UNIDAD 2: REALIZACIÓN DE BLOQUES DE TEJIDOS.

1. FUNDAMENTOS Y PROCESO DE INCLUSIÓN DE MUESTRAS PARA

MICROSCOPÍA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA.
El objetivo del proceso de inclusión es la eliminación del agua tisular con la finalidad de
facilitar la entrada del medio de inclusión en la muestra. Este medio de inclusión proporcionará
consistencia y dureza sin modificar su estructura tisular, características favorables para que el
corte de la muestra sea óptimo. Un buen agente deshidratante debe minimizar las alteraciones
sufridas por el tejido al mismo tiempo que favorece la adición del agente endurecedor para
realizar el posterior corte de la muestra.
La inclusión se divide en 3 fases:
1. DESHIDRATACIÓN.
Consiste en un periodo de deshidratación paulatina en el que se sustituye el agua presente en la
muestra por un disolvente orgánico, compatible con la parafina. se sumerge la muestra en
sucesivos baños de disoluciones de etanol en agua a concentraciones crecientes, comenzando en
etanol 50º y finalizando en etanol absoluto. El protocolo puede variar según el tipo de muestra,
pero, en general, se emplean concentraciones intermedias de etanol 70º, 90º y 96º con un tiempo
de inmersión en cada disolución de entre 1 y 12 horas.
En aquellos casos en los que el proceso de deshidratación tuviese que ser interrumpido, por
ejemplo, por la llegada de una urgencia, es recomendable dejar la muestra en una disolución de
etanol 70º para su correcta preservación, independientemente de en qué concentración se haya
detenido el proceso. Posteriormente se reanudará la deshidratación desde esa concentración de
etanol 70º. El motivo del empleo de esta disolución intermedia de etanol es que si una muestra
permanece demasiado tiempo a elevadas concentraciones de etanol se endurece demasiado y, si
la concentración es baja, la muestra puede sufrir un deterioro estructural.
Las muestras que van a ser visualizadas mediante microscopía electrónica suelen ser
deshidratadas con acetona en lugar de con etanol, teniendo en cuenta que los tiempos de
exposición a las diferentes concentraciones de acetona serán menores, del orden de minutos.
Otros elementos deshidratantes son el isopropanol, el alcohol butílico o el dióxido de etileno.
Además de la deshidratación química con etanol, existen otros métodos físico-químicos como la
criosustitución o la criodesecación que combinan una ultracongelación inicial con una fase de
eliminación del agua congelada.

2. ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN.
Sustitución del líquido deshidratante por una sustancia intermediaria, habitualmente xileno,
miscible con el medio de inclusión final. Esta sustancia es imprescindible debido a que no se
podrían aplicar los medios de inclusión directamente sobre la muestra deshidratada porque éstos
no son miscibles con el etanol.
El tiempo de aclaramiento oscila entre 2-4 horas, pudiendo concluir esta fase con una inmersión
final en una disolución 1:1 de xileno y parafina para optimizar el resultado de la siguiente fase.
Existen otros tipos de líquidos intermediarios, como el benceno o el tolueno, pero su utilización
es menos frecuente bien porque generan artefactos en la muestra o bien por su elevada
toxicidad.
3. IMPREGNACIÓN O INFILTRACIÓN.
Consiste en el rellanado con medio de inclusión de todos los espacios intra y extracelulares que
inicialmente estaban ocupados por agua. El medio más empleado es la parafina, sustancia sólida
a temperatura ambiente que se licua a partir de los 50- 55ºC. El proceso de infiltración se
realizar sumergiendo la muestra en tres baños sucesivos de parafina en una estufa a 60ºC
durante una hora en cada baño.
Además de la parafina, existen otros medios de inclusión como la celoidina o la gelatina. Por
ejemplo, la principal ventaja de la gelatina es que es soluble en agua, por lo que no es necesario
realizar la deshidratación y, simplemente, habría que eliminar los restos de líquido fijador.
Además, como posee un punto de fusión menor que la parafina, las muestras no se deterioran
tanto por el efecto de la temperatura.

