Lectura Replicación Del ADN (01-25) .En - Es

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CAPÍTULO 9
La replicación del ADN
W.
CUANDO SE DESCUBRIÓ LA DOBLE HÉLICE DEL ADN, la característica que más
Lo que más entusiasmaba a los biólogos era la relación complementaria entre
las bases de sus cadenas de polinucleótidos entrelazadas. Parecía inimaginable
que una estructura tan complementaria no se utilizara como base para la replicación del DESCRIBIR
ADN. De hecho, fue la naturaleza autocomplementaria revelada por la estructura del ADN
lo que finalmente llevó a la mayoría de los biólogos a aceptar la conclusión de Oswald T.
Avery de que el ADN, y no alguna forma de proteína, era el portador de la información
genética (Capítulo 2). La química del ADN
En nuestra discusión sobre cómo actúan las plantillas (Capítulo 4), enfatizamos Síntesis, 258
que dos superficies idénticas no se atraerán entre sí. En cambio, es mucho más fácil †
El mecanismo del ADN
visualizar la atracción de grupos con forma o carga opuesta. Así, sin ningún
Polimerasa, 260
conocimiento estructural detallado, podríamos suponer que una molécula tan
†
complicada como el gen no podría copiarse directamente. En cambio, la replicación
La bifurcación de replicación, 269
implicaría la formación de una molécula de forma complementaria y esto, a su vez,
†
serviría como plantilla para hacer una réplica de la molécula original. Por lo tanto, en
La especialización del ADN
los días previos al conocimiento detallado de la estructura de las proteínas o los
Polimerasas, 277
ácidos nucleicos, algunos genetistas se preguntaban si el ADN servía como plantilla
†
para una proteína específica que, a su vez, servía como plantilla para una molécula Síntesis de ADN en la replicación.
de ADN correspondiente. Tenedor, 283
Pero tan pronto como se conoció la naturaleza autocomplementaria del ADN, se †
descartó la idea de que las plantillas proteicas pudieran desempeñar un papel en la Iniciación de la replicación del ADN, 288
replicación del ADN. Era inmensamente más sencillo postular que cada una de las †
dos hebras de cada molécula de ADN parental servía como plantilla para la formación Vinculación y desenrollado: selección de
de una hebra hija complementaria. Aunque desde el principio esta hipótesis parecía origen y activación por parte del iniciador
demasiado buena para no ser cierta, era necesario generar apoyo experimental. Proteína, 293
Afortunadamente, cinco años después del descubrimiento de la doble hélice, †
surgieron pruebas decisivas de la separación de las hebras complementarias durante Finalizando la replicación, 302
la replicación del ADN (véase el análisis del experimento de Meselson y Stahl en el †
capítulo 2), y los estudios enzimológicos demostraron que el ADN por sí solo es el Visite el contenido web para obtener tutoriales
molde. para la síntesis de nuevas cadenas de ADN. estructurales y animaciones interactivas
Con estos resultados, el problema de cómo se replican los genes quedó resuelto en
cierto sentido. Pero en otro sentido, el estudio de la replicación del ADN apenas había
comenzado. ¿Cómo comienza la replicación del ADN? ¿Cómo se separan las cadenas de
ADN entrelazadas para que puedan actuar como plantilla? ¿Qué regula el grado de
replicación para que las células hijas no acumulen ni pierdan cromosomas? El estudio de
estas y otras cuestiones ha revelado que la replicación incluso de la molécula de ADN más
simple es un proceso complejo de varios pasos, en el que intervienen muchas más enzimas
de las que se anticipó inicialmente tras el descubrimiento de la primera enzima
polimerizadora de ADN. La replicación de los grandes cromosomas lineales de los
eucariotas es aún más desafiante. Estos cromosomas requieren
257
258 Capítulo 9
Hay muchos sitios de inicio de replicación para garantizar que todo el cromosoma se duplique de
manera oportuna, y el inicio de la replicación desde estos sitios debe coordinarse
cuidadosamente para garantizar que todas las secuencias se repliquen exactamente una vez.
Además, debido a que la replicación convencional del ADN no puede replicar completamente los
extremos de los cromosomas (llamados telómeros), las células han desarrollado un nuevo
método para mantener la integridad de esta parte del cromosoma.
En este capítulo, primero describimos la química básica de la síntesis de ADN y la
función de las enzimas que catalizan esta reacción. Luego analizamos cómo se
produce la síntesis de ADN en el contexto de un cromosoma intacto en estructuras
llamadas "horquillas de replicación". Luego nos centramos en el inicio de la
replicación del ADN. La replicación del ADN está estrictamente controlada en todas
las células y el paso de iniciación está altamente regulado. Describimos cómo las
proteínas de iniciación de la replicación desenrollan el dúplex de ADN en sitios
específicos del genoma llamados "orígenes de replicación" y cómo las proteínas de la
horquilla de replicación se reclutan en estos sitios y se ensamblan en el replisoma.
Finalmente, describimos cómo termina la replicación del ADN y los problemas
especiales de replicar los extremos de los cromosomas lineales. En conjunto, el
estudio de la replicación del ADN revela cómo múltiples proteínas se unen para
formar una compleja máquina multienzimática que realiza este proceso crítico con
asombrosa velocidad, precisión e integridad.
LA QUÍMICA DE LA SÍNTESIS DEL ADN
La síntesis de ADN requiere trifosfatos de

desoxinucleósidos y una unión cebador: plantilla
Para que se produzca la síntesis de ADN, deben estar presentes dos sustratos
clave (consulte la Animación interactiva 9-1). En primer lugar, una nueva síntesis
requiere los cuatro desoxinucleósidos trifosfato: dGTP, dCTP, dATP y dTTP (fig.
9-1a). Los nucleósidos trifosfatos tienen tres grupos fosforilo que están unidos a
través de los 50-hidroxilo del 20-desoxirribosa. El grupo fosforilo próximo a la
desoxirribosa se llamaa-fosfato, mientras que los grupos medio y distal se
denominanb-fosfato y elgramo-fosfato, respectivamente.
El segundo sustrato esencial para la síntesis de ADN es una disposición
particular de ADN monocatenario (ADNss) y ADN bicatenario (ADNds) llamado
cebador: unión de plantilla (Figura 9-1b). Como sugiere su nombre, la unión
cebador: plantilla tiene dos componentes clave. Elplantillaproporciona el ADN
que dirige la adición de cada desoxinucleótido complementario. Elcebadores
complementario a la plantilla, pero más corto que ésta. la cartilla
a b imprimación recocida
extremo creciente del ADN
oh oh oh base (A, G, C o T)
5' PAG OH 3'
i
tGRAMOCaliforniaGRAMOConnecticut hebra de plantilla
HO PAG oh PAGoh PAG OCH2oh
oh– oh– oh– C.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOt
3'HO PAG5'
# " ! OH
ADNbc ADNss
CIFRA9-1Sustratos necesarios para la síntesis de ADN. (a) La estructura general de los 20

-desoxinucleósidos trifosfatos. Las posiciones de losa-fosfato,b-fosfato ygramo-Los fosfatos están
etiquetados. (b) La estructura de una unión cebador:plantilla generalizada. La cadena del cebador más
corta está completamente hibridada con la cadena de ADN más larga y debe tener un 3 libre.0-OH
adyacente a una región de ADNss de la plantilla. La cadena de ADN más larga incluye una región
hibridada con el cebador y una región de ADN ss adyacente que actúa como plantilla para la síntesis de
ADN nuevo. Nueva síntesis de ADN extiende el 30final de la imprimación.
La replicación del ADN 259
debe tener un 3 expuesto0-OH adyacente a la región monocatenaria del molde. es

este 30-OH que se extenderá mediante la adición de nucleótidos.
Formalmente, sólo la porción del cebador de la unión cebador:plantilla es un
sustrato para la síntesis de ADN porque sólo el cebador se modifica químicamente
durante la síntesis de ADN. La plantilla proporciona sólo la información necesaria
para seleccionar qué nucleótidos se añaden. Sin embargo, tanto un cebador como
una plantilla son esenciales para toda síntesis de ADN.
El ADN se sintetiza extendiendo el30Fin de la cartilla

La química de la síntesis de ADN requiere que la nueva cadena crezca
extendiendo las 30extremo del cebador (Fig. 9-2). De hecho, esta es una
característica de la síntesis tanto de ARN como de ADN. El enlace fosfodiéster se
forma en un Snorte2 reacción en la que el grupo hidroxilo en el 30El extremo de la
cadena del cebador ataca ala-grupo fosforilo del nucleósido trifosfato entrante.
El grupo saliente de la reacción es el pirofosfato, que está compuesto por elb-
fosfato ygramo-fosfato del sustrato nucleotídico.
La cadena plantilla indica cuál de los cuatro nucleósidos trifosfato se agrega. El
nucleósido trifosfato que forma pares de bases con la cadena plantilla es muy
preferido para agregarlo a la cadena cebadora. Recuerde que las dos hebras de la
doble hélice tienen una orientación antiparalela. Esta disposición significa que la
cadena plantilla para la síntesis de ADN tiene la orientación opuesta a la de la cadena
de ADN en crecimiento.
PAG
PAG
PAG OH
catálisis
PAG PAG PAG PAG OH

cebador 5' 3' A
t t C emparejamiento de bases
GRAMO
A A GRAMO A A GRAMO
C t C t
plantilla3' 5'
HO PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG
pirofosfatasa
PAG
PAG 2PAG
PAG PAG PAG PAG PAG OH

5' 3'
t t C
GRAMO A
A A GRAMO A A GRAMO
C t C t
3' 5'
HO PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG PAG
CIFRA9-2Diagrama del mecanismo de síntesis de ADN.La síntesis de ADN se inicia cuando los 30
-OH del cebador media el ataque nucleofílico dela-fosfato del dNTP entrante. Esto da como
resultado la extensión de los 30final del cebador por un nucleótido y libera una molécula de
pirofosfato. La pirofosfatasa hidroliza rápidamente el pirofosfato liberado en dos moléculas de
fosfato.
260 Capítulo 9
La hidrólisis del pirofosfato es la fuerza impulsora de la síntesis de ADN
La adición de un nucleótido a una cadena polinucleotídica de longitud creciente.norteestá

indicado por la siguiente reacción:
¡XTP! (XMP)norte! (XMP)¡norte!1!PAG!PAG:
Pero la energía libre para esta reacción es bastante pequeña (D¡GRAMO!-3,5 kcal/
mol). Entonces, ¿cuál es la fuerza impulsora para la polimerización de nucleótidos en
ADN? La energía libre adicional se obtiene mediante la rápida hidrólisis del
pirofosfato en dos grupos fosfato mediante una enzima conocida como
pirofosfatasa:
PAG!PAG!2PAGi:
El resultado neto de la adición de nucleótidos.yLa hidrólisis del pirofosfato es la

ruptura de dos enlaces fosfato de alta energía. Por tanto, la síntesis de ADN es un
proceso acoplado, con una reacción global de
¡XTP! (XMP)norte! (XMP)¡norte!1! 2PAGi:
Esta es una reacción muy favorable con unaDGRAMOde –7 kcal/mol, que

corresponde a una constante de equilibrio (kecuación) de !105. tan altokecuaciónsignifica
que la reacción de síntesis de ADN es efectivamente irreversible.
EL MECANISMO DE LA ADN POLIMERASA
Las ADN polimerasas utilizan un único sitio activo para catalizar la síntesis de ADN
La síntesis de ADN es catalizada por una clase de enzimas llamadasADN polimerasas.

