Tema 2. DG Preconcepcional Varón

Genética Reproductiva
Tema 2.
Diagnóstico Genético Preconcepcional en el varón
Dra. Virginia García-Láez Moreno
© Virginia García-Láez Moreno

DGPreconcepcional en el varón
A) Estudio cromosómico del varón

Cariotipo en sangre periférica
Estudio de la meiosis con preparaciones cromosómicas de tejido testicular:

Estudio clásico mediante Tinción de Leishman.
Técnica FISH Múltiple con sondas de pintado cromosómico
Técnicas inmunocitogenéticas con Ac
Estudio del espermatozoide:
Técnica citogenética de Hibridación in situ fluorescente (FISH)
Selección del spz por citometría de flujo
B) Estudio genético del varón

C) Otras pruebas preconcepcionales
Chequeo preconcepcional en ambos progenitores

Cuando buscamos un embarazo….
Para descartar enfermedades hereditarias o trastornos que podrían

causar problemas en el desarrollo del feto o riesgo para la madre
durante la gestación.
Si existen problemas para concebir …
Algunos defectos genéticos o cromosómicos pueden ser los

causantes de la infertilidad de las parejas.
Indicaciones de un estudio genético preconcepcional

> 35 años.
Antecedentes familiares de enfermedades hereditarias.
Abortos espontáneos previos.
Infertilidad.
Parentesco de los progenitores.
RNV anterior con retraso mental, alteraciones en el desarrollo o malformaciones congénitas.
Las TRA se saltan barreras naturales de selección de spz.

Varones con Factor Seminal Grave ! Conseguir embarazo gracias a las TRA
Cariotipo en sangre
periférica
A) Estudio cromosómico

Analizamos células sanguíneas pero todas las células del organismo tienen la
misma dotación cromosómica.
Analizar los cromosomas para identificar alteraciones en el número o la
estructura de los mismos.
Numérica ! Klinefelter (47, XXY) ! Esterilidad por azoospermia
Estructurales equilibradas ! 4-5% población ! oligozoospermia y gametos
desequilibrados ! embriones anormales ! bloqueo embrionario.
Pero algunos llegan a implantar y dan RNV con anomalías.
Anomalías del cariotipo son más frecuentes en la población infértil

5-6% varones infértiles ! cariotipo anormal en sangre
Varones infértiles con cariotipo normal en sangre ! 2-17% anomalías
meióticas en los spz
Anomalía en el cariotipo ! causa de infertilidad

Lo importante es diagnosticar las anomalías cromosómicas y genéticas
en los espermatozoides de los varones infértiles con cariotipo normal
Objetivo
Diagnosticar el problema de infertilidad.
Evitar en el futuro hijo malformaciones congénitas o enfermedades hereditarias.
Consejo genético
Si cariotipo anormal ! Realizar un DG Preimplantacional del embrión para
asegurar un RNV sano.
Estudio de la meiosis
en tejido testicular
A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular
4-8% de los pacientes infértiles ! anomalías en la meiosis del spz

18-40% de anomalías en la meiosis conforme baja concentración espermática
(<1.5 mill/ml).
!10

Anomalías meióticas detectadas en varones infértiles
Error en el proceso de sinapsis de Error en el proceso de

cromosomas homólogos recombinación o quiasmas
Asinapsis ! No apareamiento de crom. homólogos

en profase I. Ocurre reducción de nº de quiasmas o
Desinapsis ! apareamiento alterado o incompleto una distribución anómala
de cromosomas homólogos en profase I
Alineación incorrecta de los crom.

Entrada prematura en Metafase I y Anafase I en el huso y ambos crom. son
y una separación precoz de bivalentes desplazados al mismo polo.

Errores en los procesos de Errores en los procesos de

sinapsis de cromosomas recombinación o quiasma
homólogos
Se generan spz con dotación cromosómica numérica anómala, es decir, no

haploide.
Embrión aneuploide
Diploide


homólogos
Durante la Meiosis existen Puntos de Control
Bloqueo meiótico:
Detención de la espermatogénesis en cualquier estadio madurativo de la
línea germinal ! Disminución de la producción de espermatozoides
Oligozoospermia (Bloqueo parcial) o Azoospermia (Bloqueo completo)


homólogos
Puntos de control de la Meiosis
spz con anomalías cromosómicas

Hibridación in situ fluorescente en los

espermatozoides (FISH) para el
estudio cromosómico del varón
A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides
Más utilizado en la práctica clínica ya que es una forma menos invasiva de

obtener el material reproductivo.
El seminograma nos informa tan sólo del nº y características de los spz del
eyaculado pero nada sobre la integridad del ADN o su dotación cromosómica.
FISH: Técnica citogenética para el análisis cromosómico de los spz

