UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

Etapas de la micropropagación vegetal

Dependencia: Facultad de agronomía

Alumno: Jesús Alfredo Oliva Martínez
Grupo: A7A
Materia: micropropagación
Docente: Alejandro Ibarra López

Fecha: 6 de noviembre de 2022

Fase 0 selección de plantas madre
La selección y preparación adecuada de los explantes afecta directamente su calidad y
su respuesta a dos problemas principales que afectan el establecimiento del cultivo, a
saber, la contaminación microbiana y la oxidación del explante. Los factores que afectan
la calidad del explante son: el tipo de órgano utilizado como explante, su ontogenia y
edad fisiológica, la época en que se recolectó el material vegetal, el tamaño y la salud
general de la planta donante. Las plantas donantes deben seleccionarse sobre la base
de una selección de calidad positiva para las características agronómicas deseables.
Una vez seleccionados los individuos, se debe determinar el tipo de explantes a
establecer en condiciones in vitro. En general, los órganos jóvenes o rejuvenecidos son
los que responden mejor en las instituciones que los obtenidos a partir de material adulto.
El uso de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede
resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el
establecimiento del cultivo in vitro. Es recomendable la recolección de explantes
primarios en campo durante la primavera o la época estival cuando la brotación de yemas
esta en su punto mas activo, ya que la utilización de yemas en el periodo de dormancia
puede ocasionar problemas graves de contaminación. A fin de lograr explantes de óptima
calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en
condiciones de invernáculo. De esta manera podemos incidir de manera directa sobre el
estado sanitario y la calidad que tienen los explantes mediante el control de la intensidad
de iluminación, temperatura y de los reguladores de crecimiento. Para especies
ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes
en condiciones de alta
temperatura (25ºC) y baja
humedad relativa (75%) a fin de
reducir la proliferación de
patógenos. Los procesos
morfogénicos de floración,
dormición y bulbificación pueden
ser controlados por el fotoperíodo
y la temperatura. Al controlar
estos factores podemos obtener
plantas donantes y explantes con
mayor homogeneidad todo el
año. Pueden aplicarse además
pretratamientos con reguladores
de crecimiento a las plantas
donantes, así como también a los
explantes mismos. En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la
inmersión de los explantes primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la
brotación de yemas.

Los factores que influyen sobre la calidad del explante son:

• El tipo de órgano que sirve como explante.

• La edad ontogenética y fisiológica del mismo. Los órganos jóvenes o bien
rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los
obtenidos de materiales adultos.
• La estación en la que se colecta el material. Se recomienda la recolección durante
la estación estival o primaveral, cuando existe una brotación activa de las yemas,
el uso de yemas en dormición ocasiona problemas de contaminación.
• El tamaño.
• El estado sanitario general de la planta donante. Es recomendable hacer crecer
las plantas donantes en invernaderos con el fin de controlar el estado sanitario.

