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Infección letal de ratones humanos ACE2-transgénicos causados por el Publicado el 4 de enero de 2024.

coronavirus pangolino relacionado con el SARS-CoV-2

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Lai Wei, Shuiqing Liu, Shanshan Lu, Shengdong Luo, Xiaoping An, Huahao Fan, Weiwei Chen, impresión/guardado
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Erguang Li,Yigang Tong, Canción de Lihua
 Material complementario
doi: https://doi.org/10.1101/2024.01.03.574008
Este artículo es una preimpresión y no ha sido certificado por revisión por pares [¿qué significa esto?].
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Preimpresiones COVID-19 SARS-CoV-2
Abstracto Texto completo Información/Historial métrica Vista previa del PDF
de medRxiv y bioRxiv
Área temática
Abstracto
Microbiología
El coronavirus pangolino relacionado con el SARS-CoV-2 GX_P2V(short_3UTR) puede causar
una mortalidad del 100 % en ratones transgénicos con ACE2 humanos, potencialmente
Áreas temáticas
atribuible a una infección cerebral en etapa avanzada. Esto subraya el riesgo de contagio de
GX_P2V en los seres humanos y proporciona un modelo único para comprender los Todos los artículos
mecanismos patógenos de los virus relacionados con el SARS-CoV-2.
Comportamiento y cognición de los animales

Estimado editor Bioquímica

Bioingeniería
Dos coronavirus pangolinos relacionados con el SARS-CoV-2, GD/2019 y GX/2017, fueron
Bioinformática
identificados antes del brote de COVID-19 (1, 2). Los respectivos aislados, denominados
Biofísica
pCoV-GD01 y GX_P2V, se cultivaron en 2020 y 2017, respectivamente (2, 3). Se ha estudiado
Biología del cáncer
la infectividad y patogenicidad de estos aislados (4-6). El aislado de pCoV-GD01, que tiene
Biología Celular
una homología más alta con el SARS-CoV-2, puede infectar y causar enfermedades tanto en
Ensayos clínicos*
hámsters dorados como en ratones hACE2 (4). Por el contrario, si bien GX_P2V también
Biología del desarrollo
puede infectar a ambas especies, no parece causar enfermedades obvias en estos animales
Ecología
(5, 6). Anteriormente informamos que el aislado de GX_P2V pasado temprano era en realidad
Epidemiología*
un mutante adaptado al cultivo celular, llamado GX_P2V(short_3UTR), que posee una
Biología evolutiva
deleción de 104 nucleótidos en el 3'-UTR (6). En este estudio, clonamos a este mutante,
Genética
teniendo en cuenta la propensión de los coronavirus a someterse a una mutación adaptativa
Genómica
rápida en el cultivo celular, y evaluamos su patogenicidad en ratones hACE2. Descubrimos
Inmunología
que el clon de GX_P2V(short_3UTR) puede infectar ratones hACE2, con altas cargas virales
Microbiología
detectadas tanto en los tejidos pulmonares como en los cerebrales. Esta infección resultó en
Biología Molecular
un 100 % de mortalidad en los ratones hACE2. Sosupecamos que la causa de la muerte
Neurociencia
puede estar relacionada con la aparición de una infección cerebral tardía.
Paleontología

El mutante GX_P2V(short_3UTR), inicialmente aislado de los primeros pasajes de la muestra patología

de GX_P2V (6), y el propio virus GX_P2V, no se han estudiado en términos de sus mutaciones Farmacología y Toxicología

adaptativas en cultivos celulares. Para obtener un clon genéticamente homogéneo para fisiología

experimentos con animales, clonamos el mutante pasado a través de dos ensayos sucesivos Biología vegetal

de placa. Se eligieron ocho clones virales para la secuenciación de próxima generación Comunicación científica y educación

(Centro Nacional de Datos Genómica de China, GSA: CRA014225). Estos clones, en Biología sintética

comparación con el genoma del mutante original (6), todos compartían cuatro mutaciones Biología de sistemas

idénticas: ORF1ab_D6889G, S_T730I, S_K807N y E_A22D (Información de apoyo, Tabla S1). zoología