A diferencia de la mayoría de las enzimas, que tienen un sitio activo que cataliza una
reacción, la ADN polimerasa utiliza un único sitio activo para catalizar la adición de
cualquiera de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. La ADN polimerasa logra esta
flexibilidad catalítica explotando la geometría casi idéntica de los pares de bases A:T y
G:C (recuerde que las dimensiones de la hélice del ADN son en gran medida
independientes de la secuencia del ADN).
La ADN polimerasa monitorea la capacidad del nucleótido entrante para formar un par
de bases A:T o G:C, en lugar de detectar el nucleótido exacto que ingresa al sitio activo (fig.
9-3).Solocuando se forma un par de bases correcto son las 30-OH del cebador y dela-
fosfato del nucleósido trifosfato entrante en la posición óptima para que se produzca la
catálisis. El emparejamiento de bases incorrecto conduce a tasas dramáticamente más
bajas de adición de nucleótidos como resultado de un alineamiento catalíticamente
desfavorable de estos sustratos (ver Fig. 9-3b). Este es un ejemplo de corrección cinética,
en la que una enzima favorece la catálisis utilizando uno de varios sustratos posibles al
aumentar drásticamente la velocidad de formación de enlaces sólo cuando está presente
el sustrato correcto. De hecho, la velocidad de incorporación de un nucleótido incorrecto
es hasta 10.000 veces más lenta que cuando el emparejamiento de bases es correcto. En el
Cuadro 9-1, Los ensayos de incorporación se pueden utilizar para medir la síntesis de
ácidos nucleicos y proteínas se describe un método común para monitorear la síntesis de
ADN nuevo.
Las ADN polimerasas muestran una capacidad impresionante para distinguir
entre ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos trifosfato (rNTP y dNTP). Aunque los
rNTP están presentes en una concentración aproximadamente 10 veces mayor en la
célula, se incorporan a una velocidad que es más de 1000 veces menor que la de los
dNTP. Esta discriminación está mediada por la exclusión estérica de
apar de bases correcto bpar de bases incorrecto

CIFRA9-3Se requieren pares correctos para bases
la
oh oh adición de nucleótidos catalizada por ADN
plantilla polimerasa. (a) Diagrama esquemático del ataque
C oh PAGoh C oh PAGoh
oh oh de un cebador 30-OH termina en un dNTP con
oh oh
oh oh
pares de bases correctos. (b) Diagrama
esquemático de las consecuencias del
sin base
A A emparejamiento de bases incorrecto en la catálisis
GRAMO GRAMO par
por la ADN polimerasa. En el ejemplo mostrado, el
t A par de bases A:A incorrecto desplaza ela-fosfato

C C dNTP del nucleótido entrante. Esta alineación incorrecta
dNTP
reduce drásticamente la tasa de catálisis, lo que
oh oh OH
oh oh hace que la ADN polimerasa agregue
OH C OH OH
C preferentemente dNTP con pares de bases
cebador oh
PAG oh oh correctos. (Adaptado, con autorización, de
!oh PAG oh Brautigam CA y Steitz TA 1998. actual. Opinión.
oh ! oh Estructura. Biol.8:54-63, figura 4d.
PAG oh
# Elsevier.)
" oh PAG
"oh oh
PAG oh
# oh PAG oh
oh #
oh
}TÉCNICAS
BBUEY9-1Los ensayos de incorporación se pueden utilizar para medir el ácido nucleico y la síntesis de proteínas
¿Cómo se puede medir la actividad de una ADN polimerasa? El ensayo átomos radiactivos en una parte del nucleótido que será retenido
más simple utilizado para medir la síntesis de un polímero es un ensayo en el producto final del ADN (por ejemplo, reemplazando el átomo
de incorporación. En el caso de la ADN polimerasa, este tipo de ensayo de fósforo en ela-fosfato con el isótopo radiactivo32P) (Cuadro 9-1
mide la incorporación de precursores de dNTP marcados en las Fig. 1a). Alternativamente, los nucleótidos se pueden sintetizar con
moléculas de ADN. Normalmente, los dNTP se etiquetan incluyendo moléculas fluorescentes en lugar del grupo metilo en
a NUEVA HAMPSHIRE2
norte
norte
oh oh oh
norte
32 norte
HO PAG oh PAG oh PAG OCH2oh
oh– oh– oh–

oh oh OH
OH
COOH
b oh oh
h
norte
4
hn 3 5 norte
h
oh oh oh
2
1
6 oh fluoresceína
oh norte
HO PAG oh PAG oh PAG OCH2oh
oh– oh– oh–
OH
CAJA9-1CIFRA1Dos formas de desoxinucleósidos trifosfatos marcados. (a) [a-32P]dATP. En este nucleótido, ela-El fósforo se reemplaza con el isótopo
radiactivo.32P. Tenga en cuenta que sólo este átomo de fósforo pasará a formar parte del ADN tras la incorporación de nucleótidos. (b) Análogo de
trifosfato de timidina marcado fluorescentemente. En este precursor marcado, el compuesto fluorescente fluoresceína se ha unido mediante un
conector a la posición 5 del anillo de timina que normalmente está unido a un grupo metilo.
262 Capítulo 9
BBUEY9-1 (Continuado)
dTTP (Cuadro 9-1 Fig. 1b). Este grupo metilo no participa en el apareamiento dNTP etiquetado
de bases y las ADN polimerasas pueden acomodar fácilmente restos mucho

más grandes en esta ubicación. En cualquier caso, estas modificaciones
permiten un fácil seguimiento del nucleótido marcado mediante película o
fotomultiplicadores sensibles para detectar electrones o fotones emitidos.
Un ensayo de incorporación requiere dos pasos (Cuadro 9-1, Fig. 2).

ADN polimerasa
Primero, el precursor se incorpora a los polímeros. En el caso de la ADN
polimerasa, esto se logra incubando la polimerasa con una unión
cebador:plantilla y los precursores de dNTP marcados durante un
período de tiempo apropiado. En la mayoría de los casos, sólo uno de
los cuatro dNTP está marcado porque esto generalmente proporciona
niveles fácilmente detectables de nucleótidos incorporados. En segundo
lugar, los polímeros resultantes deben separarse de los precursores no
incorporados. En el caso del ADN, esto se puede lograr de dos maneras.
La reacción de la ADN polimerasa puede pasar a través de un filtro
reacción de filtración a través de una
cargado positivamente en presencia de concentraciones de sal que
membrana cargada positivamente
permitan la unión de la cadena principal del ADN con carga altamente
negativa, pero no de los nucleótidos individuales menos cargados.
Alternativamente, se puede utilizar electroforesis en gel para separar los
productos de ADN por tamaño, porque los nucleótidos no incorporados
Barras de ADN para filtrar.
migrarán mucho más rápido que el producto de ADN. En cualquier caso,
la cantidad de producto de ADN sintetizado se puede medir
determinando la cantidad de nucleótido marcado incorporado al
polímero de ADN. flujo de nucleótidos
a través de
Hemos descrito un ensayo de incorporación en el contexto de una
reacción de ADN polimerasa; sin embargo, se utilizan enfoques
Mida la etiqueta asociada con el filtro
comparables para medir las actividades de las enzimas que dirigen la
para determinar la cantidad de
síntesis de ARN o proteínas. Por ejemplo, los aminoácidos marcados se nueva síntesis de ADN.
pueden utilizar de manera similar para analizar su incorporación a las
proteínas. 3000
Etiqueta asociada al filtro (cpm)
2000
1000
CAJA 9-1CIFRA2 Ensayo de incorporación para medir el ADN. 0

síntesis.En el ejemplo mostrado, la unión por filtro se utiliza para separar los 1 2 3 4
nucleótidos marcados no incorporados de los incorporados en el ADN. Tiempo (minutos)
rNTP del sitio activo de la ADN polimerasa (Fig. 9-4). En la ADN polimerasa, la bolsa de
unión de nucleótidos no puede acomodar un 20-OH en el nucleótido entrante. Este espacio
está ocupado por dos aminoácidos que hacen contactos de van der Waals con el anillo de
azúcar. Cambiar estos aminoácidos por otros aminoácidos con cadenas laterales más
pequeñas (p. ej., cambiando un glutamato por una alanina) da como resultado una ADN
polimerasa con una discriminación significativamente reducida entre dNTP y rNTP. Los
nucleótidos que cumplen algunos, pero no todos, los requisitos para su uso por la ADN
polimerasa pueden inhibir la síntesis de ADN al detener la elongación. Estos nucleótidos
representan una clase importante de fármacos utilizados para tratar el cáncer y las
infecciones virales (consulte el Cuadro 9-2, Agentes anticancerígenos y antivirales que se
dirigen a la replicación del ADN).
a b
oh oh CIFRA9-4Ilustración esquemática de las
plantilla restricciones estéricas que impiden que la ADN

C oh PAG oh C oh PAG oh
oh oh polimerasa utilice precursores de rNTP. (a)
oh oh
oh oh Unión de un dNTP con pares de bases
correctos a la ADN polimerasa. En estas
A A condiciones, los 30-OH del cebador y dela- El
A A
fosfato del dNTP está muy cerca. (b) Adición de
discriminado
un 20-OH produce un choque estérico con los
aminoácidos
t Ud. aminoácidos (los aminoácidos discriminadores)
t t en la bolsa de unión de nucleótidos. Esto
OH
dNTPoh resulta en laa-fosfato del dNTP siendo
oh oh oh
OH 3' C OH OH 3'
C OH
desplazado. En este estado, el a-El fosfato está
C C
oh rNTP incorrectamente alineado con los 3.0-OH del
cebador
oh
! PAG oh cebador, reduciendo drásticamente la
! PAG oh velocidad de catálisis.
oh
oh oh oh
PAG
PAG
oh oh oh
PAG
oh oh
ADN polimerasa
Las ADN polimerasas se asemejan a una mano que agarra el

cebador: unión de plantilla
Una comprensión molecular de cómo la ADN polimerasa cataliza la síntesis de ADN

ha surgido a partir de estudios de la estructura atómica de varias ADN polimerasas
unidas a uniones cebador:plantilla (consulte el Tutorial estructural 9-1). Estas
estructuras revelan que el sustrato de ADN se encuentra en una gran hendidura que
se asemeja a una mano derecha parcialmente cerrada (fig. 9-5). Según la analogía de
la mano, los tres dominios de la polimerasa se denominan pulgar, dedos y palma.
El dominio de la palma se compone de unabHoja y contiene los elementos