Recomendaciones:
• Realizar riego frecuente, según la especie
y nunca regar sobre las plantas, esto con
el propósito de evitar la proliferación de
agentes patógenos como hongos, virus o
bacterias.
• Aplicación de medidas fitosanitarias como
uso de fungicidas, bactericidas entre otros
productos que prevengan daños por
agentes externos al vigor de la planta.
• Fertilización aplicar los fertilizantes adecuados en la dosis correcta para mantener
las plantas en el mejor estado posible, así mismo tener el crecimiento más rápido
posible de los órganos donadores, además de mantener plantas fuertes y
resistentes a enfermedades manteniendo el adecuado estado fisiológico de las
plantas.
• Realizar tratamientos de revigorización en las plantas para promover la juvenilidad
y acelerar el crecimiento de los órganos donadores del explante.
fase I establecimiento de los cultivos
el principal objetivo durante esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito
este arraigado a la calidad del explante que será usado. Los principales procesos a
controlar durante esta etapa son la selección, el aislamiento y la esterilización de los
explantes. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los
obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, ya sean yemas axilares o adventicias,
embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que
determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leñosas. En este
sentido, es importante señalar que el empleo de yemas adventicias (también llamadas
yemas formadas de novo) está asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de
variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagación basados en la
regeneración a partir de yemas axilares o embriones somáticos. La obtención de cultivos
axénicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos.
Una acción preventiva la constituye el empleo de métodos de verificación de patógenos
en los explantes. Esto puede realizarse mediante análisis específicos para las
enfermedades del cultivo, tales como DASELISA o PCR, análisis generales para
patógenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de
bacterias y hongos y métodos específicos para la detección e identificación de patógenos
intracelulares como virus, viroides y bacterias. La realización de estos análisis
directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas.
En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los síntomas más
marcados de la enfermedad, en segundo lugar, la carga de patógenos es mayor y por lo
tanto la precisión del sistema de detección aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas
pueden tratarse con técnicas adecuadas para la eliminación de patógenos como la
termoterapia, la quimioterapia a través de la aplicación de antibióticos, desinfectantes,
antivirales y el cultivo de meristemas. La desinfección superficial incluye varios pasos: el
lavado de los explantes con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto,
seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo)
con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetración y actividad.
Posteriormente, los explantes deben ser enjuagados al menos tres veces con agua
destilada estéril. Algunos patógenos permanecen latentes y se expresan cuando son
transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patógenos incluyen los
patógenos superficiales del material vegetal, los patógenos endógenos y los patógenos
propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 también pueden observarse infecciones
por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de
esterilización y por patógenos endógenos latentes dentro del sistema vascular, resultado
de una esterilización inefectiva de los explantes. Estos patógenos latentes podrían
manejarse mediante el empleo de bacteriostáticos o antibióticos en el medio de cultivo.
Desinfección
• Lavado del material con agua corriente, eliminación de las partes muertas e
infectadas de la planta. Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al
80% durante unos segundos.
• Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio o Ca con un agente
humectante durante 10-30 minutos.
• Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de hipoclorito de
sodio. El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele
realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos cada una.
Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal:
• Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
• Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min.
• Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

Contaminante
Cualquier microorganismo introducido accidentalmente en un cultivo o en un medio
de cultivo, el contaminante puede competir con las células que se cultivan, inhibir su
crecimiento o reemplazarlas por completo.
Principales causas de contaminación
Esterilización superficial inadecuada
Manipulación fallas en los procedimientos en laboratorio
Géneros de hongos más frecuentes:
• Aspergillus
• Candida
• Cladosporium
• Microsporium
Géneros de bacterias más frecuentes:
• Agrobacterium
• Bacillus
• Enterobacter
• Pseudomonas
• Lactobacillus
uso de fungicidas y antibióticos: en la planta madre, en el explante
en el medio de cultivo No se recomienda la adición de antibióticos al medio para
controlar la contaminación bacteriana porque no son efectivos en la mayoría de los
casos, aunque algunos autores señalan que su adición es necesaria cuando el
tejido tiene infecciones sistémicas / endógenas.
Oxidación fenólica Aspecto común que presentan los tejidos vegetales como
resultado de una herida. La oxidación por compuestos fenólicos suele manifestarse
por un oscurecimiento del tejido y generalmente precede a la inhibición del
crecimiento y, en los casos graves, a la necrosis y muerte del tejido.

Para evitar la oxidación se sugiere:

