GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CÓDIGO DE

CAMPO DOCUMENTO:
DCIV-GUI-2019-V1-008

CIENCIAS DE LA VIDA Y LA
DEPARTAMENTO: AGRICULTURA
CARRERA: ☒ Ing. Agropecuaria ☐ Ing. Biotecnología
PERIODO PREGRADO S-II
ASIGNATURA: SANIDAD ANIMAL NIVEL: 7mo
LECTIVO: NOV 23 - MAR 24
DOCENTE: Dr. Jorge Ron Román. PhD. NRC: 16044-16046-16050 PRÁCTICA N°: 19

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA MEJORAMIENTO GENÉTICO Y SANIDAD ANIMAL

TEMA DE LA
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE O MILK RING TEST (MRT) PARA DETECCIÓN DE BRUCELOSIS
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

La brucelosis es principalmente una enfermedad de las vacas lecheras que causa pérdidas económicas a los medios de vida de
muchos ganaderos de todo el mundo.

Para el diagnóstico de la brucelosis se utilizan varias pruebas de diagnóstico serológicas para todos los tipos de anticuerpos en
diferentes niveles detectables. Entre ellas está Milk ring test (MRT), descrita por primera vez en Alemania por Fleischhauer (1937),
se utiliza como prueba periódica de rutina para los rebaños libres de brucelosis y para identificar los rebaños infectados.

MILK RING TEST (MRT)

La prueba Milk Ring Test o del anillo en leche es una prueba indirecta, de aglutinación, empleada en el diagnóstico presuntivo de la
brucelosis bovina en rebaños lecheros.

 Se realiza en leche fresca de ganado lechero, pero no funciona con leche pasteurizada u homogeneizada.
 MRT, que detecta los anticuerpos IgM e IgA de IgM e IgA unidos a glóbulos de grasa, puede tener una amplia aceptación,
ya que es rentable, fácil de realizar y puede abarcar una gran población en poco tiempo.
 Se analiza una pequeña muestra de leche o crema fresca agrupada, de no más de 25 vacas, y el rebaño se clasifica solo
como sospechoso o negativo.
 La determinación final del estado de una manada sospechosa y de cada animal en ella se realiza mediante análisis de
sangre.
 La principal limitación de la prueba es el factor de dilución, que ocurre en grandes hatos lecheros donde se almacenan
grandes cantidades de leche en tanques a granel.
 Para ajustar este efecto de dilución, se utilizan volúmenes de muestra más grandes con el aumento del tamaño del rebaño.
Aunque se requiere 1 mL de leche a granel para rebaños con hasta 150 cabezas, se ha recomendado el uso de 2 mL para
rebaños entre 150 y 450 cabezas y 3 mL para rebaños con 450 a 700 cabezas.

La prueba del anillo en leche se aplica exitosamente en la vigilancia epidemiológica de áreas controladas y libres de infección, así
como para descubrir hatos o establos presuntamente infectados y para la tasa de de infección de una cuenca lechera.

Antígeno MRT
El antígeno MRT se prepara a partir de una suspensión celular concentrada y muerta de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus, cultivada
y resuspendido en una solución de tinción con hematoxilina.

Cuando se diluye en leche de un animal libre de brucelosis, el antígeno debe producir una coloración uniforme de la capa de leche
sin depósito y sin coloración de la capa de crema.
En los animales lactantes, MRT puede utilizarse para detectar la brucelosis en los rebaños. En rebaños grandes (>100 vacas
lactantes), la sensibilidad de la prueba se vuelve menos fiable. Pueden producirse reacciones falsas positivas en bovinos
recientemente vacunados (menos de 4 meses) o en muestras que contengan leche anormal, como el calostro o la debida a una
mastitis.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

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Figura 1. Prueba de anillo en leche

OBJETIVOS:
 Aplicar la prueba MRT para la detección de brucelosis en muestras de leche
MATERIALES:
INSUMOS:
REACTIVOS:  Tubos de 5 mL de vidrio
 Antígeno MRT  Gradilla
 Puntas para micropipeta de 100-1000 mL
EQUIPOS:
 Incubadora
 Micropipeta de 100-1000 mL
MUESTRA: Leche
INSTRUCCIONES:
Previo al inicio de la práctica usted deberá realizar las siguientes actividades:
1. Utilice mandil cerrado, cabello recogido, zapato cerrado
2. Lea completamente la guía de práctica
3. Verifique que disponga de todos los reactivos, insumos y equipos
4. Limpie su mesón de trabajo
5. Lávese las manos y colóquese los guantes
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
1. Las muestras se llevan a temperatura ambiente incluyendo el antígeno, una hora antes de la realización de la prueba.
2. Mezclar bien cada frasco que contiene la muestra; para lo cual se invierte varias veces, no violentamente, para re-suspender
la grasa (crema).
3. En una gradilla con tubos debidamente rotulados y considerando los controles respectivos, colocar 1 mL de muestra en cada
tubo.
4. Añadir 30 µL de antígeno para la prueba del anillo en leche a cada tubo y mezclar invirtiendo suavemente el tubo varias
veces logrando una distribución uniforme antígeno- leche.
5. Luego colocar la gradilla en la incubadora a 37°C por una hora y realizar la primera lectura a los 30 minutos y la lectura final
a los 60 minutos.

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Figura 2. Procedimiento de la prueba de anillo en leche

Nota: Si se van a examinar muestras de tanques a granel de grandes rebaños, el volumen de leche debe aumentarse a 3 mL.

RESULTADOS OBTENIDOS:

Los anticuerpos contenidos en la muestra, reaccionan con el antígeno coloreado de Brucella formando con él un complejo antígeno-
anticuerpo que se adhiere a los glóbulos de grasa de la leche que, por su menor densidad ascienden a la superficie del tubo formando
una capa de crema a manera de un anillo que se colorea de morado (hematoxilina del antígeno) que por su intensidad varían en
matices; desde un morado intenso (positivo) a un blanco cremoso (negativo), el cual es indicativo de que la muestra no contiene
aglutininas específicas por lo tanto el antígeno no aglutina permaneciendo la columna de leche uniformemente coloreada de lila.

Figura 3. Resultados MRT

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Tabla 1. Interpretación de resultados

Lectura Color del anillo y de la columna de leche
Anillo de crema color blanco
-
Columna de leche color lila y/o azulada
Anillo y columna de leche con la crema del mismo colo (morado o
+
azulino suave)
Anillo de crema el color (morado o azu) es más pronunciado que el
++
resto de la columna de leche
Anillo de crema de color morado o azul marcado, la columna de leche
+++
se obserba con algo de color
Anillo de crema morado o azul intenso, la columna de leche se
++++
observa con algo de color blanco

Una reacción fuertemente positiva se indica por la formación de un anillo azul oscuro sobre una columna de leche blanca. Cualquier
capa azul en la interfaz de la leche y la crema debe considerarse positiva, ya que podría ser significativa, especialmente en rebaños
grandes. La prueba se considera negativa si el color de la leche subyacente permanece homogéneamente disperso en la columna
de leche. Si la leche del fondo del tubo se blanquea gradualmente, el resultado se considera no concluyente y debe repetirse la
prueba.

CONCLUSIONES:
Se aplicó la prueba MRT para la detección de brucelosis en muestras de leche, la presencia de anillo color morado en la parte
superior de la muestra indica una muestra positiva, de lo contrario negativa para esta prueba.
RECOMENDACIONES:
 Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas o sometidas a agitación violenta.
 La muestra de leche entera puede ser almacenada durante al menos 24 horas a 4°C.
FIRMAS

Firmado electrónicamente por:

JORGE WASHINGTON Firmado electrónicamente por:
RON ROMAN JORGE WASHINGTON
RON ROMAN

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Jorge Ron-Román, PhD. Jackeline Torres, Mgt. Jorge Ron-Román, PhD.

Docente Coordinadora Área de Conocimiento Jefe de LMGSA

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