Muestra de semen eyaculado, de epidídimo o de testículo.
Núcleos en interfase
Basado en contabilizar el nº de cromosomas en el núcleo del spz
Crom. deben estar marcados con sondas de ADN fluorescentes.
Espermatozoide haploide debe tener una única señal de fluorescencia para cada
cromosoma
Cromosomas estudiados:
13, 18, 21, X e Y
RNV con anomalías cromosómicas

Inconvenientes asociados a las características del spz:

Cromatina muy condensada (protaminas que forman puentes disulfuro) ! las
sondas pueden tener problemas para acceder al ADN
Núcleo muy pequeño ! No podemos analizar a la vez más de dos o tres
cromosomas (solapamiento ! mala visualización)

Indicaciones
Varones infértiles con Cariotipo normal:
Baja calidad seminal (O, A, T Severa)
Azoospermia obstructiva o secretora
Abortos de Repetición
Fallos en FIV
Edad Paterna Avanzada
Estudio de meiosis anormal en biopsia de testículo
Parejas con embarazo previo con una cromosomopatía
Post tratamiento de quimioterapia o radioterapia
Varones infértiles con Cariotipo alterado:
Alteraciones cromosómicas estructurales: Translocaciones o inversiones.
Alteraciones en los cromosomas sexuales: XXY o XYY

Indicaciones
Varones infértiles con Cariotipo normal:
Baja calidad seminal
Azoospermia obstructiva o secretora
Abortos de Repetición
Fallos en FIV
Edad Paterna Avanzada
Estudio de meiosis anormal en biopsia de testículo No se les suele hacer
Parejas con embarazo previo con una cromosomopatía
Post tratamiento de quimioterapia o radioterapia FISH ya que la
Varones infértiles con Cariotipo alterado: recomendación es
Alteraciones cromosómicas estructurales: DGPreimplantacional
Translocaciones o inversiones.
Alteraciones cromosómicas numéricas en los crom. sexuales:
Klinefelter (47, XXY) o Super Y (47, XYY)

Protocolo
A) Fijación en un
portaobjetos
Solución “Carnoy”
(metanol + ac acético 3:1),

Protocolo
A) Fijación en un
portaobjetos
Protocolo
B) Hibridación de los núcleos de los spz con sondas fluorescentes
Protocolo
B) Hibridación de los núcleos de los spz con sondas fluorescentes

Protocolo
1000 a 2000 spz
C) Interpretación de las señales de hibridación
por muestra
Haploide o normal: una única señal para cada cromosoma analizado.

Disómico: dos señales para un cromosoma concreto y una señal única para
el resto de cromosomas analizados.
Diploide: dos señales para cada uno de los cromosomas analizados.
Nulisómico: Ausencia de señal para un cromosoma concreto.

Protocolo
La ausencia de señal para un cromosoma concreto podría ser por:
Nulisomía La proporción de nulisomías debería

ser la misma que de disomías
Fallo de hibridación

Protocolo
Criterios de evaluación! Reducir errores del observador ! Reproducible
Evaluar spz con contorno definido y no superpuestos con otros.
Evaluar señales de hibridación localizadas claramente en el interior del núcleo.
En casos de disomía y diploidía ambas señales deben tener la misma intensidad y

estar separadas entre sí por una distancia mínima equivalente al diámetro de cada
señal.
Resultado del FISH ! Anormal

Incremento significativo en la incidencia de AC para al menos uno de los
cromosomas analizados comparado con un grupo control de donantes fértiles
normozoospérmicos.
Las AC más frecuentes en spz de varones infértiles con cariotipo normal son:
Aneuploidías para los cromosomas sexuales
Diploidías
Implicación del FISH Anormal A nivel embrionario
Spz con disomía para los crom.sexuales Spz con diploidia
Embriones aneuploides para los crom. Sex Embriones triploides
Son compatibles con la vida Implantan ! aborto

Implicación del FISH Anormal A nivel clínico
Tasa de fecundación similar entre FISH normal y anormal