Se han desarrollado técnicas específicas de

inclusión para microscopía electrónica que
permiten embeber las muestras en resinas tipo
epoxi. Estas resinas otorgan una gran dureza y
consistencia al tejido, permitiendo la realización
de cortes inferiores a una micra de grosor. El
protocolo general es similar al realizado en la
parafina, con la única diferencia del empleo de
óxido de propileno como líquido intermediario.
Una vez definido el protocolo de inclusión, se
debe seleccionar el tipo de agente infiltrante en
función del tipo de muestra que se desea procesar.
Así, en general, emplearemos parafina para
cualquier tipo de muestra, incluido el tejido óseo.
En algunos casos, como, por ejemplo, en la
visualización de lípidos o tejidos muy acuosos,
como el ojo, se utiliza gelatina, mientras que la
celoidina se suele usar en tejido conjuntivo,
muscular y nervioso.
2. PREPARACIÓN Y CONFECCIÓN DE BLOQUES. ORIENTACIÓN DE LA
MUESTRA.
El siguiente paso del procesado, una vez finalizada la inclusión, consiste en la elaboración de
bloques sólidos que contienen la muestra a cortar. Estos bloques logran un manejo sencillo de la
muestra a la hora de realizar los cortes con el micrótomo sin que existan artefactos o fracturas
de la muestra a estudiar.
Los bloques se preparan con el mismo agente empleado en la infiltración y poseen una
determinada forma según el tipo de molde empleado para realizar dichos bloques. Los moldes
pueden ser metálicos, plásticos o de silicona y suelen tener unas dimensiones adecuadas para
que el bloque generado se adapte convenientemente a la porta bloques del micrótomo.
Para las muestras que van a ser observadas con microscopía óptica se emplean como medios de
inclusión celoidina y, sobre todo, parafina. Para la realización del bloque de parafina es
necesario disponer, como mínimo, de un dispensador de parafina y de una placa calefactora,
pudiendo emplear opcionalmente una placa refrigerada. La elaboración del bloque de parafina
se inicia con la colocación y orientación de la muestra en el centro de un molde, añadiendo
sobre ella parafina líquida hasta completar el volumen del molde.
A continuación, sobre la parafina aun caliente, se coloca una base de casete de inclusión en el
que está el código de identificación de la muestra. Una vez frio y solidificado el conjunto, se
desmolda y se obtiene un bloque de parafina que contiene en su interior la muestra en estudio.
Finalmente, se realiza un desbastado del bloque tallando con un bisturí el exceso de parafina de
los laterales de la muestra hasta conseguir una forma de pirámide truncada.
El proceso de confección de los bloques es aparentemente sencillo, sin embargo, hay que tener
presentes una serie de recomendaciones para elaborarlos correctamente. Así, respecto a la
orientación de la muestra, debe colocarse en el centro del molde de inclusión, teniendo en
cuenta que la cara de la muestra en contacto con el molde será la región que marcará los planos
de corte y la primera zona del bloque a ser cortada.
En el caso de estructuras tubulares, es recomendable colocarlas lo más perpendicular posible al
fondo del molde para conseguir secciones transversales a las paredes. El estudio de superficies
epiteliales obliga a colocar la muestra de modo que la sección obtenida muestre todas las capas
tisulares.
En cuanto a la solidificación del bloque, debe ser uniforme y no demasiado rápida, por lo que es
recomendable colocarlo inmediatamente en la placa refrigeradora (10 ºC) con cuidado de no
mover la muestra de la base del molde. Un descenso brusco de la temperatura, por ejemplo, al
introducir el molde directamente en el congelador, provocaría la aparición de fracturas tanto en
la parafina como en la propia muestra. En el caso de que la muestra contenga zonas con
diferente dureza, se debe orientar la región más blanda de la pieza hacia la base del molde.
En los laboratorios con más recursos, pueden encontrarse diferentes equipamientos que aceleran
o mejoran la elaboración de bloques de parafina. Por ejemplo, existen estaciones de inclusión en
las que se integran el dispensador de parafina, las placas calefactora y refrigerada y una zona de
trabajo. Estos dispositivos centralizan y organizan el proceso de elaboración de bloques, además
de facilitar la labor del técnico de laboratorio.
También se puede disponer de unos dispositivos para el etiquetado automático de casetes, los
cuales minimizan los errores en la identificación de las muestras procesadas debido al borrado
de la codificación que, en ausencia de estos dispositivos automáticos, se realiza habitualmente
con lápiz sobre el casete de plástico.
En el caso de muestras dirigidas a su visualización por microscopía electrónica, como las
secciones deben ser mucho más finas, es necesario que la dureza y consistencia del bloque sean
mayores. Aunque el agente de inclusión varía, no existen demasiadas variaciones en el
protocolo de elaboración de bloques con resinas respecto a lo realizado con la parafina.
La principal diferencia reside en el método de endurecimiento, que no se consigue por
enfriamiento, sino que es debido a un fenómeno de polimerización de la resina. Además, existe
la posibilidad de adicionar ciertos elementos plastificantes que regulen la dureza de la resina.
Las resinas epoxi son las más empleadas ya que logran una polimerización homogénea que
facilita la obtención de secciones regulares.