• Evitar o reducir los estreses que provocan
o estimulan la biosíntesis de compuestos
fenólicos
• Cuidar que las condiciones fitosanitarias y
fisiológicas de las plantas madres, origen
de los explantes, sean las adecuadas
• Reducir la agresividad de los métodos de
desinfección y aislamiento en la fase de
establecimiento de los cultivos.
• Usar sustancias como el carbón activado
(CA) o la polivinilpirrolidona (PVP)
Medio de cultivo y RCV
El medio mas utilizado es el musashige y skoog
Considerar el balance apropiado entrea auxinas y citocininas en el medio de cultivo
Amplio uso de la citocinina bencilaminopurina.
Fase II multiplicación
El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar el número de brotes para nuevos
ciclos reproductivos consecutivos (subcultivos) y de esta forma utilizar una parte de
estos en la siguiente etapa reproductiva (enraizamiento, brotación, etc.). Ambas vías,
la regeneración, la organogénesis y la embriogénesis, pueden ocurrir directa o
indirectamente. Este último implica la formación de callos. En general, la
organogénesis da como resultado la producción de brotes unipolares que se arraigan
en etapas sucesivas, mientras que la embriogénesis somática forma embriones
bipolares a través de etapas ontogénicas similares a la embriogénesis cigótica. Es
importante señalar que, independientemente de la ruta de regeneración utilizada, se
recomienda evitar la formación de callos para reducir el riesgo de variación clonal
somática. Los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas,
citocininas y ácido giberélico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crítico
sobre la multiplicación clonal de los explantes. La organogénesis puede darse por
inducción de yemas axilares o adventicias. La inducción de yemas axilares
comprende la multiplicación de yemas preformadas, usualmente sin formación de
callo. La inducción de yemas adventicias comprende la inducción de tejido
meristemático localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento,
conduciendo a la diferenciación del primordio y desarrollo del vástago, esto último
generalmente en ausencia del regulador de crecimiento que indujo la organogénesis.
La principal desventaja del primer método es que el número de yemas axilares por
explante limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un
aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de
yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que
ocurre en sitios distintos al de los meristemas. La embriogénesis somática es una vía
más conveniente porque permite saltar las etapas de formación de yemas y
enraizamiento, regenerando plantas en una forma mucho más rápida y eficiente. A
su vez, la disponibilidad de protocolos
para la obtención de embriones
somáticos es clave para la
automatización de la micropropagación
y la consecuente reducción de costos
para su implementación a escala
comercial. reguladores de crecimiento,
tanto del tipo de auxinas como de
citocininas.
Durante la etapa de multiplicación se
comprende generalmente de 2
periodos, la fase de inducción y la fase
de multiplicación propiamente dicha. La
primera implica, por lo general, el uso de
altas de concentraciones de
reguladores de crecimiento
(generalmente de auxinas más que
citocininas) para favorecer la
desdiferenciación. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal
adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular. En
este caso el sistema es más dependiente de reguladores del tipo de las citocininas.
En algunos casos, como ocurre en la formación de embriones somáticos, se requiere
de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduración y de germinación
respectivamente, cuya duración varía entre 1 a 2 semanas. Para la etapa de
maduración se adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basal en rangos de 5 a 20
μM, seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (ácido giberélico) en
concentraciones de 0,1-1 μM, cuyo fin es lograr la germinación de los embriones
obtenidos. Los tipos de auxinas más empleados son IBA, 2,4-D, AIA, ANA y picloram,
y las citocininas BA, CIN, ZEA, 2ip y TDZ. El rango de concentración empleado varía
con el regulador del crecimiento, así es que el 2,4-D, por ejemplo se utiliza en
concentraciones de 4-35 µM mientras que otra auxina como el IBA, tiene un rango de
0,1 a 2 µM.
Recomendaciones
• Uso adecuado de citoquininas acorde al cultivo utilizado para la generación de
nuevos brotes.
• En regeneración adventicia en muchos casos se forman callos incrementando
la probabilidad de variación somaclonal.
• Considerar la calidad de los subcultivos , eficiencia y la posibilidad de generar
variabilidad genética.