FISH Anormal! Menor tasa de gestación e implantación
Mayor tasa de aborto
Implicación del FISH Anormal A nivel de la descendencia
Padre con FISH con alta incidencia Mayor probab. en la descendencia de

de aneuploidías de los crom sexuales anomalías de los crom. sexuales
Padre con FISH con alta incidencia Mayor probab. en la descendencia

de disomía del 21 o aneuploididas de de anomalías del cromosoma 21
los crom. sexuales o diploidía
Implicación del FISH Anormal
Asesorar a la pareja:
Cambio de gameto ! donante de semen
Diagnóstico genético preimplantacional en el embrión
Diagnóstico genético prenatal tras el embarazo
Selección preconcepcional
del sexo del espermatozoide
por citometría de flujo
Preconcepcional ! gameto
Cromosómico ! seleccionamos un cromosoma
A) Estudio cromosómico Selección del sexo del espermatozoide
Técnicas utilizadas para la selección de spz
Citometría de flujo ! diferencias de peso
Métodos inmunomagnéticos ! Ac monoclonales frente al antígeno de

superficie H-Y (Sills ES 1998)
Centrifugación y gradientes de densidad ! diferencias de peso

Selección de spz sin aneuploidías ! diploides o triploides pesarán
más que los haploides.
Enriquecimiento de la muestra con X o Y ! 80-90% de fiabilidad.

100% fiabilidad ! DGPreimplantacional
CITOMETRÍA DE FLUJO MICROSORT®
Tecnología basada en el Cell Sorting.

Separación de los espermatozoides según su diferencia en la cantidad de DNA
total (2.8%) ! Spz X con más cantidad de ADN, más grande, con más peso !
nadan más despacio que los spz que llevan un cromosoma Y.
1995 ! 1ra gestación

2002 ! 259 RNV

CITOMETRÍA DE FLUJO CON
MICROSORT®
Fundamento de la técnica
La muestra de semen se tiñe con un fluorocromo

(Hoechst 33342) que se une de forma no covalente al
ADN.
El citómetro detecta la diferencia de fluorescencia
entre spz X e Y.
Un sorter los selecciona y separa.
Muestra Comprobación mediante FISH spz

Congelación para TRA
CITOMETRÍA DE FLUJO CON MICROSORT®

Limitaciones de la técnica
1. El uso de bisbenzimida (agente potencialmente mutagénico).
15% del ADN más desprotegido
2. Menores tasas de gestación ! Jóvenes y fértiles
3. La recuperación espermática tras el sexado es muy baja (0,6 - 1,2%) !
deberíamos partir de un recuento bastante alto.
Baja recuperación ! Spz no seleccionados debido a su morfología anómala o
por no ser bien diferenciados.
4. Condicionamos al ICSI, en lugar de IA o FIV.
5. Coste elevado del sexado además del coste de la TRA.
Selección del sexo del bebé puede tener 2 aplicaciones
Evitar enfermedades ligadas al sexo (500)

Ligadas al crom X o crom. Y
Recesivas o dominantes
Mujeres portadoras y varones enfermos al 50%
Ej. Hemofilia o Distrofia muscular de Duchenne
Balance o equilibrio familiar

Si >2 hijos del mismo sexo ! elegir sexo menos representado
FIN !!!
Gracias por su atención.
!39
Genética Reproductiva
Tema 2.
Diagnóstico Genético Preconcepcional en el varón
Dra. Virginia García-Láez Moreno
© Virginia García-Láez Moreno !1

A) Estudio cromosómico del varón

Cariotipo en sangre
Estudio de la meiosis con preparaciones cromosómicas de tejido testicular
Estudio del espermatozoide
Algunas mutaciones genéticas pueden causar
diferentes grados de infertilidad masculina
B) Estudio genético del varón
Fibrosis quística Microdeleciones del cromosoma Y
Distrofia miotónica Síndrome de Kartagener
Hemocromatosis Síndrome de Noonan
Mutaciones del gen receptor de andrógeno
C) Otras pruebas preconcepcionales

B) Estudio genético Fibrosis quística (FQ) o Mucoviscidosis
Enfermedad autosómica recesiva.

1/2500 RNV enfermos y 1/25 portadores sanos.
Mutaciones del gen CFTR que está en el brazo largo del crom 7.
Codifica la proteína CFTR que regula el paso de iones por la mb cel.
Existen unas 1500 mutaciones en este gen.