3. PREPARACIÓN, PROGRAMACIÓN, LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO

DE LOS EQUIPOS Y MATERIALES.
- Parafina: Elemento de origen ceroso que realizará la función de agente de inclusión. Se
puede encontrar en presentaciones comerciales tanto granulada como en grandes
bloques. Su principal característica es que su temperatura de fusión está en torno a los
55ºC, es decir, por encima de esa temperatura su estado es líquido.
- Casetes de inclusión: Cajas plásticas en las que se introduce la muestra a incluir para
que, siguiendo la codificación del casete.
- Molde de inclusión: Molde metálico, habitualmente con forma rectangular, el cual
otorga una forma adecuada al bloque de parafina para que se adapte al portabloques del
micrótomo.
- Placa calefactora: Se coloca debajo del dispensador de parafina y su finalidad es que la
parafina añadida al molde se mantenga en estado líquido hasta el acomodado y
orientación de la muestra y la posterior colocación del casete.
- Dispensador de parafina: Consiste en un depósito calefactado, que mantiene líquida la
parafina, y un dispensador que facilita el depósito del medio de inclusión sobre el
molde.
- Placa refrigeradora: Se emplea para la solidificación uniforme de los bloques.
- Material para el manejo de la muestra y del bloque: Se emplean pinzas para la
colocación de la muestra, bisturíes para el desbastado y un lápiz o punzón para escribir
la codificación de la muestra en el casete.
En los procesadores automáticos de inclusión, una vez seleccionadas las disoluciones que se
emplearán y cuántos baños se harán de cada una de ellas, en primer lugar, se debe confirmar que
todos los recipientes del equipo contienen un volumen suficiente para llevar a cavo la correcta
inclusión de las muestras y, en segundo lugar, habría que definir el programa de tiempos de
inmersión en cada recipiente.
La fase de infiltración constase de tres baños de parafina de 3 horas, se debería programar el
procesador con ese tiempo de inmersión en cada bote. El tiempo total oscilará entre las 12 y las
18 horas, según el tamaño y tipo de muestra, por lo que suele dejarse funcionando toda la noche
para que los bloques estén listos para ser cortados a la mañana siguiente.

La parafina es una sustancia que impregna fácilmente todo el entorno de trabajo debido a que
está en estado líquido en el momento de su uso y solidifica rápidamente a temperatura ambiente.
Cualquier resto de parafina aparecerá como un depósito ceroso blanquecino que puede ser
eliminado aplicando un disolvente orgánico miscible con la parafina.
La limpieza del material y del equipamiento es básica y debe realizarse de manera exhaustiva al
finalizar la jornada de trabajo para que todo el puesto de inclusión esté preparado para ser usado
en la siguiente jornada de trabajo. La limpieza de la parafina se lleva a cabo, inicialmente,
recogiendo los principales restos de parafina que pudiesen haber quedado en la zona de
inclusión y, posteriormente, lavando la superficie de los equipamientos y el material con un
disolvente orgánico como el xileno.
La puesta a punto del equipamiento empleado para la inclusión es simple y se basa en la
limpieza y en la comprobación de que no existan obturaciones en el dispensador de parafina. Si
las hubiese, se recomienda aproximar una llama de mechero para licuar la parafina sólida que
pueda estar bloqueando el conducto.

4. OTRAS TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ESTUDIO

HISTOCITOLÓGICO.
La estereología es una ciencia interdisciplinar empleada
en áreas tan dispares como la mineralogía, la medicina o
la metalurgia. Su principal objetivo es la extrapolación
estadística de características cualitativas y cuantitativas
tridimensionales a partir del análisis de una sección
plana. En el caso de la Anatomía Patológica esta técnica
permite obtener un modelo virtual tridimensional de un
tejido a partir del análisis de ciertas láminas
bidimensionales.
El análisis de imagen permite obtener información
cuantitativa a partir del estudio informático de las
imágenes. Es importante separar el concepto de análisis del de procesamiento o edición, ya que
los segundos implican modificación de la imagen, por ejemplo, para una mejor visualización,
mientras que el análisis conlleva generación de datos.

Imagen: Análisis de imagen. Micrografía confocal (izquierda). Cuantificación del contenido

nuclear (derecha). El programa informático identifica en amarillo el área ocupada por ácidos
nucleicos y generará una tabla en la que se mostrarán los valores numéricos para cada célula.

La autorradiografía se basa en detectar la emisión que generan

ciertos compuestos radioactivos administrados previamente al
paciente. Estos compuestos suelen ir conjugados a anticuerpos
específicamente diseñados para su unión con células cancerosas,
así, una señal radioactiva identificará la presencia de una célula
tumoral en el tejido.
El análisis de la acumulación de la radioactividad en los tejidos permite la creación de una
imagen virtual de la que se extrae información cuantitativa. Antiguamente se empleaban placas
fotográficas para el revelado de la radiación emitida, sin embargo, en la actualidad, el uso de
autorradiografía digitales se ha extendido, disminuyendo los riesgos asociados al revelado del
material radioactivo.
Comparación entre una autorradiografía (arriba) y una tinción histológica hematoxilina-eosina
(abajo). Las regiones densas de la autorradiografía indican acumulación de isótopos
radioactivos y, en consecuencia, presencia de células tumorales.
La microdisección de captura por láser, conocida como LCM por sus siglas en inglés. Esta
disciplina logra aislar de manera rápida y específica células individuales, poblaciones puras de
células patológicas o regiones predefinidas mediante un haz de luz láser. El material
seleccionado, una vez aislado y extraído, se emplea en análisis genéticos moleculares en los que
se podría confirmar, por ejemplo, la presencia de marcadores tumorales.

La microdisección por láser se lleva a cabo en un microscopio especial que posee un haz de luz
láser. Estos sistemas ópticos, gestionados por un programa informático, permiten que el
patólogo defina la célula o grupo de células que van a ser extraídas.