El clon 7, llamado GX_P2V C7, fue seleccionado al azar para la evaluación de la

patogenicidad viral en ratones hACE2 (Figura 1A). El modelo de ratón hACE2 que expresa
ACE2 humano bajo el control del promotor de CAG fue desarrollado utilizando tecnología de
integración aleatoria por Beijing SpePharm Biotechnology Company.
* Las categorías de asignaturas de Ensayos Clínicos y Epidemiología ahora están
cerradas a nuevas presentaciones tras la finalización del proyecto piloto de
investigación clínica de bioRxiv y el lanzamiento del servidor dedicado a las
ciencias de la salud medRxiv (submit.medrxiv.org). Los nuevos documentos que
informan sobre los resultados de los ensayos clínicos ahora deben enviarse a
medRxiv. La mayoría de los nuevos artículos de epidemiología también deben
enviarse a medRxiv, pero si un artículo no contiene información relacionada con la
salud, los autores pueden optar por enviarlo a otra categoría temática de bioRxiv
(por ejemplo, Genética o Microbiología).

Con el apoyo de Zuckerberg

Iniciativa©

Figura 1: Descargar figura | Abrir en una nueva pestaña

Caracterización de un modelo de infección letal en ratones humanos ACE2 transgénicos causado por el coronavirus de
pangolina relacionado con el SARS-CoV-2 atenuado GX_P2V C7.
A Mutaciones en GX_P2V C7 en comparación con el aislado de GX_P2V (short_3UTR) (número de acceso de la NCBI:
MW532698). Las cuatro mutaciones idénticas se muestran en negrita. B Supervivencia de ratones transgénicos hACE2 después
de una infección intranasal con GX_P2V C7 (n = 4), GX_P2V C7 inactivado (i-C7, n = 4) e infección simulada (n = 4). El número
de ratones fallecidos en cada día específico se anota a la izquierda de la curva de supervivencia. C Porcentaje de peso inicial de
ratones transgénicos hACE2 después de la infección intranasal con GX_P2V C7 (n = 4), i-C7 (n = 4) y infección simulada (n = 4).
Se muestra la significación estadística de las diferencias entre los ratones infectados por simulados (n = 4, puntos azules) y los
ratones infectados por GX_P2V C7 (n = 4, puntos rojos) o infectados por i-C7 (n = 4, puntos naranjas) a 6 o 7 ppp. Las barras de
error representan los medios ± SD. D Cuantificación de las copias del gen GX_P2V N en el corazón, el hígado, el bazo, el
pulmón, el riñón, la lengua, el intestino, el estómago, la tráquea, el cerebro, los ojos y los cornetes homogenados en los 3 y 6 días
posteriores a la infección (ipp) (n = 4 por grupo). El límite de detección (LOD) para las cargas de ARN viral en las muestras
originales fue Log10[102 copias/mg]. Las barras de error representan los medios de Log10[copias/mg] ± SD. Se muestran los
significados de las comparaciones en el pulmón, el cerebro y el cornete. E Los títulos virales infecciosos en los homogenados de
pulmón, cerebro, ojo y cornetados se midieron mediante un ensayo de formación de placa a 3 y 6 dpi (n = 4 por grupo). Se
muestra la significación estadística de las diferencias en el pulmón, el cerebro y el cornete. Las barras de error representan las
medias de Log10[pfu/mL] ± SD. La tinción F, G Hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción inmunohistoquímica (IHC) con un
anticuerpo anti-SARS-CoV-2 N específico (SARS-CoV-2) revelaron células virales positivas de antígeno (marrón) en el pulmón (F)
y el cerebro (G), como se muestra en un alto aumento en el recuadro. Barras de escala, 500 μm (F) y 1 mm (G),
respectivamente. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, P > 0,05, no significativo (ns); ANOVA bidireccional seguida
de la prueba de comparación múltiple de Sidak.