La más frecuente (65%) es la deleción de 3 pb que produce ausencia de una
Fenilalanina en posición 508 (F508del).
Ocurre una degradación intracelular de la proteína.
Otras mutaciones del gen CFTR producen proteínas completamente

procesadas pero que no actúan correctamente.
Indicación para el estudio de mutaciones del gen de FQ! azoospermia

obstructiva.
Ausencia de prot CFTR ! crea una
mucosidad muy espesa y pegajosa que
obstruye los cond. deferentes antes del
nacimiento.
Agenesia bilateral congénita de los

conductos deferentes (hipoplasia de
vesículas seminales, conductos eyaculadores
y epidídimo).
Más del 95% de varones con FQ tienen problemas de fertilidad o son estériles.
Se produce una azoospermia obstructiva pero la espermatogénesis es normal !

Hay un problema de transporte pero si hay producción de spz.
Solución para tratar la infertilidad y tener descendencia ! TRA (BT o AE y ICSI).
Técnicas de diagnóstico:
1. Prueba del sudor ! determinar la [Cl y Na] en la piel
El resultado es + en el 98% de los casos con FQ
2. Genotipado de gen CFTR para la detección de mutaciones
Aconsejable un análisis genético de la pareja y si fuera portadora de alguna

mutación en el gen CFTR es aconsejable un DGP en los embriones.
Si embrión hereda las dos copias del gen afectas ! enfermo de FQ
B) Estudio genético Microdeleciones del cromosoma Y
Cromosoma Y:
Brazo corto ! Gen determinante del sexo (SRY)
Brazo largo ! Genes relacionados con la

espermatogénesis (Región AZF)
AZFa, AZFb, AZFc (AZFc ! gen DAZ).
Gran cantidad de heterocromatina no codificante
La mayoría de las microdeleciones se producen en la región

AZFc y afectan al gen DAZ. Con la pérdida de genes ! se
afectaría la espermatogénesis.

Indicación para el estudio de microdeleciones del crom Y! azoospermia
secretora u oligozoospermia severa
Un 1-2% de los varones infértiles con valores seminales por debajo de la
normalidad presentan microdeleciones del crom Y
Un 15% de los varones con azoospermia idiopática u oligozoospermia severa
presentan microdeleciones en el crom Y.
Microdeleciones en AZFa ! aplasia de células germinales

Microdeleciones en AZFb ! bloqueo de la espermatogénesis
Microdeleciones en AZFc ! bloqueo postmeiótico
Microdeleción de las tres regiones AZF ! ausencia total de espermatozoides.

Microdeleciones en AZFa y AZFb ! no se suelen encontrar espermatozoides.
Microdeleciones en AZFc ! si espermatozoides y tener aceptables tasas de embarazo.
Solución para tratar este tipo de infertilidad y tener descendencia ! TRA

(BT o AE y ICSI)
Aunque esta microdeleción será transmitida a la descendencia masculina.
Técnica de diagnóstico:
Análisis de sangre y Aislamiento del ADN.
PCR múltiplex con electroforesis capilar o análisis de fragmentos.
B) Estudio genético
Distrofia muscular miotónica (DMM) tipo 1 o Enfermedad de Steinert
Patrón de herencia autosómica dominante.
Mutaciones en el gen DMPK en el cromosoma 19.
Codifica una proteína quinasa del músculo esquelético: Miotonina
Expansión de un triplete (CTG)
Normal! 5-37 repeticiones Premutación inestable ! 38-49 repeticiones
Enfermo! 50-3000 repeticiones
Proteína afectada ! Enf. multisistémica ! debilidad muscular.

Reproducción ! atrofia de los testículos y disminución o ausencia de spz !
fertilidad reducida
Solución: TRA
Síndrome de Kartagener o Discinesia ciliar primaria
Patrón de herencia autosómico recesivo.