primarios del sitio catalítico. En particular, esta región de la ADN polimerasa une
dos iones metálicos divalentes (típicamente Mg2!orZn2!) que alteran el entorno
químico alrededor del dNTP con el par de bases correcto y el 30-OH del cebador
(Fig.9-6). Un ión metálico reduce la afinidad del 30-OH para su hidrógeno. Esto
genera a30oh2que está preparado para el ataque nucleofílico dela-fosfato del
NTP entrante. El segundo ión metálico coordina las cargas negativas delb-
fosfato ygramo-fosfato del dNTP y estabiliza el pirofosfato producido al unir el
cebador y el nucleótido entrante.
Además de su papel en la catálisis, el dominio de la palma también monitorea el
emparejamiento de bases de los nucleótidos agregados más recientemente. Esta región de
la polimerasa establece extensos contactos de enlaces de hidrógeno con pares de bases en
el surco menor del ADN recién sintetizado. Estos contactos no son específicos de una base
(v. fig. 4-10), sino que sólo se forman si los nucleótidos añadidos recientemente
(cualesquiera que sean) tienen pares de bases correctos. El ADN no coincidente en esta
región interfiere con estos contactos de surcos menores y ralentiza drásticamente la
catálisis. La combinación de catálisis lenta y afinidad reducida por el ADN no coincidente
recién sintetizado permite la liberación de la cadena del cebador del sitio activo de la
polimerasa y, en muchos casos, esta cadena se une y actúa sobre ella mediante una
nucleasa correctora que elimina el ADN no coincidente. como se verá más adelante).
¿Cuáles son las funciones de los dedos y el pulgar? Los dedos también son
importantes para la catálisis. Varios residuos ubicados dentro de los dedos se unen a
264 Capítulo 9
a b
dedos pulgar
palmera
plantilla
cebador
CIFRA9-5La estructura 3D de la ADN polimerasa se asemeja a una mano derecha. (a) Esquema de la ADN
polimerasa unida a una unión cebador:plantilla. Se anotan los dedos, el pulgar y la palma. El ADN recién
sintetizado está asociado a la palma de la mano y el sitio de catálisis del ADN se encuentra en la
hendidura entre los dedos y el pulgar. La región monocatenaria de la hebra plantilla está fuertemente
curvada y no pasa entre el pulgar y los dedos. (b) Una vista similar de la ADN polimerasa T7 unida al ADN.
El ADN se muestra ocupando espacios y la proteína se muestra como un diagrama de cinta. Los dedos y
el pulgar están compuestos porahélices. El dominio de la palma está oscurecido por el ADN. El dNTP
entrante se muestra en rojo (para la base y la desoxirribosa) y en amarillo (para el resto trifosfato). La
cadena plantilla del ADN se muestra en gris oscuro y la cadena del cebador se muestra en gris claro.
(Adaptado de Doublié S. et al. 1998.Naturaleza391: 251–258. Imagen preparada con MolScript, BobScript
y Raster3D).
el dNTP entrante. Más importante aún, una vez que se forma un par de bases
correcto entre el dNTP entrante y la plantilla, el dominio del dedo se mueve para
encerrar el dNTP (Fig. 9-7). Esta forma cerrada de la “mano” de la polimerasa
estimula la catálisis al poner el nucleótido entrante en estrecho contacto con los
iones metálicos catalíticos.
El dominio del dedo también se asocia con la región de la plantilla, lo que lleva a
un 908giro de la columna vertebral de fosfodiéster entre la primera y la segunda
base de la plantilla. Esta curvatura sirve para exponer sólo la primera base plantilla
después del cebador en el sitio catalítico y evita cualquier confusión sobre qué base
plantilla debe emparejarse con el siguiente nucleótido que se agregará (fig. 9-8).
A diferencia de los dedos y la palma, el dominio del pulgar no está
íntimamente involucrado en la catálisis. En cambio, el pulgar interactúa con el
ADN que se ha sintetizado más recientemente (v. fig. 9-5). Esto tiene dos
propósitos. En primer lugar, mantiene la posición correcta del cebador y del sitio
activo. En segundo lugar, el pulgar ayuda a mantener una fuerte asociación
entre la ADN polimerasa y su sustrato. Esta asociación contribuye a la capacidad
de la ADN polimerasa de agregar muchos dNTP cada vez que se une a una
unión cebador:plantilla (como se analiza más adelante).
En resumen, se produce una serie ordenada de eventos cada vez que la ADN
polimerasa agrega un nucleótido a la cadena de ADN en crecimiento. La base de
nucleótido entrante se empareja con la siguiente base plantilla disponible. Esta interacción
hace que los dedos de la polimerasa se cierren alrededor del dNTP de pares de bases. Esta
conformación de la enzima coloca a los iones metálicos catalíticos críticos en una posición
para catalizar la formación del siguiente enlace fosfodiéster. La unión del nucleótido de
pares de bases al cebador conduce a la reapertura de los dedos y al movimiento de la
unión cebador:plantilla por un par de bases. El
a oh
b
oh
C oh PAG oh
C oh PAG oh
oh
oh oh
oh
C
t
t
GRAMO
A
A
oh
oh –
oh
oh PAG oh C
C h
oh
ion metálico A ++
oh
Áspid ++
ion metálico B
Áspid
CIFRA9-6Dos iones metálicos unidos a la ADN polimerasa catalizan la adición de nucleótidos. (a) Ilustración del
sitio activo de una ADN polimerasa. Los dos iones metálicos (que se muestran en verde) se mantienen en su lugar
mediante interacciones con dos residuos de aspartato altamente conservados. El ion metálico A interactúa
principalmente con los 30-OH, lo que resulta en una asociación reducida entre el O y el H. Esto deja un nucleófilo 3
0oh2El ion metálico B interactúa con los trifosfatos del NTP entrante para neutralizar su carga negativa. Después
de la catálisis, el producto pirofosfato se estabiliza mediante interacciones similares con el ion metálico B (no
mostrado). (b) Estructura 3D de los iones metálicos del sitio activo asociados con la ADN polimerasa T7, los 30-OH
extremo del cebador y el nucleótido entrante. Los iones metálicos se muestran en verde y los elementos
restantes se muestran en los mismos colores que los de la figura 9-5b. La vista de la polimerasa que se muestra
aquí es aproximadamente equivalente a rotar la imagen que se muestra en la Figura 9-5b !1808alrededor del eje
de la hélice del ADN. (Adaptado de Doublié S. et al. 1998. Naturaleza391:251–258. Imagen preparada con
MolScript, BobScript y Raster3D).
La polimerasa entonces está lista para el siguiente ciclo de adición. Es importante destacar que
cada uno de estos eventos se estimula fuertemente mediante el emparejamiento de bases
correcto entre el dNTP entrante y la plantilla.
Las ADN polimerasas son enzimas procesivas
La catálisis por la ADNpolimerasa es rápida. Las ADN polimerasas son capaces de

agregar hasta 1000 nucleótidos/s a una cadena de cebador. La velocidad de la
síntesis de ADN se debe en gran medida a la naturaleza procesiva de la ADN
polimerasa. ProcesividadEs una característica de las enzimas que operan sobre
sustratos poliméricos. En el caso de las ADN polimerasas, lagrado de procesividadse
define como elnúmero promedio de nucleótidos agregados cada vez que la enzima
se une a una unión cebador:plantilla.Cada ADN polimerasa tiene una procesividad
característica que puede variar desde sólo unos pocos nucleótidos hasta más de 50
000 bases agregadas por evento de unión (fig. 9-9).
La tasa de síntesis de ADN aumenta drásticamente al agregar múltiples
nucleótidos por evento de unión. Es la unión inicial de la polimerasa a la unión
cebador:plantilla la que limita la velocidad de la síntesis de ADN. En una reacción
típica de la ADN polimerasa, la ADN polimerasa tarda !1 segundo en localizar y
unir una unión cebador:plantilla. Una vez unido, adición de un nucleótido.
266 Capítulo 9
a b
CIFRA9-7La ADN polimerasa “agarra” la
O-hélice de O-hélice
plantilla y el nucleótido entrante cuando se
ADN polimerasa (cerrado)
forma un par de bases correcto. (abierto) ARGO
(a) Una ilustración de los cambios en la estructura 40º
de la ADN polimerasa después de que los pares de
lis
PAG
bases de nucleótidos entrantes se emparejan
tiro entrante PAG
correctamente con el ADN plantilla. El cambio dNTP PAG ARGO
principal es un 408rotación de una de las hélices lis
en el dominio de los dedos llamada hélice O. En la GRAMO tiro PAG
PAG
conformación abierta, esta hélice está distante del ++ ion B ++
nucleótido entrante. Cuando la polimerasa está en PAG
5' ++ ion A 5' ++
conformación cerrada, esta hélice se mueve y C C GRAMO
realiza varias interacciones importantes con el

3'-OH 3'-OH
dNTP entrante. Una tirosina realiza interacciones
de apilamiento con la base del dNTP y dos
residuos cargados se asocian con el trifosfato. La
combinación de estas interacciones posiciona al rotación de la hélice O
dNTP para la catálisis mediada por los dos iones
metálicos unidos a la ADN polimerasa. (Basado en
Doublié S. et al. 1998.Naturaleza391:251–258, Fig.
5. # 1998.) (b) La estructura de la ADN polimerasa
T7 unida a sus sustratos en la conformación
cerrada. (Púrpura) La hélice O; el resto de la
estructura de la proteína se muestra transparente 5'
5' 3' 3'
para mayor claridad. (Rosa) Las sustancias críticas cebador plantilla
tirosina, lisina y arginina se pueden ver detrás de
la hélice O. (Rojo) La base y la desoxirribosa del
C
dNTP entrante; (gris claro) la imprimación; (gris
oscuro) hebra de plantilla; (verde) los dos iones
metálicos catalíticos; (amarillos) fosfatos.
(Adaptado de Doublié S. et al. 1998.Naturaleza391:
251–258. Imagen preparada con MolScript,
BobScript y Raster3D).
es muy rápido (en el rango de milisegundos). Por lo tanto, una ADN polimerasa
completamente no procesiva agregaría !1 pb/seg. Por el contrario, las ADN
polimerasas más rápidas añaden hasta 1000 nucleótidos/segundo al permanecer
asociadas con la plantilla durante miles de rondas de adición de dNTP. En
consecuencia, una polimerasa altamente procesiva aumenta la tasa general de
síntesis de ADN hasta 1000 veces en comparación con una enzima no procesiva.
CIFRA9-8Ilustración del camino del ADN molde a

dedos pulgar
través de la ADNpolimerasa.El ADN recientemente
replicado está asociado con la región palmar de la
ADN polimerasa. En el sitio activo, la primera base nucleótido entrante
de la región monocatenaria del molde está en una
posición esperada para el ADNbc. Mientras uno
plantilla
sigue la hebra de la plantilla hacia sus 50Al final, la APP
columna vertebral de fosfodiéster se dobla 3'-OH 3'
abruptamente 908.Esto da como resultado que la
segunda y todas las bases monocatenarias
5'
posteriores se coloquen en una posición que
impide cualquier posibilidad de emparejamiento 5' cebador
doblarse plantilla
de bases con un dNTP unido al sitio activo. plantilla base
3'-HO 5'
CIFRA9-9Las ADN polimerasas dimensionan
sin-
5' OH-3' el ADN de manera procesiva.Esta
ilustración muestra la diferencia entre una
ADN polimerasa procesiva y no procesiva.
La ADN polimerasa se une Ambas ADN polimerasas se unen a la unión
(lento) cebador:plantilla. Al unirse, la enzima no
“putativo” no procesivo ADN procesivo procesiva agrega un solo dNTP a los 30final
ADN polimerasa polimerasa del cebador y luego se libera de la nueva
5' 5'
unión cebador: plantilla. Por el contrario,
3' 3' una ADN polimerasa procesiva agrega
5'
muchos dNTP cada vez que se une a la
5'
plantilla.
síntesis de ADN
(rápido)
5'
5'
3' 3'
5' 5'
un dNTP Se agregaron muchos dNTP

agregado
Liberaciones de ADN polimerasa
3' 5' 3' 5'
5' 3' 5' OH-3'
La procesividad se facilita mediante el deslizamiento de las ADN polimerasas a lo

a
largo de la plantilla de ADN. Una vez unida a una unión cebador:plantilla, la ADN h
polimerasa interactúa estrechamente con gran parte de la porción bicatenaria del h oh norte
norte
ADN de una manera no específica de secuencia. Estas interacciones incluyen norte
C h norte GRAMO
interacciones electrostáticas entre la columna vertebral de fosfato y el dominio del norte
norte
azúcar
pulgar e interacciones entre el surco menor del ADN y el dominio de la palma

norte
oh h norte
(descritas anteriormente). La naturaleza independiente de la secuencia de estas azúcar

h
interacciones permite el fácil movimiento del ADN incluso después de que se une a la
citosina ceto-guanina
polimerasa. Cada vez que se añade un nucleótido a la cadena del cebador, el ADN se
libera parcialmente de la polimerasa. (Los enlaces de hidrógeno con el surco menor
se rompen, pero las interacciones electrostáticas con el pulgar se mantienen). Luego, b
CH3 oh h oh norte
el ADN se vuelve a unir rápidamente a la polimerasa en una posición que se desplaza

1 pb utilizando el mismo mecanismo no específico de secuencia. Se logran mayores t norte
h norte GRAMO
norte
aumentos en la procesividad mediante interacciones entre la ADN polimerasa y las norte

norte
azúcar
proteínas accesorias, que discutiremos más adelante. oh h norte
azúcar
h
timidina enol-guanina
Las exonucleasas corrigen el ADN recién sintetizado
CIFRA9-10 El cambio tautomérico de
Un sistema basado únicamente en la geometría de pares de bases y la complementariedad La guanina produce un emparejamiento incorrecto con
entre las bases no puede alcanzar los niveles extraordinariamente altos de precisión que la timidina. (a) Emparejamiento de bases entre la forma
se observan para la síntesis de ADN en la célula (aproximadamente un error de cada 10).10 ceto normal de guanina con citosina. (b) En el raro caso
de que la guanina asuma el tautómero enol, ahora se
pb añadido). Un límite importante para la precisión de la ADN polimerasa es la ocasional
empareja con timidina en lugar de citosina. Aunque
(aproximadamente una de cada 105veces) parpadeo de las bases en la forma tautomérica
hemos ilustrado el emparejamiento incorrecto del
“incorrecta” (imino o enol) (ver Capítulo 4, Fig. 4-5). Estas formas alternativas de las bases
tautómero alternativo de guanina, cada una de las
permiten que los pares de bases incorrectos se coloquen correctamente para la catálisis bases puede formar tautómeros alternativos que
(fig. 9-10). Cuando el nucleótido vuelve a su estado “correcto”, el nucleótido incorporado no cambian su especificidad de emparejamiento de bases.
coincide con el molde y debe eliminarse.
268 Capítulo 9
}CONEXIONES MÉDICAS
BBUEY9-2Agentes anticancerígenos y antivirales se dirigen a la replicación del ADN
El papel central de la replicación del ADN durante la división celular lo convierte en un dCTP y el azúcar arabinosa de AraCTP provocan un posicionamiento
objetivo común para los fármacos quimioterapéuticos cuyo objetivo es prevenir el incorrecto de los 30-hidroxilo del ADN cebador y terminación de la elongación.
crecimiento de tumores. Estos medicamentos apuntan a la replicación del ADN en Al igual que el 6-MP, AraC se utiliza principalmente en el tratamiento de la
varias etapas. leucemia aguda.
Varios reactivos quimioterapéuticos comunes apuntan a la Una tercera clase de quimioterapias daña el ADN para bloquear su replicación. El
biosíntesis de los precursores de nucleótidos del ADN, privando así a la cisplatino y la biscloroetil initrosourea (BCNU) provocan enlaces cruzados dentro y
ADN polimerasa de nuevos componentes básicos. Por ejemplo, los entre cadenas del ADN cuando los residuos G son adyacentes entre sí (Cuadro 9-2,
fármacos 5-fluorouracilo (5-FU) y 6-mercaptopurina (6-MP) son análogos figura 1d, e). Estos enlaces cruzados (particularmente la variedad entre cadenas)
de precursores de nucleótidos que inhiben la síntesis de nucleótidos de interfieren con el alargamiento del ADN. El cisplatino es un fármaco importante que
pirimidina y purina, respectivamente (Cuadro 9-2, Fig. 1a,b). El 5-FU es el se utiliza para tratar el cáncer testicular metastásico y el BCNU se utiliza para tratar
principal agente utilizado en el tratamiento del cáncer colorrectal y tumores cerebrales y leucemias. De manera similar, la camptotecina y el etopósido
también se utiliza en el tratamiento del cáncer de estómago, páncreas y son inhibidores de las topoisomerasas que bloquean la capacidad de estas proteínas
de mama avanzado. El 6-MP se utiliza principalmente para tratar para volver a formar enlaces fosfodiéster después de escindir la columna vertebral
pacientes con leucemia aguda (cáncer de células sanguíneas). del ADN (v. capítulo 4, figura 4-24). El tratamiento con cualquiera de estos inhibidores
Otros fármacos contra el cáncer apuntan más directamente a la síntesis deja una rotura en el ADN que finaliza la replicación del ADN cuando la ADN
de ADN. El arabinósido de citosina (AraC) es un análogo de la desoxicitidina polimerasa intenta utilizarlo como plantilla.
que, después de su conversión en un nucleósido trifosfato, se incorpora al

ADN en lugar de dCTP (Cuadro 9-2, figura 1c). Una vez incorporado al ADN, la Como clase, estos medicamentos se dirigen a células que replican su ADN y, por
diferencia entre el azúcar desoxirribosa de lo tanto, se dividen con frecuencia. Aunque la naturaleza de rápida división de las
células cancerosas las hace particularmente susceptibles a tales medicamentos, otras
células del cuerpo también se ven afectadas. No es sorprendente que estos
a b C
NUEVA HAMPSHIRE2
oh SH inhibidores de la replicación del ADN también sean tóxicos para las células huésped
norte
F en rápido crecimiento, como los glóbulos rojos y blancos, las células ciliadas y las
hn 6 norte
5 norte
oh células de la mucosa gastrointestinal. La inhibición del crecimiento de estas células
HO
norte
1
h OH
1 oh conduce a los efectos secundarios ahora familiares de muchas quimioterapias,
oh norte
h
norte norte
h incluida la inmunosupresión (debido a la pérdida de glóbulos blancos), anemia

h h
OH (debido a la pérdida de glóbulos rojos), diarrea (debido a defectos gastrointestinales)
y pérdida de cabello. pérdida.
d mi oh
Los inhibidores de la replicación también se han utilizado como agentes
h3norte
CL CL (CH2)2 norte C (CH2)2
NUEVA HAMPSHIRE CL antivirales. El primer fármaco que resultó eficaz contra la infección por VIH fue
punto
NO la azidotimidina (AZT), un análogo de la atimidina que inhibe la ADN

h3norte CL
polimerasa especializada (llamada transcriptasa inversa) (ver Capítulo 12) que
copia el genoma de ARN del VIH en ADN después de la infección. Más
recientemente, un análogo del nucleósido de guanina llamado aciclovir ha
F oh gramo
oh reemplazado al AZT como el inhibidor preferido de la ADN polimerasa del VIH.
NUEVA HAMPSHIRE
norte En este análogo, la ribosa de un nucleósido normal se reemplaza con una
NUEVA HAMPSHIRE
HO estructura de cadena abierta que se asemeja a la parte de la ribosa más

oh CH2
HO oh
norte
cercana a la base (Cuadro 9-2, figura 1f, g). Sin embargo, este análogo se
norte
oh
norte NUEVA HAMPSHIRE2
HC CH2 puede modificar a una forma de trifosfato que puede ser incorporado por la
norte– norte+ norte
h ADN polimerasa viral al ADN. Una vez incorporados, estos análogos actúan
como cadena. terminadores debido a su falta de grupo aribosa y por lo tanto
CAJA9-2CIFRA1 Estructuras de quimioterapia común. los 30-OHrequerido para una mayor adición de nucleótidos. Es importante
reactivos péuticos que apuntan a la replicación del ADN. (a) 5- destacar que estos fármacos son poco reconocidos por las ADN polimerasas
fluorouracilo, (b) 6-mercaptopurina, (c) arabinósido de citosina, (d) celulares y, por tanto, tienen menos efectos secundarios que los análogos de
cisplatino, (e) biscloroetilnitrosourea, (f) azidotimidina y (g) aciclovir. nucleótidos quimioterapéuticos.
La eliminación de estos nucleótidos con pares de bases incorrectos está mediada por
un tipo de nucleasa que se identificó originalmente en el mismo polipéptido que la ADN
polimerasa. Denominadocorrección de exonucleasa,estas enzimas degradan el ADN a
partir de un 30Extremo del ADN (es decir, desde el extremo en crecimiento de la nueva
cadena de ADN). (Nucleasas que sólo pueden degradarse a partir de un ADN
final se llamanexonucleasas;Las nucleasas que pueden cortar dentro de una cadena de ADN se asíntesis de ADN lenta o nula
llamanendonucleasas.)
Inicialmente, la presencia de un 30la exonucleasa como parte del mismo
mal emparejado
última base pulgar

polipéptido que la ADN polimerasa tenía poco sentido. ¿Por qué la ADN polimerasa par
necesitaría degradar el ADN que acababa de sintetizar? El papel de estas
exonucleasas quedó claro cuando se determinó que tienen una fuerte preferencia 3'-OH
por degradar el ADN que contiene pares de bases no coincidentes. Por lo tanto, en el
palmera
5'
raro caso de que se agregue un nucleótido incorrecto a la cadena del cebador, la 5'
dedos
exonucleasa elimina este nucleótido de la 30extremo de la cadena del cebador. Esta
3'
"corrección" del ADN recién agregado le da a la ADN polimerasa una segunda
oportunidad de agregar el nucleótido correcto. exonucleasa
La eliminación de nucleótidos no coincidentes se ve facilitada por la capacidad sitio activo
reducida de la ADN polimerasa para agregar un nucleótido adyacente a un cebador b eliminación de nucleótidos no coincidentes
con pares de bases incorrectos. El ADN mal emparejado altera la geometría entre los
30-OH y el nucleótido entrante debido a interacciones deficientes con la región de la
palma. Esta geometría alterada reduce la tasa de adición de nucleótidos de la misma
manera que la adición de un dNTP emparejado incorrectamente reduce la catálisis.
Por lo tanto, cuando se agrega un nucleótido no coincidente, disminuye la tasa de
adición de nuevos nucleótidos y aumenta la tasa de corrección de la actividad de la 5'
exonucleasa. 5'
En cuanto a la síntesis procesiva de ADN, la corrección se produce sin liberar
3'
el ADN de la polimerasa (fig. 9-11). Cuando hay un par de bases no coincidentes 3'-OH
en el sitio activo de la polimerasa, la unión cebador:plantilla se desestabiliza, exonucleasa
creando varios pares de bases de ADN no apareados. El sitio activo de la ADN
polimerasa se une mal a una plantilla que no coincide, pero el sitio activo de la Creanudar la síntesis de ADN
exonucleasa tiene una afinidad 10 veces mayor por 3 monocatenarios.0
termina. Por lo tanto, los 3 recién desemparejados0El extremo se mueve desde el sitio
activo de la polimerasa al sitio activo de la exonucleasa. La exonucleasa elimina el
nucleótido incorrecto (también se puede eliminar un nucleótido adicional). La eliminación
3'-
de la base no coincidente permite que la unión cebador:plantilla se vuelva a formar y se OH
vuelva a unir al sitio activo de la polimerasa, lo que permite que continúe la síntesis de 5'
ADN. 5'
En esencia, las exonucleasas de corrección funcionan como una “tecla de eliminación”,
3'
eliminando sólo los errores más recientes. La adición de una exonucleasa correctora
aumenta en gran medida la precisión de la síntesis de ADN. En promedio, la ADN
polimerasa inserta un nucleótido incorrecto por cada 105nucleótidos añadidos. Las
CIFRA9-11La corrección de exonucleasas elimina
exonucleasas correctoras disminuyen la aparición de pares de bases incorrectos a 1 de
bases del 30ADN endof no coincidente. (a) Cuando
cada 107nucleótidos añadidos. Esta tasa de error todavía es significativamente inferior a la
se incorpora un nucleótido incorrecto al ADN, la
tasa real de mutación observada en una célula típica (aproximadamente un error de cada
velocidad de síntesis del ADN se reduce debido a la
1010nucleótidos añadidos). Este nivel adicional de precisión lo proporciona el proceso de posición incorrecta de los 30-OH. (b) En presencia
reparación de discrepancias posteriores a la replicación descrito en el Capítulo 10. de un 3 no coincidente0Al final, los últimos 3 a 4
nucleótidos del cebador se vuelven
monocatenarios, lo que produce una mayor
afinidad por el sitio activo de la exonucleasa. Una
vez unido a este sitio activo, el nucleótido no
coincidente (y frecuentemente un nucleótido
LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN
adicional) se elimina del cebador. (c) Una vez que
se elimina el nucleótido no coincidente, se vuelve a
Ambas hebras de ADN se sintetizan juntas en la bifurcación de replicación formar una unión cebador:plantilla con pares de
bases adecuados y se reanuda la polimerización (el
Hasta ahora, hemos analizado la síntesis de ADN en un contexto relativamente ADN recién sintetizado se muestra en rojo).
(Adaptado, con autorización, de Baker TA y Bell SP
artificial, es decir, en una unión cebador:plantilla que produce sólo una nueva hebra
1998.Celúla92: 295–305, figura 1b. #Elsevier.)
de ADN. En la célula, ambas cadenas del ADNdúplex se replican al mismo tiempo
(consulte la Animación interactiva 9-2). Esto requiere la separación de las dos hebras
de la doble hélice para crear dos ADN molde. La unión entre las cadenas molde
recién separadas y el ADN dúplex no replicado se conoce comobifurcación de
replicación (Figura 9-12). La bifurcación de replicación se mueve
270 Capítulo 9
dirección de la hebra principal