Inicialmente evaluamos si GX_P2V C7 podría causar enfermedad en ratones hACE2 mediante

el seguimiento del peso diario y los síntomas clínicos. Un total de cuatro ratones hACE2 de 6 a
8 semanas de edad se infectaron por vía intranasal con una dosis de 5×105 unidades
formadoras de placa (pfu) del virus. Se utilizaron como control cuatro ratones inoculados con
virus inactivado y cuatro ratones infectados por simulacros. Sorprendentemente, todos los
ratones que estaban infectados con el virus vivo sucumbieron a la infección dentro de los 7-8
días posteriores a la inoculación, lo que representa una tasa de mortalidad del 100 % (Figura
1B). Los ratones comenzaron a mostrar una disminución en el peso corporal a partir del día 5
después de la infección, alcanzando una disminución del 10% con respecto al peso inicial en
el día 6 (Figura 1C). Al séptimo día siguiente de la infección, los ratones mostraron síntomas
como piloerección, postura encorvada y movimientos lentos, y sus ojos se volvieron blancos.
Los criterios para la puntuación clínica de los ratones y las puntuaciones clínicas diarias
posteriores a la infección con GX_P2V C7 se proporcionan en la Información de Apoyo, Figura
S1.

Luego evaluamos el tropismo tisular de GX_P2V C7 en ratones hACE2. Utilizando el método

de infección descrito anteriormente, se infectaron ocho ratones con hACE2, ocho ratones
fueron inoculados con virus inactivado y se utilizaron otros ocho ratones infectados como
controles. Los órganos de cuatro ratones seleccionados al azar en cada grupo se
diseccionaron en los días 3 y 6 posteriores a la infección para el análisis cuantitativo del ARN
viral y el título. Detectamos cantidades significativas de ARN viral en el cerebro, el pulmón, el
cornete, el ojo y la tráquea de los ratones infectados por GX_P2V C7 (Figura 1D), mientras
que no se detectó una cantidad o una baja de ARN viral en otros órganos como el corazón, el
hígado, el bazo, los riñones, la lengua, el estómago y los intestinos. Específicamente, en las
muestras de pulmón, detectamos altas cargas de ARN viral en los días 3 y 6 posteriores a la
infección, sin una diferencia significativa entre estos dos puntos de tiempo (∼ 6,3 frente a ∼ 5,8
Log10 [copias/mg]). En las muestras cerebrales, en el día 3 posterior a la infección, se detectó
ARN viral en los cuatro ratones infectados, con un valor promedio de 5,4 Log10 [copias/mg].
En particular, para el día 6 después de la infección, detectamos cargas de ARN viral
excepcionalmente altas (∼ 8,5 Log10[copias/mg]) en las muestras cerebrales de los cuatro
ratones infectados (Figura 1D). En los días 3 y 6 posteriores a la infección, las cargas de ARN
viral en el cornete fueron similares, aproximadamente 4,1 y 3,9 Log10 [copias/mg],
respectivamente. Las cargas de ARN viral en la tráquea y los ojos de los ratones superaron el
límite de detección solo en el día 6 después de la infección, con valores de 2,6 y 3,8 Log10
[copias/mg], respectivamente. En cuanto a los títulos virales infecciosos, los tejidos
pulmonares en el día 3 después de la infección tenían un valor de ∼ 1,8 Log10[pfu/mg], que
disminuyó a ∼ 0,5 Log10[pfu/mg] en el día 6. Es importante destacar que los títulos infecciosos
más altos se detectaron en el cerebro el día 6, que fue significativamente mayor que el del día
3 (∼ 0,9 vs ∼ 4,8 Log10[pfu/mg]) (Figura 1E). Además, no hubo diferencias significativas en los
títulos infecciosos en el cornete entre el día 3 (∼ 0,9 Log10[pfu/mg]) y el día 6 (∼ 1,2
Log10[pfu/mg]) (Figura 1E). Para el día 6, se detectaron aproximadamente 2,0 Log10[pfu/mg]
en los ojos de dos ratones. Ni el GX_P2V C7 inactivado ni la infección simulada causaron la
muerte ni ningún síntoma clínico en los ratones (Figura 1B-C e Información de apoyo, Figura
S2). En resumen, en los ratones infectados con virus vivo, la carga viral en los pulmones
disminuyó significativamente en el día 6; tanto las cargas de ARN viral como los títulos virales
en las muestras cerebrales fueron relativamente bajas en el día 3, pero aumentaron
sustancialmente en el día 6. Este hallazgo sugirió que la infección cerebral grave durante las
últimas etapas de la infección puede ser la causa principal de muerte en estos ratones.