Fase III enraizamiento

En esta etapa se produce la formación de raíces
adventicias. En las especies herbáceas es
relativamente fácil mientras que en muchas
especies leñosas resulta más complicada por su
limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento
puede realizarse tanto en condiciones in vitro
como ex vitro. En el primer caso pueden
emplearse varios tipos de substratos y
reguladores de crecimiento (principalmente
auxinas) para promover la rizogénesis. El
ambiente gaseoso interno en los recipientes que
son utlizados en el cultivo mejoran el proceso de
la formacion de raices, esto debido a la mayor
disponibilidad de oxigeno en en este sistema
cerrado. Los sustratos incluyen: medio
solidificado con agar, perlita y/o vermiculita
humedecidas con medio nutritivo o agua. En un
medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de ½ a ¼ de la composición
original, y la sacarosa se reduce a una concentración final de 1-2%. Medios con baja
concentración salina, como el WPM (Lloyd & McCown, 1981) y GD (Gresshoff & Doy,
1972) incrementan el porcentaje de enraizamiento de vástagos axilares en plantas
 latifoliadas. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizogénesis.
Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecería al
producirse una rizogénesis más sincrónica como resultado del contacto íntimo de las
estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las raíces producidas por este método
son usualmente engrosadas y no poseen pelos radiculares. Adicionalmente, el
empleo de agar está asociado con la formación de callo en la base de las estacas,
que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre raíces
y vástagos.
Recomendaciones
• Uso de auxinas en concentraciones optimas, dado que un exceso puede
inducir la formacion de callo.
• Realizar enraizamiento ex vitro permite que el enraizamineto y la aclimatacion
se logren simultaniamente reduciendo el tiempo.
• Mantener en oscuridad las plantulas favorece la induccion de raices, asi como
una menor degradacion de auxinas.
• Tener cuidado con las raices producidas in vitro, pues estas pierden pelos
radiculares y la conexión vascular lo cual genera que no puedan desarrpññar
un cambiúm secundario.
Fase IV aclimatacion
Las plantas obtenidas in vitro se retiran de los recipientes de cultivo procurando no dañar
el sistema radical, si lo tienen formado. Se lavan con agua corriente eliminando el agar
adherido a las raíces, para evitar el ataque de hongos y bacterias.
Conviene realizar un tratamiento preventivo con una solución de 2-3 gL de fungicida
como Captosan (Condor, 8% carbendazima, 40% captan). El sustrato puede ser, por
ejemplo, una mezcla de tres partes de turba por una de vermiculita. Si el sistema
radical de la planta forma asociaciones con hongos (micorrizas) o bacterias, se debe
realizar la inoculación de los mismos.

Durante las primeras semanas de aclimatación, se debe evitar una excesiva pérdida de
agua por transpiración, bien colocando sobre cada plántula un frasco de cristal invertido,
o cultivándolas dentro de mini-invernaderos, túneles de plástico, o en invernaderos con
sistema de niebla.
Las plantas obtenidas mediante multiplicación in vitro difieren anatómica y
fisiológicamente de las plantas cultivadas en el campo o invernadero. Las condiciones
peculiares del cultivo in vitro sobre determinadas características de las plantas, que
posteriomente afectarán a su adaptación a condiciones ex vitro, son:

▪ Alta humedad relativa: las plantas poseen una cutícula poco desarrollada y
estomas no totalmente funcionales.
▪ Aportación de hidratos de carbono: las plantas tienen un metabolismo heterótrofo
y capacidad fotosintética reducida.
▪ Enraizamiento en el medio de cultivo: las raíces no desarrollan pelos absorbentes.
 ▪ Desarrollo en condiciones asépticas: las plantas carecen de asociaciones
simbióticas (p.e. micorrizas) y son poco resistentes al ataque de microorganismos.
▪
Algunos de estos problemas, como la escasez de pelos radicales, pueden paliarse en
ocasiones utilizando medios líquidos. La reducción de la concentración de agar y/o de
sales en el medio de cultivo puede favorecer también el enraizamiento y posterior
aclimatación a tierra de las plántulas. La transferencia a condiciones de cultivo ex
vitro debe ser, por lo tanto, gradual y habrá que adoptar siempre una serie de
precauciones destinadas principalmente a evitar la deshidratación de las plantas y a que
contraigan cualquier tipo de infección.

Recomendaciones
• Inducir correctamente la creación de una planta autótrofa que sea capaz de
sobrevivir por si misma.
• Realizar una esterilización adecuada de los sustratos a utilizar para prevenir la
aparición de hongos
• Uso optimo de luz y humedad en las plantas para evitar problema en su
desarrollo.
Bibliografía
George, E.F.; Hall, M.A.; De Klerk, G.-J. 2008 Micropropagation: Uses and methods. In:
Plant propagation by tissue culture, 3rd edition.
Gisbert, C. (2011).Establecimiento de cultivos in vitro a partir de semillas o de material
de campo. Polimedia ETSIAMN.
Miguel C, Marum L. (2011). An epigenetic view of plant cells cultured in vitro:
somaclonal variation and beyond. Journal of Experimental Botany.
Roca, W.M., D.I. Arias y R. Chávez. 1991. Métodos de conservación in vitro de
germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura.