BlOMEDlCA

Vol. 2, No. 1 - 1982

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA

DIAGNOSTICO TOXOPLASMOSIS
CONEJOS DE BIOTERIO.
LUIS FERNANDO VALENCIA,' J U A N CARLOS RODRIGUEZ.**

Fue posible adaptar y utilizar la t6cnica de lnmunofluorescencia

Indirecta (IFII en el diagnóstico de toxoplasmosis cunícula. Se
estudiaron 72 sueros de conejos de Bioterio de la Universidad de
Caldas y 62 sueros de conejos de Bioterio del INAS, encontrándose
títulos de prevalencia de ACS que fluctuaron entre 1:16 y 1:1024
en el 70.87% de las poblaciones examinadas.

Se concluye que un alto porcentaje de los conejos estudiados ha

estado en contacto con el Toxoplasrna gondiiy que dicha infección
presumiblemente ocurrió al consumir alimentos (verduras, forrajes,
pastos y concentrados) contaminados con ooquistes de
Toxoplasma y l o por infección congénita.

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre

los resultados arrojados por la prueba de IFI en las poblaciones
estudiadas, a un nivel de significancia 0.01.

INTRODUCCION Con el fin de detectar. la infección toxo-

pl4smica en conejos d e los Bioterios d e l a
Los conejos de Bioterio constituyen una de Universidad de Caldas e Instituto Nacional
las bases para el ensayo de productos de Salud [INAS) s e adoptó y utilizó la técnica
biológicos, pruebas diagnósticas e investiga- de Inmunofluorescencia Indirecta [IFI) p a r a
ciones biomédicas; la calidad de estas medir los niveles de anticuerpos (ACS).
actividades v los avances oue se consigan en
las á r e a s dé la salud d e i e n d e n considera-
blemente de los animales empleados y de las MATERIALES Y METODOS
condiciones sanitarias que s e les pro-
diguen (1 ). Se estudiaron 72 conejos del bioterio de la
Universidad d e Caldas, nacidos y levantados
La toxoplasmosis e s una infección parasi- allí, y 62 del bioterio del INAS, a donde
taria, reconocida también dentro de la llegan procedentes de plantas d e producción
especie cunícula [12), capaz de causar cunícula.
grandes pérdidas en las explotaciones y d e
constituir a éstas como fuente d e infección Las muestras séricas s e obtuvieron
para las personas que consuman su carne mediante punción cardiaca, extrayendo 10
impropiamente preparada. m1 d e sangre a c a d a uno d e los conejos en

* E s t u d i a n t e s de P o s t ~ ü r u d oe n e n t r e n a m i e n t o . G r u p o d e M i c r o b i o l o g i a e I n r n u i i o l o g Í a . G r u p o d e para sito^
logia, Iiistituto Nacional d e Salud.

22
 INMUNOFLUORESCENCIA
estudio. Luego d e la retracción de los
coágulos s e separaron los sueros aséptica-
mente, se les adicionó azida de sodio (Merck]
en una proporción de 1 mg/ml y se procedió
a conservalos en congelación (-70%) hasta
el momento de efectuar la prueba.
Se utilizó un conjugado fluorescente anti-
inmunoglobulina G (aIgG) de conejo; p a r a su
elaboración se hizo necesario extraer la
fracción IgG del suero d e conejo por el
método del ácido octanoico (3) y purificarla
por cromatografía en columna con resina
aniónica DEAE-Sepharosa GLGB (Pharmacia
Fine Cbemicals]. El antisuero correspon-
diente (aIgG) s e ohtuvo realizando inocula-
ciones seriadas de IgG por vía intra-dérmica
a un caprino; s e efectuaron evaluaciones
periódicas de la respuesta inmunológica
mediante pruebas de doble inmuno-difusión
[DID] (Figura 1) y cuando s e alcanzó un título
de 1:32 s e procedió a fraccionar y purificar
la aIgG (Figura 2 ) . Posteriormente, se
conjugó con isotiocianato de fluoresceina
[ITCF Isómero 1 BBL), se tituló el conjugado
elaborado y se efectuaron pruebas de
especificidad.
Para la preparación del antígeno (Ag) se
empleó la cepa d e Toxoplasrna gondii del
Figura 1. Doble difu-
sión en Gel de Agaro-
sa (Ouchterlonyl. Al
confrontar suero nor-
mal de conejo a dilu-
ciones dobles de algG
de conejo en cabra, se
observa monoespecifi-
cidad y el titulo final
de trabajo (1 :32).
INDIRECTA ....
INAS pero modificando la metodología habi-
tualmente utilizada en su elaboración (41,
puesto que. en lugar d e efectuar inoculacio-
nes seriadas de exudado peritoneal con
Toxoplasma en ratones, se procedió a
inocular un conejo adulto, del cual, trans-
curridos siete días, s e extrajo el bazo y luego
de macerarlo en solución salina estéril, s e
inoculó intra-peritonealmente a un grupo de
ratones blancos-suizos con el fin de extraer
el exudado peritoneal dos días más tarde.
Los sueros control positivos s e obtuvieron
inoculando conejos por vía intradérmica e
intraperitoneal con Toxoplasrna vivo e
inactivado (5).
El montaje, lectura e interpretación de la
prueba de IFI se efectuó según lo descrito
por el Departamento de Educación y Salud
de los Estados Unidos (4); la lectura se
realizó en un microscopio de campo oscuro
Leitz Wetzlar Orthoplan, modelo 6829,
objetivo 40X y 100X.
P a r a el análisis estadístico de los resul-
tados s e aplicó la prueba normal p a r a la
diferencia d e proporciones, teniendo en
cuenta el tamaño de la muestra d e las
poblaciones en estudio (6).
 LUIS FERNANDO VALENCIA. J U A N CARLOS RODRIGUEZ

Figura 2. Estudio In-

Z . ... .: .
.., munoelectroforctico
.
; ,
. " t...
,c":,:*. ,
.,
,
. :c':,..:;
, ,
, '
J
de algG luego de l a
repurificación croma-
tográflca. Se observa
uiia baiida de prccipi-
tación nitida.

RESULTADOS

Los conejos inoculados con toxoplasma,

para conseguir sueros control positivo,
dieron títulos serológicos altos (1:16.264), - D 1nocu1ocUn 1 p
medios (1:1024 a 1:4096) y bajos ( 1 5 4 a dlucdn 1512
1:256), (Figuras 3 , 4 y 5 , respectivamente]. ~~~~~~

C InocuocY" I p
;
dilución 1 1 0 2 4
Los resultados arrojados por la prueba d e
IFI en las poblaciones estudiadas se en-
cuentran en la Tabla 1 y Figura 6.
-
t Momento de la muerte
Refuerro I p 1512

SEMANAS POST NOCULnCON

Figura 4
COMPORTAMIENTO SEROLOGICO OE CONEJOS INOCULADOS
INTRAPERITONEALMENTE CON DILUCIONES DE T O r O P L M A
TOXOPLASMOSIS EXPERIMENTAL

La modificación efectuada a la técnica de

obtención de Ag (4). dio como resultado
exudados peritoneal de ratón con un mayor
3EMAWAS -097 - , ~ O C " L ~ C ~ " ~
número d e trofozoitos por campo y .libres de
Figuro 3 células (Figura 7).
COUP~IP~YIENTC SEROWGICO a CONEJO in ~ w c u ~ ~ oo
INTR~-EI~MICAMLNTE aui roxo~iasua inacr>v~m
El conjugado fluorescente aIgG de conejo
TOXOPLASHOSIS EXPERIMENTAL presentó un título de 1:320 y mostró una
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ....

buena especificidad p a r a detectar ACS

anti-toxoplasma, observándose una fluores-
cencia nítida al confrontarlos con los sueros
control positivo [Figura 8) y l a no fluores-
cencia a sueros control negativos.
a p 2mi
B I p 3m1 DISCUSION
0
" t Momento de
-
a muerte Al realizar pases de exudado peritoneal
u
ui 128-
con Toxoplasmo entre ratones, son altas l a s
probabilidades d e aislar trofozoitos del pro-
0
A
t o z o a r i o ~acompañados d e células de natu-
raleza inflamatoria (7). Este fenómeno se
+
obvió mediante la inoculación de ratones con
-

se-
t macerado de bazo de coneio infectado
previamente con Toxoplosma gondii por vía
intra peritoneal.
,
,
, Paralelamente al logro de títulos seroló-
,-
2 - gicos positivos en conejos inoculados con
Toxoplosmo, s e pudo reproducir experimen-
Dl&S POST INOCULAClON
talmente la fase aguda d e la toxoplasmosis,
Figura 5 con algunas de las lesiones descritas por
COMWRTAMIENTO SEROLOOlCO DE CONEJOS INOCULAWS INTW- Manfredini a de peritoneo, bazo'
PERITONEALMENTE CON TOXOPLASMA PURO ToxopL~~MoSls intestino, hígado, ganglios y cerebro,
EXPERIMENTAL [Figuras 9 a 14).

T A B L A 1

Resultados de l a Evaluación Serológica p o r I F I para Toxoplasmosis de Conejos de B i o t e r i o en Uni-

versidad de Caldas e I n s t i t u t o Nacional de Salud.

Universidad de Caldas I n s t i t u t o Nacional de Salud T o t a l

Titulo Número de Número de Número de
Sueros % Sueros % Sueras %

NR* 27 37.5 12 19.35 39 29.10

1: 16 32 44.44 39 62.90 71 52.98

1: 64 11 15.27 11 17.74 22 16.41

1: 256 1 1.38 1 0.74

1:1024 1 1.38 1 0.74

T O T A L 72 100.00 62 100.00 134 100.00

* No Reactivo.
 LUIS FERNANDO VALENCIA. J U A N CARLOS RODRIGUEZ
Figuro 6
EVALUACION SEROLOGICA POR I F I
DE BlOTERlO EN
La interpretación de los títulos de preva-
lencia encontrados en el 70,87% d e los
sueros estudiados, que fluctuaron entre 1:16
y 1:1024, nos permite afirmar que los conejos
de los Bioterios de la Universidad d e Caldas
e INAS, han estado en contacto con
Toxoplosmo gondii.
Aunque se notó un 18.17% de mayor
prevalencia d e ACS anti-toxoplasma en los
conejos del Bioterio del INAS sobre los
Bioterios d e la Universidad de Caldas, esta
diferencia no fue significativa estadística-
mente a nivel del 1% según la prueba normal
para diferencia d e proporciones.
Sin embargo, s e trató de establecer la
razón d e esta diferencia, mediante una
evaluación serológica adicional a la explota-
m TOTAL SUEROS E S N D I A W S
0 BIOTERIO UNIV DE CALDAS
m BIOTERIO I N A S .
PARA TOXOPLASMOSIS DE CONEJOS
U. DE CALDAS E I.N.A.S.
ción cunícula que abastece al Bioterio del
INAS. Se analizaron 20 sueros pertenecien-
tes a conejos que s e encontrahan en la
explotación y 42 sueros de conejos salidos de
la explotación y que llevaban solo 1 5 días d e
permanencia en el Bioterio del INAS.
Los resultados como se observa en la
Figura 15, permiten deducir que los conejos,
en su gran mayoría, ingresan sin título
serológico a l Bioterio y lo adquieren dentro
del mismo al contaminarse con Toxoplosma.
La existencia de títulos de prevalencia d e
ACS en los Bioterios estudiados, se debe muy
probablemente al consumo d e alimentos
(verduras, forrajes, pastos, concentrados)
contaminados con ooquistes de Toxoplasmo
gondii.
 Figura 11. Dilatación muy marcada
de las asas del intestino grueso y
delgado. Toxoplasmosis experimen-
tal.

Figura 13. Quistes toxoplásmicos

en ganglio linfático 100X. Toxo-
plasmosis experimental.

Figura 14. Quiste toxoplásmico

en cerebro. 300X. Toxoplasmosis
experimental.
 Figura 7. Toxoplosrna gondii en
exudado peritoneal de ratón. Nótese
la abundante cantidad de trofozoitos.

Figura 8. Suero control positivo.

Prueba de lnmunofluorescencia In-
directa Positiva para Toxoplasmosis.

Figura 9. Absceso de peritoneo

parietal en pared posterior del ab-
domen. Toxoplasmosis experimental.

Figura 10. Lesiones granulomatosas

de color blanco-amarillento en la
cara externa del bazo. Toxoplasmo-
sis experimental.
 INMUNOFLUORESCENCIA
T I T U L O
- Figuro 15 A -
TITULO SIROLOG'CO DE CONEJOS DE
ABASTO EN L A EXPLOTACION ( 2 0 1
CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en el presente
estudio s e concluye:
1 . Se logró elaborar un conjugado fluorescen-
te aIgG d e conejo d e título 1:320, con buena
especificidad p a r a detectar anticuerpos
anti-Toxoplasma por medio de la prueba de
IFI.
2. Se obtuvo un alto número de trofozoitos d e
Toxoplasmo libres de células, inoculando
ratones con macerado de bazo de conejo
previamente infectado con Toxoplosma.
3. Se logró estimular la respuesta humoral
en conejos inoculados intraperitoneal e
intradérmicamente con Toxoplasma vivo e
inactivado.
INDIRECTA ....
TITULO
- Figura 15 B .
T I T U L O SEROLOGICO DE CONEJOS DE
ABASTD CON 15 DlAS DE PERMANENCIA
E N I.N.A.S. (42)
4. Experimentalmente s e reprodujo l a fase
aguda de la toxoplasmosis en conejos.
5.Los conejos de Bioterios de la Universidad
de Caldas e INAS han estado e n contacto con
el Toxoplasmo gondii según lo revela la
prevalencia de anticuerpos en un 70.87% d e
los conejos examinados, con títulos que e n s u
gran mayoría fluctúan entre 1:16 y 1:64.
6. La prevalencia d e anticuerpos anti-
toxoplasma en estas dos poblaciones,
presumiblemente se debe a l consumo d e
alimentos [verduras, forrajes. pastos,
concentrados] contaminados con ooquistes
de Toxoplasma y/o a infección congénita.
7. Las diferencias d e títulos d e prevalencia
entre las dos poblaciones, no son estadísti-
camente significativas a un nivel del 1 % .
 L U I S FERNANDO VALENCIA. J U A N CARLOS RODRIGUEZ
SUMMARY
It was possible to adopt a n d establish the
indirect immunofluorescence technique in
the diagnosis of rabbit-kind toxoplasmosis.
Seventy two (72) rabbitt's sera from the
University of Caldas Biotery and sixty two
(621 rabbitt's sera from the INAS Biotery
were studied. The findings showed preva-
lence titers of antibodies ranging betwen
1:16 and 1:1024 for the 70.87010 of the
population examined, which demostrated
that a high percentage of rabbitts under
study were in contact whith Toxoplasma
gondii and that such infection ocurred
through congenital infection.
No significant statistical differences were
fund amorg the results abtained from de IFI
test in the populations studied to a significant
leve1 of 0.01.
BlBLlOGRAFlA
1. ~ e l Jd. w h i t n e y R . ~ e d i c i n ay c i e n c i a d e los n a i m a i e r d e
l a b o r a t o r i o . Z o o n o l i s . 1 9 7 3 ; 15 1 4 1 : 2 6 1 .
2. M a n d r e d i n i L . R i c e i c h e i r f o l a g i c h e e s i e r o l o g i c h e su 5
focaii d i t o x o p l a r m o s i d e l coniglio. C l i n V e 1 1978;
101 l b 1 : 2 9 5 .
3. s t e i n b u c h M , ~ u d r a nR . he i s o l a f i o n o f I ~ Gf r a m
m a m m a l i n a sera w i t h the a i d a t c a p r y l i c a i i d . A r c h .
B i O c n e m . B i o p h y s . , 9 6 9 ; 134 : 2 7 9 .
d. us ~ e p a r t a m e n taf ~ e a ~ t ~hd u c a t i o n a n d welfare.
S e r o l o y o+ T o x o p l a r m D s i r . 1 7 6 ; 1 1 : 5.
5. s t r a n n e g a r d O . he f o r m a t i o n o t t o x o p i a r m a a n t i b o d i e s in
r a b b i t s . A c t . P a t h o l . M i c r o b . S c a n d . 1Pb7; 7 1 : 4 3 9 .
7. p a r r a , , v e r a n o L . ~ a b o r a c i b nd e u n a n t i g e n o n e r n o a g l u ~
t i n a n t e p a r a t o x o p ~ a r m o r i s y a p i c a c i d n en un e s t u d i a
ser016gi~0 en coneior. Terir Medicina Veterinario Y
Z o a t e c n i a . U n i v e r s i d a d N a c i o n a l . 1978; 8 2 p.