Para determinar los mecanismos subyacentes a la muerte inducida por GX_P2V C7 en

ratones hACE2, examinamos los cambios patológicos, la presencia de antígenos virales y los
perfiles de citocinas en los tejidos pulmonares y cerebrales de los ratones en los días 3 y 6
después de la infección (Figura 1F-G, e Información de apoyo, Figura S3 y S4). En ambos
días, en comparación con los de los ratones de control, los pulmones de los ratones infectados
no mostraron alteraciones patológicas significativas, con solo respuestas inflamatorias
menores debido a una ligera infiltración de granulocitos (Figura 1F). En el día 3 posterior a la
infección, las neuronas encogidas eran visibles en la corteza cerebral de los ratones. Para el
día 6, además de las neuronas encogidas, hubo infiltración linfocítica focal alrededor de los
vasos sanguíneos, aunque no se observó ninguna reacción inflamatoria visible (Figura 1G).
Tras la tinción de la proteína nucleocapsida viral a través de la inmunohistoquímica, se
detectaron antígenos virales tanto en los pulmones como en el cerebro en los días 3 y 6
después de la infección, con extensos antígenos virales notablemente presentes en el cerebro
en el día 6 (Figura 1F-G). Estos hallazgos se alinean con las evaluaciones de la carga de
ARN viral en los tejidos pulmonares y cerebrales (Figura 1D). También realizamos un ensayo
de citoquinas Luminex para detectar 31 citoquinas/quimioquinas en los tejidos pulmonares y
cerebrales de los ratones (Información de apoyo, Figura S3 y S4). De acuerdo con los
hallazgos patológicos, hubo ligeros aumentos o disminuciones en los niveles de muchas
citocinas/quimiocinas en los tejidos pulmonares y cerebrales en comparación con los de los
tejidos de control, pero los niveles de factores inflamatorios clave, como IFN-γ, IL-6, IL-1β y
TNF-α, no cambiaron significativamente. En resumen, estos análisis revelaron que la infección
por GX_P2V C7 en ratones hACE2 no condujo a reacciones inflamatorias graves, un hallazgo
que se alinea con los informes anteriores del grupo de Zhengli Shi que utiliza la infección por
GX_P2V en dos modelos diferentes de ratones hACE2 (5), así como con nuestros propios
hallazgos en el modelo de hámster dorado (6).

Hasta donde sabemos, este es el primer informe que muestra que un coronavirus pangolino
relacionado con el SARS-CoV-2 puede causar una mortalidad del 100 % en ratones hACE2, lo
que sugiere un riesgo de que GX_P2V se extienda a los seres humanos. Nuestros hallazgos
son evidentemente inconsistentes con los de Zhengli Shi et al. (5), que probaron la virulencia
de GX_P2V en dos modelos diferentes de ratón hACE2. Es importante tener en cuenta que no
aislamos la cepa de tipo salvaje GX_P2V. El estudio de Zhengli Shi et al probó la variante
GX_P2V(short_3UTR) que informamos. Sin embargo, los cambios evolutivos adaptativos de
esta variante durante su cultivo de laboratorio siguen siendo poco estudiados. De hecho,
según experimentos adicionales de infección, el GX_P2V no clonado (short_3UTR) también
resultó en una mortalidad del 100 % en ratones hACE2. Debido a la propensión de los
coronavirus a sufrir una mutación adaptativa durante el cultivo de paso, clonamos y
analizamos mutaciones en GX_P2V(short_3UTR), centrándonos específicamente en la
patogenicidad de las cepas clonadas. El mecanismo de alta patogenicidad de GX_P2V C7 en
ratones hACE2, en ausencia del control de tipo salvaje GX_P2V, requiere una investigación
más a fondo. En comparación con la secuencia original de GX_P2V(short_3UTR), GX_P2V C7
tiene dos mutaciones de aminoácidos en la proteína spike. Dada la estrecha relación entre la
virulencia del coronavirus y las mutaciones de la proteína de pico (7), es posible que GX_P2V
C7 haya sufrido una mutación que mejore la virulencia. Sin embargo, es importante tener en
cuenta que nuestro modelo de ratón hACE2 puede ser relativamente único. La compañía aún
no ha publicado un artículo sobre este modelo de ratón hACE2, pero nuestros resultados
sugieren que hACE2 puede estar muy expresado en el cerebro del ratón. Además, según los
datos proporcionados por la compañía, estos ratones hACE2 tienen una fisiología anormal,
como lo indica los niveles séricos de triglicéridos, colesterol y lipasa relativamente reducidos,
en comparación con los de los ratones C57BL/6J de tipo salvaje. En resumen, nuestro estudio
proporciona una perspectiva única sobre la patogenicidad de GX_P2V y ofrece un modelo
alternativo distinto para comprender los mecanismos patógenos de los coronavirus
relacionados con el SARS-CoV-2.

DECLARACIÓN DE ÉTICA

Todos los animales involucrados en este estudio fueron alojados y atendidos en unas
instalaciones acreditadas por la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación del
Cuidado de Animales de Laboratorio). El procedimiento para los experimentos con animales
(IACUC-2019-0027) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales
del Quinto Centro Médico, Hospital General del Ejército Popular Chino de Liberación, y
cumplió con las normas de la IACUC.

CONTRIBUCIONES DEL AUTOR

L.Song concibió y diseñó el estudio y escribió el manuscrito. L.W., S.Liu, S.Lu. y S.Luo.
realizaron los experimentos y analizaron los datos. X.A., H.F., W.C., E.L. y Y.T. analizaron los
datos y editaron el manuscrito. L.W. y L.Song escribieron el manuscrito y todos los autores
aprobaron el manuscrito.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no hay intereses en competencia.

INFORMACIÓN DE APOYO

La información de apoyo adicional para este artículo se puede encontrar en línea en

DISPONIBILIDAD DE DATOS

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y
en la Información de Apoyo, o del autor correspondiente a petición razonable.

Conocimientos

Este trabajo fue apoyado por el proyecto NSFC-MFST (China-Mongolia) (número de

subvención 32161143027), el Programa Nacional Clave de I+D de China (2021YFC2301804) y
el Programa Especial de Bioseguridad (No. 19SWAQ 13).

Referencias

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pangolines malayos (Manis javanica). Virus. 2019 Oct 24;11(11). Google Académico

2. ↵Lam TT, Jia N, Zhang YW, Shum MH, Jiang JF, Zhu HC, et al. Identificación de coronavirus relacionados con el SARS-
CoV-2 en pangolinos malayos. Naturaleza. 2020 Jul;583(7815):282-5. Google Académico

3. ↵Xiao K, Zhai J, Feng Y, Zhou N, Zhang X, Zou JJ, et al. Aislamiento del coronavirus relacionado con el SARS-CoV-2
de los pangolines malayos. Naturaleza. 2020 Jul;583(7815):286-9. PubMed Google Académico

4. ↵Huang XY, Chen Q, Sun MX, Zhou HY, Ye Q, Chen W, et al. Un coronavirus relacionado con el SARS-CoV-2 de
origen pangolin: infectividad, patogenicidad y protección cruzada por inmunidad preexistente. Discov. de la celda 2023 Jun
17;9(1):59. Google Académico

5. ↵Liu MQ, Lin HF, Li J, Chen Y, Luo Y, Zhang W, et al. Un virus relacionado con el SARS-CoV-2- del pangolín malayo
causa una infección pulmonar sin enfermedad grave en ratones humanos ACE2-transgénicos. J Virol. 2023 28 de
febrero;97(2):e0171922. Google Académico

6. ↵Lu S, Luo S, Liu C, Li M, An X, Li M, et al. Inducción de anticuerpos neutralizantes significativos contra el SARS-CoV-2
por una variante de coronavirus de pangolina altamente atenuada con una deleción de 104nt en el 3'-UTR. Los microbios
emergentes se infectan. 2023Dec;12(1):2151383. Google Académico

7. ↵Roberts A, Lamirande EW, Vogel L, Jackson JP, Paddock CD, Guarner J, et al. Modelos animales y vacunas para la
infección por SARS-CoV. Virus Res. 2008 Abr;133(1):20-32. CrossRef PubMed Web de la ciencia
Google Académico

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