movimiento de polimerasa
filamento principal
dirección general de
replicación del ADN
3'
5'
cebadores de ARN 5'
ADN polimerasa 3'

Fragmentos de Okazaki
5'
5'
3'
hebra rezagada
dirección del cordón retrasado
movimiento de polimerasa
ADN replicado ADN no replicado
CIFRA9-12Horquilla de replicación. (Rojo) ADN recién sintetizado; (verde) cebadores de ARN. Los fragmentos de
Okazaki que se muestran son artificialmente cortos con fines ilustrativos. En la célula, los fragmentos de Okazaki
pueden variar entre 100 y 2000 bases según el organismo.
continuamente hacia la región dúplex del ADN no replicado, dejando a su paso dos
plantillas de ADN ss, cada una de las cuales dirige la síntesis de una cadena de ADN
complementaria.
La naturaleza antiparalela del ADN crea una complicación para la replicación simultánea
de las dos plantillas expuestas en la bifurcación de replicación. Debido a que el ADN se
sintetiza sólo alargando un 30Al final, solo una de las dos plantillas expuestas se puede
replicar continuamente a medida que se mueve la bifurcación de replicación. En esta
cadena plantilla, la polimerasa simplemente “persigue” la horquilla de replicación en
movimiento. La cadena de ADN recién sintetizada dirigida por esta plantilla se conoce
comofilamento principal.
La síntesis de la nueva cadena de ADN dirigida por el otro molde de ADN ss es
más complicada. Esta plantilla dirige la ADN polimerasa para que se mueva en la
dirección opuesta a la bifurcación de replicación. La nueva cadena de ADN dirigida
por esta plantilla se conoce comohebra retrasada.Como se muestra en la figura 9-12,
esta cadena de ADN debe sintetizarse de forma discontinua.
Aunque la ADN polimerasa de cadena principal puede replicar su plantilla tan
pronto como queda expuesta, la síntesis de la cadena rezagada debe esperar a que
el movimiento de la horquilla de replicación exponga una longitud sustancial de
plantilla antes de que pueda replicarse. Cada vez que se expone una longitud
sustancial de una nueva plantilla de cadena retrasada, se inicia la síntesis de ADN y
continúa hasta que alcanza los 50final del tramo anterior recién sintetizado de ADN
de cadena retrasada.
Los fragmentos cortos resultantes de ADN nuevo formado en la cadena rezagada se
denominanFragmentos de Okazakiy varían en longitud de 1000 a 2000 nucleótidos en
bacterias y de 100 a 400 nucleótidos en eucariotas. Poco después de ser sintetizados, los
fragmentos de Okazaki se unen covalentemente para generar una cadena continua e
intacta de ADN nuevo (ver discusión más adelante). Por tanto, los fragmentos de Okazaki
son intermediarios transitorios en la replicación del ADN.
El inicio de una nueva hebra de ADN requiere un cebador de ARN
Como se describió anteriormente, todas las ADN polimerasas requieren un cebador con un 3 libre0-OH.
No pueden iniciar una nueva cadena de ADN de novo. ¿Cómo, entonces, surgen nuevas corrientes?
¿Se inició la síntesis de ADN? Para lograr esto, la célula aprovecha la capacidad de las ARN
polimerasas para hacer lo que las ADN polimerasas no pueden: iniciar nuevas cadenas de
ARN de novo.primasaes una ARN polimerasa especializada dedicada a producir cebadores
de ARN cortos (de 5 a 10 nucleótidos de longitud) en una plantilla de ADN ss. Estos
cebadores se extienden posteriormente mediante la ADN polimerasa. Aunque las ADN
polimerasas incorporan sólo desoxirribonucleótidos en el ADN, pueden iniciar la síntesis
utilizando un cebador de ARN o un cebador de ADN hibridado con la plantilla de ADN.
Aunque tanto la cadena principal como la rezagada requieren primasa para iniciar la
síntesis de ADN, la frecuencia de la función de primasa en las dos cadenas es
espectacularmente diferente (v. fig. 9-12). Cada cadena principal requiere sólo un cebador
de ARN. Por el contrario, la síntesis discontinua de la cadena retrasada significa que se
necesitan nuevos cebadores para cada fragmento de Okazaki. Debido a que una única
bifurcación de replicación puede agregar cientos de miles de nucleótidos a un cebador, la
síntesis de la cadena retrasada puede requerir cientos de fragmentos de Okazaki y sus
cebadores de ARN asociados.
A diferencia de las ARN polimerasas involucradas en la síntesis de ARN mensajero
(ARNm), ARN ribosomal (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) (véase el capítulo 15), las
primasas no requieren una secuencia de ADN extendida para iniciar la síntesis de ARN. En
cambio, las primasas prefieren iniciar la síntesis de ARN utilizando una plantilla de ADN ss
que contiene un trímero particular (GTA en el caso deEscherichia coli primasas). De
acuerdo con esta preferencia, el análisis de laE. coliLa secuencia del genoma muestra que
la secuencia objetivo de GTA paraE. coliLa primasa está sobrerrepresentada en las
porciones del genoma que serán la plantilla para la síntesis de ADN de cadena retrasada.
La actividad primasa aumenta dramáticamente cuando se asocia con otra

proteína que actúa en la horquilla de replicación llamadaADN helicasa.Esta proteína 5' 3'
desenrolla el ADN en la bifurcación de replicación, creando una plantilla de ADN ss 3' 5'
sobre la que puede actuar la primasa. La función de la ADN helicasa se analiza con
ARNasa H
más detalle más adelante. El requisito de una plantilla de ADN ss y una asociación de
ADN helicasa garantiza que la primasa solo esté activa en la bifurcación de
5' 3'
replicación.
3' 5'
Los cebadores de ARN deben eliminarse para completar la replicación del ADN 5'exonucleasa
Para completar la replicación del ADN, los cebadores de ARN utilizados para el inicio deben 5' 3'
retirarse y reemplazarse con ADN (fig. 9-13). La eliminación de los cebadores de ARN puede 3' 5'
considerarse como un evento de reparación del ADN, y este proceso comparte muchas de las imprimación: plantilla
propiedades de la reparación del ADN por escisión, un proceso que se analiza en detalle en el unión
Capítulo 10.
ADN polimerasa
Para reemplazar los cebadores de ARN con ADN, se utiliza una enzima llamada
ARNasa Hreconoce y elimina la mayor parte de cada cebador de ARN. Esta enzima 5' 3'
degrada específicamente el ARN que tiene pares de bases con el ADN (elh(en su
3' 5'
nombre significa “híbrido” en híbrido ARN:ADN). La RNasa H elimina todo el cebador
mella
de ARN excepto el ribonucleótido directamente unido al extremo del ADN. Esto se ADN ligasa
debe a que la RNasa H sólo puede romper enlaces entre dos ribonucleótidos. El
5' 3'
ribonucleótido final se elimina mediante un 50exonucleasa que degrada el ARN o el
ADN de sus 50termina. 3' 5'
La eliminación del cebador de ARN deja un espacio en el ADNds que es un
sustrato ideal para la ADN polimerasa: una unión cebador:plantilla (v. fig. 9-13). La CIFRA9-13Eliminación de cebadores de ARN del
ADN polimerasa llena este vacío hasta que cada nucleótido tiene un par de bases, ADN recién sintetizado.La función secuencial de la
RNasa H, 5.0Se ilustra la exonucleasa, la
dejando una molécula de ADN completa excepto por una ruptura en la columna
ADNpolimerasa y la ligasa de ADN durante la
vertebral de fosfodiéster entre las 3.0-OH y 50-fosfato de la hebra reparada. Esta
eliminación de los cebadores de ARN. (Gris) ADN
“mella” en el ADN puede ser reparada por una enzima llamadaADN ligasa.Las ADN presente antes de la eliminación del cebador de
ligasas utilizan cofactores de alta energía (como el ATP) para crear un enlace ARN; (verde) cebador de ARN; (rojo) el ADN recién
fosfodiéster entre 5 adyacentes.0-fosfato y 30-OH. Sólo después de todo el ARN sintetizado que reemplaza el cebador de ARN.
272 Capítulo 9
Los cebadores se reemplazan por ADN y las muescas asociadas se sellan cuando se
completa la síntesis de ADN.
Las helicasas de ADN desenrollan la doble hélice antes de la

bifurcación de replicación
Las ADN polimerasas generalmente son deficientes para separar las dos cadenas de ADN
dúplex con pares de bases. Por lo tanto, en la bifurcación de replicación, una tercera clase
de enzimas, llamadasADN helicasas,Catalizar la separación de las dos hebras de ADN
dúplex. Estas enzimas se unen y se mueven direccionalmente a lo largo del ADN ss
utilizando la energía de la unión e hidrólisis del nucleósido trifosfato (generalmente ATP)
para desplazar cualquier cadena de ADN que esté hibridada con el ADN ss unido.
Normalmente, las ADN helicasas que actúan en las horquillas de replicación son proteínas
hexaméricas que adoptan la forma de un anillo (fig. 9-14). Estos complejos proteicos en
forma de anillo rodean una de las dos hebras simples en la bifurcación de replicación
adyacente a la unión monocatenaria:bicatenaria.
Al igual que las ADN polimerasas, las ADN helicasas actúan de forma procesiva. Cada
vez que se asocian con un sustrato, desenrollan múltiples pares de bases de ADN. Las
helicasas de ADN hexaméricas en forma de anillo que se encuentran en las horquillas de
replicación exhiben una alta procesividad porque rodean el ADN. Por lo tanto, la liberación
de la helicasa de su sustrato de ADN requiere la apertura del anillo de proteína
hexamérica, lo cual es un evento poco común. Alternativamente, la helicasa puede
disociarse cuando llega al final de la cadena de ADN que ha rodeado.
Por supuesto, esta disposición de enzima y ADN plantea problemas en primer
lugar para la unión de la ADN helicasa al sustrato de ADN. Este problema es más
obvio en los cromosomas circulares, donde no hay un extremo del ADN al que pueda
enroscarse la ADN helicasa. Sin embargo, debido a que las helicasas casi siempre se
cargan en el ADN en sitios internos de los cromosomas lineales, existe el mismo
problema durante la replicación de estos ADN. Por lo tanto, existen mecanismos
especializados que abren el anillo de la ADN helicasa y lo colocan alrededor del ADN
antes de volver a formar el anillo (consulte la sección sobre Inicio de la replicación del
ADN). Este vínculo topológico entre las proteínas involucradas en la replicación del
ADN y sus sustratos de ADN es un mecanismo común para aumentar la procesividad.
3'
5'
3'
5'
EN PAG
ADP + PAG
i
CIFRA9-14 Las helicasas de ADN se separan

3'
las dos hebras de la doble hélice.Cuando se
agrega ATP a una ADN helicasa unida a ADN
ss, la helicasa se mueve con una polaridad 5'
definida en ese ADN. En el ejemplo ilustrado, la 3'
ADN helicasa tiene un 50!30polaridad. Esta
polaridad significa que la ADN helicasa estaría
unida a la plantilla de la cadena retrasada en la
bifurcación de replicación. 5'
Cada ADN helicasa se mueve a lo largo del ADN ss en una dirección definida. Esta
propiedad se conoce como lapolaridadde la ADN helicasa. Las ADN helicasas pueden
tener una polaridad de 50!30o 30!50. Esta dirección siempre se define según la hebra
de ADN unida (o rodeada en el caso de una helicasa en forma de anillo), en lugar de
la hebra que está desplazada. En el caso de una ADN helicasa que funciona en la
plantilla de cadena retrasada de la horquilla de replicación, la polaridad es 50!30para
permitir que la ADN helicasa avance hacia la región dúplex de la horquilla de
replicación (v. fig. 9-14). Como ocurre con todas las enzimas que se mueven a lo largo
del ADN de manera direccional, el movimiento de la helicasa a lo largo del ADN ss
requiere el aporte de energía química. Para las helicasas, esta energía la proporciona
la hidrólisis del ATP.
La ADN helicasa tira del ADN monocatenario a través de un

poro proteico central
¿Cómo utiliza una ADN helicasa hexamérica la energía de la hidrólisis del ATP para
moverse a lo largo del ADN? La determinación de la estructura atómica de una
helicasa hexamérica viral unida a un sustrato de ADN monocatenario proporciona
información sobre esta cuestión. En esta estructura, el ssDNA está rodeado por seis
subunidades de la helicasa (fig. 9-15). Cada subunidad tiene un bucle proteico en
forma de “horquilla” que se une a un fosfato de la columna vertebral del ADN y sus
dos componentes ribosa adyacentes. Curiosamente, estos bucles de unión al ADN se
encuentran en una escalera de caracol hacia la derecha, y cada uno de ellos une el
siguiente fosfato a lo largo del ADNss. Como se muestra en la Figura 9-15, la parte
superior de la escalera está asociada con los 50final y el fondo con los 30final del
ADNss.
La estructura atómica es sólo una instantánea; sin embargo, cada una de las seis
subunidades diferentes se encuentra en una etapa diferente del proceso de
translocación del ADN. En conjunto, las interacciones de las diferentes subunidades
con el ADN y el ATP/ADP revelan cómo el movimiento coordinado de estas horquillas
proteicas puede tirar del ADNss a través del poro central de la helicasa. Primero, una
subunidad se une al ADNss en la parte superior de la estructura (fig. 9-15b), y el bucle
de unión al ADN se mueve a través de conformaciones sucesivas hacia la parte
inferior, arrastrando consigo el ADN unido. Es importante destacar que cada una de
estas conformaciones está asociada con un estado de unión a nucleótidos diferente;
la conformación superior está en un estado unido a ATP, la del medio está en un
estado unido a ADP y la inferior carece de un nucleótido unido. Por lo tanto, cuando
una sola subunidad se une, hidroliza y libera ATP, recorrerá las conformaciones
superior, media e inferior. En general, se puede pensar en la helicasa como si tuviera
seis manos tirando de una cuerda mano a mano.
Además de translocarse a lo largo del ADNss, una helicasa también debe desplazar la cadena
complementaria para provocar el desenrollamiento del ADN. En el caso de esta helicasa
hexamérica, la estructura del canal central muestra que debe ocurrir un desplazamiento de la
cadena para que el ADN pase a través del canal. En su punto más estrecho, el canal central tiene
un diámetro de 13 Å, lo suficientemente grande como para que quepa el ssDNA, pero demasiado
pequeño para que quepa el diámetro de 20 Å del dsDNA.
Las proteínas de unión al ADN monocatenarias estabilizan el ADN ss

antes de la replicación
Una vez que la ADN helicasa ha pasado, el ssDNA recién generado debe permanecer
libre de apareamiento de bases hasta que pueda usarse como plantilla para la
síntesis de ADN. Para estabilizar las hebras separadas,Proteínas de unión a ADNss (
SSB) se unen rápidamente a las hebras separadas. La unión de una SSB promueve la
unión de otra SSB al ssDNA inmediatamente adyacente (fig. 9-16).
274 Capítulo 9
atp ADP + Pi sin nucleótidos
CIFRA9-15Estructura y mecanismos propuestos de una ADN helicasa. (a) Estructura general de la helicasa
hexamérica del virus del papiloma bovino E1. Cada subunidad se muestra en un color diferente y el
complejo se muestra de lado (izquierda) y mirando hacia el canal central del hexámero (derecha). Las
subunidades de proteínas se muestran en forma de cinta y el ssDNA como un diagrama de barras. (b)
Ilustración del movimiento propuesto de las horquillas de unión al ADN. En estas vistas, solo mostramos
el ssDNA en el canal central de la helicasa y dos de las seis horquillas proteicas críticas que se unen a este
ADN durante la translocación. Las tres vistas muestran la horquilla violeta interactuando con el fosfato
asociado con el nucleótido negro moviéndose desde el estado superior (la subunidad asociada con la
horquilla está unida a ATP) al estado medio (unido a ADP) y al inferior (sin nucleótidos). estado. Observe
cómo la base negra en el ssDNA se mueve con las horquillas azules en ATP y ADP + Pi pero se libera en la
imagen sin nucleótidos. La nueva unión del ATP hace que el bucle de unión al ADN regrese a la posición
superior para permitir la unión a un nuevo fosfato (como se ve en la horquilla azul, que está un paso por
delante de la horquilla violeta, en el panel "sin nucleótidos"; los encabezados de los paneles se refieren a
la subunidad de horquilla violeta). Tenga en cuenta que los otros cuatro bucles de unión al ADN también
se mueven a través de los mismos intermediarios. (De Enemark EJ y Joshua-Tor L. 2006.Naturaleza442:
270–275. Código PDB: 2GXA. Imagen preparada con MolScript, BobScript y Raster3D).
Se llamavinculación cooperativay ocurre porque las moléculas de SSB unidas a

regiones inmediatamente adyacentes de ssDNA también se unen entre sí. Esta
interacción SSB-SSB estabiliza fuertemente la unión de SSB al ssDNA y hace que
los sitios ya ocupados por una o más moléculas de SSB sean sitios de unión a
SSB preferidos.
La unión cooperativa garantiza que el ssDNA sea rápidamente recubierto por SSB a
medida que emerge de la ADN helicasa. (La unión cooperativa es una propiedad de
muchas proteínas de unión al ADN. Consulte el Capítulo 18, Cuadro 18-4, Concentración,
afinidad y unión cooperativa.) Una vez recubierto con SSB, el ADNss se mantiene en un
estado alargado que facilita su uso como plantilla. para la síntesis de cebadores de ADN o
ARN.
Los SSB interactúan con el ssDNA de manera independiente de la secuencia. Los SSB
contactan principalmente con el ssDNA a través de interacciones electrostáticas con la columna
vertebral de fosfato e interacciones de apilamiento con las bases del ADN. A diferencia de las
proteínas de unión al ADN de secuencia específica, las SSB forman pocos enlaces de hidrógeno, o
ninguno, con las bases del ADNss.
a b
Unión de
SSB adicionales
CIFRA9-16Unión de la proteína de unión monocatenaria (SSB) al ADN. (a) Una cantidad límite de SSB está unida a cuatro de
las nueve moléculas de ADNss que se muestran. (b) A medida que más SSB se unen al ADN, se unen preferentemente de
manera adyacente a las moléculas de SSB previamente unidas. Sólo después de que las SSB hayan recubierto
completamente las moléculas de ADN ss unidas inicialmente se produce la unión a otras moléculas. Tenga en cuenta que
cuando el ssDNA está recubierto con SSB, asume una conformación más extendida que inhibe la formación de pares de
bases intramoleculares.
Las topoisomerasas eliminan las superenrollamientos producidas por el
desenrollamiento del ADN en la bifurcación de replicación
A medida que las hebras de ADN se separan en la horquilla de replicación, el ADNbc

situado delante de la horquilla se vuelve cada vez más superenrollado positivamente (fig.
9-17). Esta acumulación de superenrollamientos es el resultado de que la ADN helicasa
elimina los pares de bases entre las dos hebras. Si las cadenas de ADN permanecen
intactas, no puede haber reducción en el número de enlaces (el número de veces que se
entrelazan las dos cadenas de ADN) para acomodar este desenrollamiento del dúplex de
ADN (consulte el Capítulo 4). Por lo tanto, a medida que avanza la ADN helicasa, el ADN
debe acomodar el mismo número de enlaces dentro de un número cada vez menor de
pares de bases. De hecho, para que el ADN situado delante de la horquilla de replicación
permanezca relajado, se debe eliminar un enlace de ADN por cada !10 pb de ADN
desenrollado. Si no hubiera un mecanismo para aliviar la acumulación de estos
superenrollamientos, la maquinaria de replicación se paralizaría ante la creciente tensión
ejercida sobre el ADN frente a la horquilla de replicación.
Este problema es más claro en el caso de los cromosomas circulares de las bacterias, pero
también se aplica a los cromosomas eucariotas. Debido a que los cromosomas eucariotas no son
círculos cerrados, en principio podrían girar a lo largo de su longitud para disipar los
superenrollamientos introducidos. Sin embargo, este no es el caso: simplemente no es posible
rotar una molécula de ADN que tiene millones de pares de bases de largo cada vez que se
desenrolla una vuelta de la hélice.
Las superenrollamientos introducidas por la acción de la ADN helicasa se eliminan
mediantetopoisomerasasque actúan sobre el ADNbc no replicado delante de la
bifurcación de replicación (fig. 9-17). Estas enzimas hacen esto rompiendo una o
ambas hebras del ADN sin soltar el ADN y pasando el mismo número de hebras de
ADN a través de la rotura (como analizamos en el Capítulo 4). Esta acción alivia la
acumulación de superenrollamientos. De esta manera, las topoisomerasas actúan
como una “swivelasa” que previene la acumulación de superenrollamientos positivos
antes de la bifurcación de replicación.
Las enzimas de horquilla de replicación amplían la gama

de sustratos de ADN polimerasa
Por sí sola, la ADN polimerasa sólo puede extender eficientemente 30Cebadores

