y se para hacer visibles los testículos y
se inyecta la suspensión
elevan las patas para disminuir las
posibilidades de lastimar las
vísceras, se inserta el agua en la
Inoculación Intravenosa Inoculación Intracerebral
línea media del abdomen y se
inyectan 0.5 ml de la suspensión.
Generalmente usada en conejos Se utiliza una aguja de calibre 26 o
usando las venas del pabellón 27 de bisel corto; se anestesia al
Luego se buscan nódulos
auricular. ratón de 4 a 5 semanas de edad con
blanquecinos y se extirpan para el éter o cloroformo; se inmoviliza e
diagnóstico. inyecta sobre las orejas.
Se inyecta en la parte superior del
Inoculación superficial cráneo un poco a la derecha de la
línea media, hasta que se percibe un
Sólo se practica en caso de pequeño estirón; se inyecta con
dermatofitos. Se depila y escarifica lentitud 0.02 ml de la muestra; la
la región abdominal del conejillo y muerte en las primeras 24 h indica
se unta con miel de abeja que traumatismo por la inoculación.
contiene el dermatofito.
PRUEBAS INMUNOLÓGICAS PRUEBAS INMUNOLÓGICAS
Determinación de antígenos: Determinación de antígenos:
Glucoroxilomananos, glucanos y galactomananos GLUCOROXILOMANANOS
• Indicado como prueba para el
diagnóstico de la Criptococosis .
• Se deben interpretar con mucho cuidado.
• Es la determinación del antígeno
criptococósico (en LCR y otros fluidos.
• Las muestras biológicas que pueden dar una reacción positiva a la
presencia de los antígenos no necesariamente son indicadas para
• Se hace por aglutinación en látex
revestidas por anticuerpos anticápsula
recuperar hongos viables en los cultivos; (DACAD).
• Tiene una sensibilidad muy alta
• En muchas ocasiones, sobre todo si se evalúa la prueba como parte (>90%).
de la respuesta terapéutica, el hallazgo de una reacción positiva • También es útil en el monitoreo
puede ser indicativo de fragmentos antigénicos o estructuras terapéutico.
micóticas NO VIABLES en la muestra.
• Las principales pruebas utilizadas son para el diagnóstico de
Criptococosis, Candidosis y Aspergilosis.
PRUEBAS INMUNOLÓGICAS INTRADERMOREACCIÓN
Determinación de antígenos: • La aplicación de antígenos fúngicos
de forma intradérmica tiene como
GALACTOMANANOS finalidad evaluar la respuesta
inmunológica tipo IV .
• Son exoantÍgenos de las diversas • Se usan para fines epidemiológicos o
especies de Aspergillus; son liberados a para el transcurso de la enfermedad.
nivel sanguíneo y se pueden detectar
• Los antígenos más utilizados son
en diversos fluidos como suero, orina,
histoplasma, coccidiodina,
LCR y lavado bronquial.
paracoccidiodina, esporotricina y
• Es la prueba mas útil para el diagnóstico tricofitina.
precoz de Aspergilosis pulmonar
• Otros tipo de antígenos extraídos de
invasiva y diseminada, así como para
cultivos de hongos son más usados
seguimiento terapéutico.
para evaluar respuestas frente a
• La técnica mas útil es mediante ELISA diversos aeroalergenos (Aspergillus
de doble sandwich en placa (Platelia- niger, Cadosporium cladosporioides,
Aspergillus®), el cual es un método Alternaría alernata, etc.) Estos
sensible y altamente reproducible, con utilizados como cutirreacciones que
eficacia global entre 83-96%. elevalúan inmunidad tipo I
(hipersensibilidad).
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INTRADERMOREACCIÓN
• Se llevan a cabo con la
aplicación intradérmica de
antígenos obtenidos de filtrados
de cultivos o extractos de
polisacáridos (fase filamentosa o
levaduriforme) de los hongos.
• Se inyecta 0.1 ml de la solución
en la cara anterior del antebrazo
o en la región
interescapilovertebral; la lectura
se efectúa en 24 a 48 h.
• La intensidad de la reacción se
mide por el tamaño de la
induración, no del eritema.
• Una reacción (+) mide 5 mm de
diámetro, una dudosa menos de
5 mm y, si no se presenta
induración, es negativa.
RADIOLOGÍA
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INTRADERMOREACCIÓN SEROLOGÍA
• Las reacciones serológicas más conocidas son las de anticuerpos precipitantes o
• Estas pruebas son auxiliares en el reacciones de precipitación.
diagnóstico, el pronóstico o la valoración
del estado inmunitario del huésped. • Emplean antígenos celulares (somáticos) y metabólicos, según provengan de
machacados de cultivos o de filtrado de los mismos. Una de las técnicas utilizadas
Por ejemplo, una candidina positiva es la doble difusión en agar, la cual se practica en cajas de Petri que contienen
•
indica contacto previo con el hongo; la gelosa (agar); en un lado se deposita el suero del paciente y, en el otro, el
antígeno; la reacción antígeno-anticuerpo se manifiesta por líneas opacas de
tricofitina es útil en dermatofitosis
inflamatorias y profundas; una precipitación
esporotricina positiva en presencia de
lesiones clínicas es diagnóstica; la
coccidioidina es una
intradermorreacción muy específica, una
respuesta positiva indica infección; si
existen lesiones importantes y es positiva,
indica buen pronóstico pero si es
negativa y acompaña a títulos altos de
anticuerpos fijadores de complemento, el
pronóstico es malo. Algunas, como la
histoplasmina y la paracoccidioidina,
generan reacciones cruzadas entre sí.
BIOLOGÍA MOLECULAR EN MICOLOGÍA