Mutaciones en genes DNAH5 (crom 5) y DNAH11 (crom 9)
Codifica la proteína Dineína que está implicada en la movilidad de los
cilios y flagelos.
Proteína afectada ! Spz inmóviles
Síntomas ! astenozoospermia
(producción de spz inmóviles pero vivos)
Solución: TRA
Hemocromatosis hereditaria (HH)
Patrón de herencia autosómico recesivo.
Mutaciones en el gen HFE del crom 6.
Codifica proteína HFE implicada en la regulación del hierro
Identificadas unas 20 mutaciones:
Cisteína por tirosina en posición 282 (C282Y) Histidina
Histidina por ác. aspártico en posición 63 (H63D)
80-90% de los enf de HH son homocigotos C282Y/C282Y
Proteína afectada ! Elevada absorción de hierro en el intestino y un depósito

de hierro en diferentes órganos.
Reproducción ! 80% ocurre una disfunción testicular que afecta a la
producción de espermatozoides.
Síndrome de Noonan
Patrón de herencia autosómico dominante
Muchos genes implicados de distintos cromosomas.
50% causada por mutaciones sin sentido en el gen PTPN11 !
ganancia de función de la proteína SHP-2.
Otras mutaciones en otros genes de la vía metabólica RAS MAPK.
Reproducción ! disfunción testicular que afecta a la producción de

espermatozoides.
Mutaciones del gen receptor de andrógeno o Síndrome de insensibilidad
androgénica (SIA)
Patrón de herencia ligado al cromosoma X y recesivo.

Transmitido de madre a hijo.
Existen >600 mutaciones en el gen AR
Codifica la proteína del receptor de andrógenos.
Mutaciones pueden ser: puntuales (82%), deleción parcial del gen (4%) o
completa (1%).
Proteína afectada ! Afectado el receptor de la testosterona ! ambigüedad
genital ! Infertilidad
Cariotipo XY pero fenotipo de mujer (parcial o completo) dependiendo de la
gravedad del síndrome.
C) Otras pruebas preconcepcionales en el varón
Espermiograma
Análisis de viabilidad (Astenozoospermia ! no movilidad)
Fragmentación del ADN (MACS ! columnas de Anexina)
Perfil transcriptómico espermático (mRNA)

Perfil lipídico
Perfil proteómico
Análisis de sangre rutinario y cultivo microbiológicos

FIN !!!
Gracias por su atención.
!15

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Genética Reproductiva

Dra. Virginia García-Láez Moreno

© Virginia García-Láez Moreno

A) Estudio cromosómico del varón

Estudio de la meiosis con preparaciones cromosómicas de tejido testicular:

B) Estudio genético del varón

Chequeo preconcepcional en ambos progenitores

Para descartar enfermedades hereditarias o trastornos que podrían

Si existen problemas para concebir …

Algunos defectos genéticos o cromosómicos pueden ser los

Indicaciones de un estudio genético preconcepcional

Las TRA se saltan barreras naturales de selección de spz.

Cariotipo en sangre periférica

Anomalías del cariotipo son más frecuentes en la población infértil

Anomalía en el cariotipo ! causa de infertilidad

A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular

4-8% de los pacientes infértiles ! anomalías en la meiosis del spz

A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular

Error en el proceso de sinapsis de Error en el proceso de

Asinapsis ! No apareamiento de crom. homólogos

Alineación incorrecta de los crom.

A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular

Errores en los procesos de Errores en los procesos de

Se generan spz con dotación cromosómica numérica anómala, es decir, no

A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular

Errores en los procesos de Errores en los procesos de

Durante la Meiosis existen Puntos de Control

A) Estudio cromosómico Estudio de la meiosis en tejido testicular

Errores en los procesos de Errores en los procesos de

Puntos de control de la Meiosis

spz con anomalías cromosómicas

Hibridación in situ fluorescente en los

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

Más utilizado en la práctica clínica ya que es una forma menos invasiva de

FISH: Técnica citogenética para el análisis cromosómico de los spz

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

13, 18, 21, X e Y

RNV con anomalías cromosómicas

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

Inconvenientes asociados a las características del spz:

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

Haploide o normal: una única señal para cada cromosoma analizado.

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

La ausencia de señal para un cromosoma concreto podría ser por:

Nulisomía La proporción de nulisomías debería

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

C) Interpretación de las señales de hibridación

Criterios de evaluación! Reducir errores del observador ! Reproducible

Evaluar spz con contorno definido y no superpuestos con otros.

Evaluar señales de hibridación localizadas claramente en el interior del núcleo.

En casos de disomía y diploidía ambas señales deben tener la misma intensidad y

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

Resultado del FISH ! Anormal

A) Estudio cromosómico FISH de espermatozoides

Implicación del FISH Anormal A nivel embrionario

Spz con disomía para los crom.sexuales Spz con diploidia