-OH hibridados con plantillas de ADNss. La adición de primasa, ADN helicasa y
topoisomerasa amplía drásticamente los posibles sustratos para el ADN.
276 Capítulo 9
maquinaria de replicación
CIFRA9-17Acción de la topoisomerasa en la bifurcación
de replicación.A medida que se acumulan
superenrollamientos positivos frente a la horquilla de
replicación, las topoisomerasas los eliminan
rápidamente. En este diagrama, la acción de Topo II
elimina la superenrollamiento positiva inducida por
una horquilla de replicación. Al pasar una parte del replicación
ADNbc no replicado a través de una rotura de doble
cadena en una región cercana no replicada, se pueden (positivo
eliminar las superenrollamientos positivas. Vale la pena superbobina)
señalar que este cambio reduciría el número de enlaces

en dos y, por lo tanto, solo tendría que ocurrir una vez
cada 20 pb replicados. Aunque aquí se ilustra la acción
de una topoisomerasa de tipo II, las topoisomerasas de
tipo I también pueden eliminar los
superenrollamientos positivos generados por una
horquilla de replicación. Tenga en cuenta que la topoisomerasa II
superhelicidad positiva frente a la horquilla de romper D N / A
replicación se muestra como una contorsión toroidal

derecha (una vuelta completa equivale a una
contorsión positiva de! 1). El paso de una molécula de
ADNbc a través de la otra en el lugar de la contorsión
cambia esta contorsión a una contorsión toroidal
izquierda completa (igual a una contorsión de –1). Esto
ilustra cómo una topoisomerasa tipo II cambia el
número de enlace en 2 unidades (para obtener más
información sobre la topología y la torsión del ADN,
consulte el Capítulo 4, Topología del ADN, y el Capítulo
8, Cuadro 8-2).
pasar ADN
a través del descanso
(negativo
superbobina)
polimerasa. Primase proporciona la capacidad de iniciar nuevas cadenas de ADN en cualquier

fragmento de ADN ss. Por supuesto, el uso de primasa también impone el requisito de eliminar
los cebadores de ARN para completar la replicación. De manera similar, la separación de cadenas
mediante la ADN helicasa y la disipación de superenrollamientos positivos mediante la
topoisomerasa permiten que la ADN polimerasa replique el ADN ds. Aunque los nombres de las
proteínas cambian de un organismo a otro (tabla 9-1), organismos tan diversos como bacterias,
levaduras y humanos utilizan el mismo conjunto de actividades enzimáticas para lograr la
replicación del ADN cromosómico.
Es de destacar que tanto la ADN helicasa como la topoisomerasa realizan sus funciones
sin alterar permanentemente la estructura química del ADN ni sintetizar ninguna molécula
nueva. La ADN helicasa rompe sólo los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos
hebras de ADN sin romper ningún enlace covalente. Aunque las topoisomerasas rompen
uno o dos de los enlaces covalentes del ADN objetivo, cada enlace roto se vuelve a formar
con precisión antes de que la topoisomerasa libere el ADN (consulte el Capítulo 4, Fig.
4-25). En lugar de alterar la estructura química del ADN, la acción de estas enzimas da
como resultado una molécula de ADN con una conformación alterada. Es importante
destacar que estas alteraciones conformacionales son esenciales para la duplicación de las
grandes moléculas de ADNbc que son la base de los cromosomas tanto bacterianos como
eucarióticos.
MESA9-1Enzimas que funcionan en la bifurcación de replicación
Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Humano
primasa ADNG Complejo primasa primasa

ADN helicasa ADNB (PRI I/PRI 2) Mcm2-7 Complejo mcm2-7
SSB SSB RPA RPA
topoisomerasas Topo I, Girasa Topo I, II Topo I, II
Las proteínas que actúan en la bifurcación de replicación interactúan

estrechamente pero de manera independiente de la secuencia con el ADN. Estas
interacciones explotan las características del ADN que son las mismas
independientemente del par de bases particular: la carga negativa y la estructura de
la columna vertebral de fosfato (por ejemplo, el dominio pulgar de la ADN
polimerasa), los residuos de enlaces de hidrógeno en el surco menor (por ejemplo, el
dominio palma de la ADN polimerasa), y las interacciones de apilamiento hidrofóbico
entre las bases (p. ej., SSB). Además, las estructuras de algunas de estas proteínas
están especializadas para estimular la acción procesiva al rodear total (p. ej., ADN
helicasa) o parcialmente (p. ej., ADN polimerasa) el ADN.
LA ESPECIALIZACIÓN DE LAS ADN POLIMERASAS
Las ADN polimerasas están especializadas para diferentes funciones en la célula
El papel central de las ADN polimerasas en la replicación eficiente y precisa del

genoma ha resultado en la evolución de múltiples ADN polimerasas especializadas.
Por ejemplo,E. coliTiene al menos cinco ADN polimerasas que se distinguen por sus
propiedades enzimáticas, composición de subunidades y abundancia (Tabla 9-2).ADN
polimerasa III (DNA Pol III) es la principal enzima implicada en la replicación del
cromosoma. Porque los 4,6 Mb completosE. coliPara que el genoma se replica
mediante dos horquillas de replicación, DNA Pol III debe ser altamente procesivo. De
acuerdo con estos requisitos, generalmente se considera que DNA Pol III es parte de
un complejo más grande que confiere una procesividad muy alta, un complejo
conocido comoHoloenzima ADN Pol III.
A diferencia de,ADN polimerasa I (DNA Pol I) está especializado en la eliminación de los
cebadores de ARN que se utilizan para iniciar la síntesis de ADN. Por esta razón, esta ADN
polimerasa tiene un 50exonucleasa que permite que DNA Pol I elimine el ARN o el ADN
inmediatamenterío arribadel sitio de síntesis del ADN. A diferencia de la holoenzima DNA
Pol III, DNA Pol I no es altamente procesiva y agrega solo de 20 a 100 nucleótidos por
evento de unión. Estas propiedades son ideales para la eliminación de cebadores de ARN y
la síntesis de ADN a través de la brecha de ADN ss resultante. los 50
La exonucleasa de DNAPol I puede eliminar el enlace ARN-ADN que es resistente a la
ARNasa H (v. fig. 9-13). La baja procesividad del ADN Pol I se sintetiza fácilmente a
través de la corta región previamente ocupada por un cebador de ARN (<10
nucleótidos), pero se libera antes de degradar y resintetizar grandes cantidades de
ADN que fue cebado por el ARN. Finalmente, cuando DNA Pol I completa su función,
sólo queda presente una mella en el ADN.
Debido a que tanto DNA Pol I como DNA Pol III participan en la replicación del
ADN, ambas enzimas deben ser muy precisas. Por tanto, ambas proteínas incluyen
una exonucleasa correctora asociada. Las tres ADN polimerasas restantes enE. coli
están especializados en actividades de reparación de ADN y corrección de errores.
Estas enzimas se analizan en el Capítulo 10.
Las células eucariotas también tienen múltiples ADN polimerasas, y una célula
típica tiene más de 15. De ellas, tres son esenciales para duplicar el genoma:
278 Capítulo 9
MESA9-2Actividades y funciones de las ADN polimerasas.
Número de
subunidades Función
Procariótico (E. coli)

Pol I 1 Eliminación de cebadores de ARN, reparación de ADN
Pol II (Din A) 1 Reparación de ADN
Núcleo Pol III 3 replicación cromosómica

Pol III 9 replicación cromosómica
holoenzima
Pol IV (Din B) 1 Reparación de ADN, síntesis de translesión (TLS)
Pol V (UmuC, 3 TLS

UmuD02C)
eucariota
Pola 4 Síntesis de cebadores durante la replicación del ADN
Polb 1 Reparación por escisión de bases
Polgramo 3 Replicación y reparación del ADN mitocondrial.

Pold 2–3 Síntesis de ADN de cadena retrasada; nucleótido y base
reparación por escisión
Pol1 4 Síntesis de ADN de cadena principal; nucleótido y base

reparación por escisión
Poltu 1 Reparación de enlaces cruzados en el ADN.
Polz 1 TLS
Polyo 1 Reparación del ADN asociada a la
Polmetro 1 meiosis Hipermutación somática
Polk 1 TLS
Polh 1 Pasado TLS relativamente precisocis-syndímeros de
Poli 1 ciclobutano TLS, hipermutación somática
Rev1 1 TLS
Datos de Sutton MD y Walker GC 2001.Proc. Nacional. Acad. Ciencia.98:8342–8349 y sus referencias.
ADN Pold,ADN Pol1,y ADN Pola/primasa. Cada una de estas ADN polimerasas
eucariotas está compuesta de múltiples subunidades (consulte la tabla 9-2). ADN Pol
a/primasa participa específicamente en la iniciación de nuevas cadenas de ADN. Este
complejo proteico de cuatro subunidades consta de un ADN Pol de dos subunidades.
ayuna primasa de dos subunidades. Después de que la primasa sintetiza un cebador
de ARN, la unión cebador: plantilla de ARN resultante se entrega inmediatamente al
ADN Pol asociado.apara iniciar la síntesis de ADN.
Debido a su procesividad relativamente baja, DNA Pola/primasa es rápidamente
reemplazada por el ADN Pol altamente procesivody pol1.El proceso de sustitución del
ADN Pol.a/primasa con ADN Poldo Pol1se llamaconmutación de polimerasa (Fig.
9-18) y da como resultado tres ADN polimerasas diferentes que funcionan en la
horquilla de replicación eucariota. ADN Poldy1están especializados en sintetizar
diferentes cadenas en la bifurcación de replicación, con ADNol1sintetizando la
cadena principal y el ADN Poldla hebra rezagada. Al igual que en las células
bacterianas, la mayoría de las ADN polimerasas eucariotas restantes participan en la
reparación del ADN.
Las abrazaderas deslizantes aumentan drásticamente la procesividad de la ADN polimerasa
La alta procesividad en la replicación garantiza una rápida duplicación cromosómica. Como

hemos comentado, las ADN polimerasas en la bifurcación de replicación sintetizan de miles
a millones de pares de bases sin liberarse de la plantilla. A pesar de esto, cuando se
analizan en ausencia de otras proteínas, las ADN polimerasas que actúan en la horquilla de
replicación solo son capaces de sintetizar entre 20 y 100 pb.
3' 5'
CIFRA9-18Conmutación de ADN
5' 3' polimerasas durante la replicación del ADN
eucariota. Se ilustra el orden de la función
ADN Pol !/ de la ADN polimerasa eucariota. La longitud
cebador de ARN
primasa del ADN sintetizado es más corta que en la
síntesis por primasa
realidad a efectos ilustrativos.
Normalmente, el ADN Pol combinadoa/
producto primasa está entre 50 y 100 pb, y
3' 5'
la extensión adicional por Pol1o PoldTiene
5' 5' 3' entre 100 y 10.000 nucleótidos. Aunque
síntesis de ADN
tanto DNA Poldy1puede sustituir a DNA Pol
por Pol! a/ primasa, estudios recientes indican que
DNA Pol1sustitutos en la plantilla de
cadena principal y DNA Poldsustitutos en la
3' 5'
plantilla de hebras retrasadas.
5' 5' 3'
ADN Pol $ o %
corredizo
abrazadera
3' 5'
5' 5' 3'
3' 5'
5' 5' 3'
antes de liberarse de la plantilla. ¿Cómo aumenta tan dramáticamente la

