1.

Determinar el Vo y Vt → rango de fraccionamiento = permite saber el volumen

mínimo para que pasen las proteínas y el volumen máximo.
2. Los dos tintes sirvieron para calibrar la columna.
3. Muestra proteica → cogimos muestras de 2mL y para mirar la absorbancia cogimos
0.5mL, por tanto, de la fracción nos queda 1,5mL.
4. Realización de cromatograma → en el espectrofotómetro leemos absorbancia y todas
las proteínas tienen grupos aromáticos por tanto ambas absorbieran luz.
a. Antes en el grafico: más grandes
b. Después en el gráfico: más pequeñas
5. Realización de gel → para ver que hay en cada pico (determinar el peso molecular de
cada proteína y así sabemos de qué se trata)
a. En el gel:
i. Muestra proteica: dos bandas (arriba y abajo)
ii. Arriba: proteínas grandes
iii. Abajo: proteínas pequeñas
6. Juntamos las fracciones que vemos que tienen la misma proteína
7. Leemos absorbancia + recta patrón
8. A partir de la recta patrón podemos cuantificar la cantidad de proteína en cada
muestra.

Ejemplo:

PEQUEÑA → 14 fracciones y cada fracción tiene 1,5mL → 14 * 1,5 = 21 mL (muestra pura de la

proteína pequeña)

Multiplica volumen por la concentración obtenida → 21 * 0.213 = 4,473mg

GRANDE → 7 fracciones * 1.5mL →

Muestra diluida 1/10 = 11,7 mg/mL * 0.5 mL =5,85 mg (de proteína total que puede haber)

En el gel deberíamos haber observado que la línea de abajo (En la muestra proteica) es mas
densa, debido a que hay mas concentración y por tanto debería corresponder con el grafico,
porque debería haber salido que el segundo pico tiene mas absorbancia (proteína pequeña)
DISCUSIÓN PRÁCTICA 6

Tras llevar a cabo la experimentación, se han derivado las siguientes conclusiones

fundamentales.

En una primera instancia, al analizar las absorbancias a 620 nm y 425 nm del azul de dextrano y
el potasio de hexacianoferrato, respectivamente, y al elaborar un cromatograma, se ha
constatado que la columna de exclusión molecular exhibe indicios de fractura, evidenciándose
un desvío preferencial en el recorrido de las muestras. Este fenómeno se atribuye a la naturaleza
orgánica diminuta del potasio de hexacianoferrato, un compuesto que teóricamente debería
penetrar en todos los poros de la columna y, por ende, demorarse considerablemente en eluirse,
es decir, en salir de la columna. No obstante, el cromatograma revela que una parte significativa
de la muestra de potasio hexacianoferrato emerge antes de lo esperado en relación con la
columna.

Desde una perspectiva ideal, el azul dextrano debería haber experimentado una elución
primaria, dado que las dimensiones de este compuesto orgánico exceden el rango máximo de
los poros presentes en la columna. Por consiguiente, el azul dextrano no debería haber logrado
penetrar en ninguno de estos poros y, en consecuencia, debería haber sido eluido en primer
lugar. Posteriormente, en concordancia con el volumen total de la columna, se esperaría que el
potasio de hexacianoferrato se eluyera, considerando su tamaño considerablemente reducido,
permitiéndole penetrar en todos los poros de la columna, y por ende, prolongando su tiempo
de elución.

Posteriormente, se ha procedido a realizar el mismo protocolo experimental con una mezcla

proteica. Se han llevado a cabo lecturas de absorbancia a 280 nm para cada fracción obtenida,
y se ha generado un cromatograma que representa la absorbancia en función del volumen. En
dicho cromatograma, se ha vuelto a visualizar la presencia de un camino preferente en el
recorrido de las proteínas a través de la columna.

Esta mezcla proteica, compuesta por albúmina sérica bovina (BSA) y lisozima, debería haberse
reflejado idealmente en el cromatograma con la presencia de dos picos distintos. En primer
lugar, se esperaría la manifestación de un pico atribuible a la BSA, caracterizado por una
absorbancia menor, dada la menor concentración de BSA en la muestra en comparación con la
lisozima. En segundo lugar, se esperaría la aparición de un pico correspondiente a la lisozima,
coincidiendo con el volumen total de la columna, y presentando una absorbancia más elevada
debido a su mayor concentración. No obstante, la observación del cromatograma revela un
primer pico con una absorbancia considerablemente elevada, indicativo del desvío preferencial.
En este caso, tanto la BSA como la lisozima han sido eluidas simultáneamente, sugiriendo que la
lisozima ha seguido una ruta alternativa y no ha penetrado en todos los poros de la columna.

Seguidamente, se identifica otro pico más allá del volumen total de la columna, caracterizado
por una absorbancia menor, correspondiente a la lisozima. Este pico exhibe una altura reducida,
atribuible a la significativa elución previa de la lisozima. No obstante, la razón detrás de la elución
de la lisozima más allá del volumen total de la columna se debe a una interacción inespecífica
con la columna.

Posteriormente, se procedió a la selección de las fracciones correspondientes a los picos de

absorbancia identificados en el cromatograma. En este contexto, se optó por escoger
específicamente 35 fracciones ubicadas entre el primer y segundo pico, con el propósito de
examinar minuciosamente los eventos ocurridos en la columna cromatográfica. Estas fracciones
fueron cargadas en un gel y sometidas a un proceso de electroforesis.

La visualización del gel reveló que no fue posible obtener albúmina sérica bovina (BSA) en estado
puro. Este resultado se atribuye a la preferencia de la lisozima por un camino específico, lo que
resultó en su coelución junto con la BSA. No obstante, se pudo constatar que algunas fracciones
contenían lisozima en estado puro, correspondiendo al último pico identificado en el
cromatograma.

En la fase final del análisis, se llevó a cabo la mezcla de las fracciones puras que albergaban la
misma proteína. Específicamente, se realizaron cuatro mezclas distintas: fracciones previas al
primer pico, una mezcla de BSA y lisozima, lisozima en estado puro y fracciones posteriores al
segundo pico. Estas mezclas se concibieron con el propósito de cuantificar con precisión la
cantidad de proteína recuperada.

Para determinar las concentraciones de cada mezcla, se empleó el método de Lowry, donde
se leyeron las absorbancias y se utilizó una recta patrón como referencia. Cabe destacar que,
durante la generación de la recta patrón, se cometió un error en la concentración de 1 mg/mL,
lo que llevó a la exclusión de dicho dato para evitar distorsiones. Con la recta patrón corregida,
se lograron obtener las concentraciones de cada mezcla, arrojando un valor total de 6.17 mg
sobre una cantidad total de proteína de 4.04 mg. Este rendimiento inusualmente alto, del
153%, indica que a pesar de la desviación de la lisozima hacia un camino preferente, se logró
recuperar la totalidad de la proteína presente en la muestra suministrada.