procesividad de estas enzimas en la bifurcación de replicación?
Una clave de la alta procesividad de las ADN polimerasas que actúan en las horquillas de
replicación es su asociación con proteínas llamadasAbrazaderas deslizantes de ADN. Estas
proteínas están compuestas de múltiples subunidades idénticas que se ensamblan en forma de
"rosquilla". El orificio en el centro de la abrazadera es lo suficientemente grande como para
rodear la doble hélice del ADN y dejar espacio para una capa de una o dos moléculas de agua
entre el ADN y la proteína (figura 9-19a) (consulte el Tutorial estructural 9-2). . Estas propiedades
permiten que las proteínas de sujeción se deslicen a lo largo del ADN sin disociarse de él. Es
importante destacar que las abrazaderas deslizantes de ADN también se unen estrechamente a
las ADN polimerasas unidas a las uniones cebador:plantilla (fig. 9-19b). El complejo resultante
entre la polimerasa y la abrazadera deslizante se mueve eficientemente a lo largo de la plantilla
de ADN durante la síntesis de ADN.
¿Cómo cambia la asociación con la abrazadera deslizante la procesividad
de la ADN polimerasa? En ausencia de la abrazadera deslizante, una ADN
polimerasa se disocia y se difunde lejos del ADN molde en promedio una
vez cada 20 a 100 pb sintetizados. En presencia de la abrazadera deslizante,
la ADN polimerasa aún desacopla su sitio activo del 30-OH del ADN con
frecuencia, pero la asociación con la abrazadera deslizante impide que la
polimerasa se difunda fuera del ADN (fig. 9-20). Al mantener la ADN
polimerasa muy cerca del ADN, la abrazadera deslizante
280 Capítulo 9
b dirección de replicación
pinza deslizante
hebra de plantilla
3' 3'
5'
ADN recién replicado
CIFRA9-19Estructura de una pinza de ADN deslizante. (a) Estructura 3D de una pinza deslizante de ADN asociada
al ADN. La abertura que pasa por el centro de la abrazadera deslizante es de !35 Å y el ancho de la hélice del ADN
es de !20 Å. Esto proporciona suficiente espacio para permitir una capa delgada de una o dos moléculas de agua
entre la abrazadera deslizante y el ADN. Se cree que esto permite que la pinza se deslice fácilmente a lo largo del
ADN. (Adaptado de Krishna TS et al. 1994.Celúla79:1233–1243. Imagen preparada con MolScript, BobScript y
Raster3D. ADN modelado por Leemor Joshua-Tor.) (b) Abrazaderas de ADN deslizantes rodean el ADN recién
replicado producido por una ADN polimerasa asociada. La abrazadera deslizante interactúa con la parte de la
ADN polimerasa que está más cerca del ADN recién sintetizado a medida que emerge de la ADN polimerasa.
asegura que la ADN polimerasa se vuelva a unir rápidamentelo mismoUnión

cebador:plantilla, aumentando enormemente la procesividad de la ADN polimerasa.
Una vez que una plantilla de ADNss ha dirigido la síntesis de su cadena de ADN
complementaria, la ADN polimerasa debe liberarse del ADNds completo y de la
abrazadera deslizante para actuar en una nueva unión cebador:plantilla. Esta
liberación se logra mediante un cambio en la afinidad entre la ADN polimerasa y la
abrazadera deslizante que depende del ADN unido. La ADNpolimerasa unida a una
unión cebador:plantilla tiene una alta afinidad por la abrazadera. Por el contrario,
cuando una ADN polimerasa alcanza el final de una plantilla de ADN ss (p. ej., al final
de un fragmento de Okazaki), la presencia de ADN ds en su sitio activo da como
resultado un cambio en la conformación que reduce la afinidad de la polimerasa por
la abrazadera deslizante y el ADN (ver Fig. 9-20). Así, cuando una polimerasa
completa la replicación de un tramo de ADN, se libera de la abrazadera deslizante
para que pueda actuar en una nueva unión cebador:plantilla.
Una vez liberadas de una ADN polimerasa, las abrazaderas deslizantes no se retiran
inmediatamente del ADN replicado. En cambio, otras proteínas que funcionan en el sitio de
síntesis reciente de ADN interactúan con las proteínas de sujeción. Como se describe en el
capítulo 8, las enzimas que ensamblan la cromatina en las células eucariotas se reclutan en los
sitios de replicación del ADN mediante una interacción con la abrazadera deslizante del ADN
eucariota (llamada “PCNA”). De manera similar, las proteínas eucariotas implicadas en la
reparación del fragmento de Okazaki también interactúan con las proteínas de la abrazadera
deslizante. En cada caso, al interactuar con abrazaderas deslizantes, estas proteínas se acumulan
en los sitios de síntesis de ADN nuevo donde más se necesitan.
a pinza deslizante
plantilla ADN polimerasa
3' 5'
5' 5' 3'
cebador
a
b
3' 5'
5' 5' 3'
3' 5'
5' 5' 3' b
3' 5'
5' 3'
CIFRA9-20Las abrazaderas deslizantes de ADN aumentan la procesividad de las ADN polimerasas

asociadas. (a) La pinza deslizante de ADN rodea el ADN y al mismo tiempo une la ADN polimerasa. (b) La
procesividad relativamente baja de las ADN polimerasas conduce a una liberación frecuente de la unión
C
cebador:plantilla, pero la asociación de la polimerasa con la abrazadera deslizante evita la difusión fuera
del ADN. (c) La asociación de la ADN polimerasa con la abrazadera deslizante garantiza que la ADN
polimerasa vuelva a unir la misma unión cebador:plantilla y reanude la síntesis de ADN. (d) Una vez que
la ADN polimerasa ha completado la síntesis de la plantilla, la ausencia de una unión cebador:plantilla
provoca un cambio en la ADN polimerasa que la libera de la abrazadera deslizante.
Las proteínas de pinza deslizante son una parte conservada del aparato de
replicación del ADN derivado de organismos tan diversos como virus, bacterias,
levaduras y humanos. De acuerdo con su función conservada, también se conserva la
estructura de las abrazaderas deslizantes derivadas de estos diferentes organismos
(fig. 9-21). En cada caso, la abrazadera tiene la misma simetría séxtuple y el mismo CIFRA9-21Estructura 3D de pinzas deslizantes de
diámetro. A pesar de la similitud en la estructura general, el número de subunidades ADN aisladas de diferentes organismos.Las
que se unen para formar la abrazadera difiere. abrazaderas deslizantes de ADN se encuentran en
todos los organismos y comparten una estructura
similar. (a) La abrazadera deslizante de ADN deE.
Las abrazaderas deslizantes se abren y colocan en el ADN mediante cargadores de abrazaderas colise compone de dos ejemplares delbproteína.
(Adaptado de Kong XP et al. 1992.Celúla 69:425–
La abrazadera deslizante es un anillo cerrado en solución, pero debe abrirse para rodear la 437.) (b) La pinza deslizante del ADN del fago T4 es
un trímero de la proteína gp45. (Adaptado de
doble hélice del ADN. Una clase especial de complejos proteicos, llamadoscargadores de
Moarefi I. et al. 2000.J. Mol. Biol.296:1215–1223.) (c)
abrazadera deslizante,catalizar la apertura y colocación de pinzas deslizantes en el ADN.
La pinza deslizante del ADN eucariota es un
Estas enzimas acoplan la unión de ATP y la hidrólisis a la colocación de la abrazadera
trímero de la proteína PCNA. (Adaptado de Krishna
deslizante alrededor de las uniones cebador:plantilla en el ADN (consulte el Cuadro 9-3, TS et al. 1994.Celúla79:1233–1243. Imágenes
Control de la función de la proteína por ATP: carga de una abrazadera deslizante). El preparadas con MolScript, BobScript y Raster3D).
cargador de abrazaderas también elimina las abrazaderas deslizantes del ADN cuando

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La replicación del ADN

molde. para la síntesis de nuevas cadenas de ADN. estructurales y animaciones interactivas

LA QUÍMICA DE LA SÍNTESIS DEL ADN

La síntesis de ADN requiere trifosfatos de

oh– oh– oh– C.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOTCGRAMOC.A.GRAMOt

CIFRA9-1Sustratos necesarios para la síntesis de ADN. (a) La estructura general de los 20

debe tener un 3 expuesto0-OH adyacente a la región monocatenaria del molde. es

El ADN se sintetiza extendiendo el30Fin de la cartilla

PAG PAG PAG PAG OH

PAG PAG PAG PAG PAG OH

La hidrólisis del pirofosfato es la fuerza impulsora de la síntesis de ADN

La adición de un nucleótido a una cadena polinucleotídica de longitud creciente.norteestá

¡XTP! (XMP)norte! (XMP)¡norte!1!PAG!PAG:

El resultado neto de la adición de nucleótidos.yLa hidrólisis del pirofosfato es la

¡XTP! (XMP)norte! (XMP)¡norte!1! 2PAGi:

Esta es una reacción muy favorable con unaDGRAMOde –7 kcal/mol, que

EL MECANISMO DE LA ADN POLIMERASA

La síntesis de ADN es catalizada por una clase de enzimas llamadasADN polimerasas.

apar de bases correcto bpar de bases incorrecto

t A par de bases A:A incorrecto desplaza ela-fosfato

HO PAG oh PAG oh PAG OCH2oh

oh– oh– oh–

HO PAG oh PAG oh PAG OCH2oh

oh– oh– oh–

de bases y las ADN polimerasas pueden acomodar fácilmente restos mucho

Un ensayo de incorporación requiere dos pasos (Cuadro 9-1, Fig. 2).

CAJA 9-1CIFRA2 Ensayo de incorporación para medir el ADN. 0

plantilla restricciones estéricas que impiden que la ADN

Las ADN polimerasas se asemejan a una mano que agarra el

Una comprensión molecular de cómo la ADN polimerasa cataliza la síntesis de ADN

El dominio de la palma se compone de unabHoja y contiene los elementos

Las ADN polimerasas son enzimas procesivas

La catálisis por la ADNpolimerasa es rápida. Las ADN polimerasas son capaces de

realiza varias interacciones importantes con el

CIFRA9-8Ilustración del camino del ADN molde a

un dNTP Se agregaron muchos dNTP

Liberaciones de ADN polimerasa

3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' OH-3'

La procesividad se facilita mediante el deslizamiento de las ADN polimerasas a lo

ADN de una manera no específica de secuencia. Estas interacciones incluyen norte

interacciones electrostáticas entre la columna vertebral de fosfato y el dominio del norte

pulgar e interacciones entre el surco menor del ADN y el dominio de la palma

(descritas anteriormente). La naturaleza independiente de la secuencia de estas azúcar

el ADN se vuelve a unir rápidamente a la polimerasa en una posición que se desplaza

aumentos en la procesividad mediante interacciones entre la ADN polimerasa y las norte

proteínas accesorias, que discutiremos más adelante. oh h norte

que, después de su conversión en un nucleósido trifosfato, se incorpora al

h incluida la inmunosupresión (debido a la pérdida de glóbulos blancos), anemia

NO la azidotimidina (AZT), un análogo de la atimidina que inhibe la ADN

HO estructura de cadena abierta que se asemeja a la parte de la ribosa más

última base pulgar

dirección de la hebra principal

cebadores de ARN 5'

ADN polimerasa 3'

ADN replicado ADN no replicado

El inicio de una nueva hebra de ADN requiere un cebador de ARN

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CIFRA9-14 Las helicasas de ADN se separan

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