ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Guía de Laboratorio 2023.

PROFESORES: Ing. Gloria Valiente e Ing. Paola Fajardo

SET Nº 3
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 8

EFECTO DE TRATAMIENTOS TERMICOS SOBRE CARGA MICROBIANA EN ALIMENTOS

El uso de los diversos tratamientos térmicos, junto con otras tecnologías como la refrigeración,
facilita la existencia de productos sanos de larga vida comercial. El calor inactivo o destruye a los
patógenos. Por ello, conviene saber usarlo adecuadamente ya que una mala aplicación en el
ámbito doméstico o en el industrial puede provocar efectos contrarios a los deseados.

OBJETIVO
Comparar el efecto de dos tratamientos térmicos sobre la muestra de leche: congelación y
pasteurización con la muestra sin tratar.

Efecto del Calor sobre los Alimentos.

La aplicación del calor en los alimentos tiene varios objetivos:

a. Destruir agentes biológicos como bacterias, virus y parásitos con la finalidad de obtener
productos más sanos y conseguir productos que tengan una vida comercial más larga,
debido fundamentalmente a la eliminación o reducción de los microorganismos causantes
de la alteración de los alimentos;
b. Disminuir la actividad de otros factores que afectan a la calidad de los alimentos, como
determinadas enzimas (por ejemplo, las que producen el oscurecimiento de los vegetales
cuando éstos son cortados) y
c. Convertir a los alimentos en digestibles y otorgarles una temperatura y sabor agradable para
comerlos

El tratamiento térmico que precisa cada alimento depende de la naturaleza de cada producto.
Algunos sólo permiten ciertas temperaturas pues, de otro modo, provoca cambios en su aspecto
y su sabor. En otros, sin embargo, las altas temperaturas no producen alteraciones. De cualquier
forma, cuanto mayor es el tratamiento térmico, mayor número de gérmenes se destruyen, ya
que al someter a los microorganismos a una temperatura superior a la que crecen, se consigue
la coagulación de las proteínas y la inactivación de las enzimas necesarias para su normal
metabolismo. Por tanto, las temperaturas altas aplicadas en los alimentos actúan:

a. Impidiendo la multiplicación de los microorganismos,

b. Causando la muerte de las formas vegetativas de éstos o
c. Destruyendo las esporas formadas por ciertos microorganismos como mecanismo de
defensa frente a agresiones externas.

Lo que disminuye de la velocidad de las reacciones de descomposición. Las temperaturas

superiores a las de crecimiento óptimo producen inevitablemente la muerte del
microorganismo o le producen lesiones subletales. Las células lesionadas pueden permanecer
viables; pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesión haya sido reparada.
La velocidad de termodestrucción se ve afectada por factores intrínsecos (diferencia de
resistencia entre esporas y células vegetativas, localización intra o extracelular de las bacterias
patógenas), factores ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad,
temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actúan durante el tratamiento
térmico (pH, aw, tipo de alimento, sales, entre otros).

Cuanto mayor sea la cantidad de microorganismos que se encuentren en el alimento, más

tiempo se tardará en reducir el número de supervivientes a un valor determinado. Por eso, el
sistema de preparación de cada producto precisa de diferentes combinaciones de tiempo y
temperatura.

Tratamientos térmicos (Altas Temperaturas).

Los procesos tecnológicos utilizados para tratar a los alimentos por calor se han desarrollado y
perfeccionado, sobre todo, durante el siglo XX. Entre ellos podemos destacar:

a) Escaldado: tratamiento térmico suave que somete al producto durante un tiempo más o
menos corto, a una temperatura inferior a 100 grados. Se aplica antes del procesado para
destruir la actividad enzimática de frutas y verduras.

Se utiliza en la conservación de las hortalizas para fijar su color o disminuir su volumen, antes de
su congelación, con el fin de destruir enzimas que puedan deteriorarlas durante su
conservación. Esta manipulación no constituye un método de conservación, sino un tratamiento
aplicado en la manipulación de preparación de la materia prima. El escaldado reduce el número
de microorganismos contaminantes, principalmente mohos, levaduras y formas bacterianas
vegetativas de la superficie de los alimentos, y contribuye, por tanto, al efecto conservador de
operaciones posteriores.

b) Pasteurización: tratamiento relativamente suave (temperaturas normalmente inferiores a

100 grados), que se utiliza para prolongar la vida útil de los alimentos durante varios días, como
en el caso de la leche, o incluso meses (fruta embotellada).

Este método, que conserva los alimentos por inactivación de sus enzimas y por destrucción de
los microorganismos sensibles a altas temperaturas (bacterias no esporuladas, como levaduras y
mohos), provoca cambios mínimos tanto en el valor nutritivo como en las características
organolépticas del alimento.

La intensidad del tratamiento y el grado de prolongación de su vida útil se ven determinados

principalmente por el pH. El objetivo principal de la pasteurización aplicada a alimentos de baja
acidez (pH mayor a 4,5) es la destrucción de las bacterias patógenas, mientras que en los
alimentos de pH inferior a 4,5 persigue la destrucción de los microorganismos causantes de su
alteración y la inactivación de sus enzimas.

Aunque prolonga la vida comercial de los alimentos, la efectividad de la pasteurización es sólo

relativa, pues debe ir acompañada por otros métodos de conservación, como la refrigeración.
Los tiempos y temperaturas de tratamiento varían según el producto y la técnica de
pasteurización. Existe un método de temperatura alta y tiempo corto (HTST) (pasteurización
alta) en el que la temperatura es de 71,7 °C y el tiempo de 15 segundos; y otro de temperatura
baja y tiempo largo (LTLT): son 62,8 °C durante treinta minutos, de aplicación en la leche,
aunque pueden existir otros sistemas para derivados lácteos.
c) Esterilización: procedimiento más drástico, en el que se somete al alimento a temperaturas
de entre 115 y 127 °C. Para alcanzarlas, se utilizan autoclaves o esterilizadores. El proceso se
debe mantener un cierto tiempo (en algunos alimentos, hasta veinte minutos), y la temperatura
afecta al valor nutricional (se pueden perder algunas vitaminas) y organoléptico de ciertos
productos.

Al realizar un tratamiento esterilizante hay que tener en cuenta algunos factores, como el pH del
alimento y la termorresistencia de los microorganismos o los enzimas. De entre los
microorganismos patógenos esporulados eventualmente presentes en los alimentos de baja
acidez (pH mayor a 4,5), Clostridium botulinum es el más peligroso.

La esterilización UHT se basa en utilizar altas temperatura (135-150 ºC, durante 1 y 3 segundos).
Es cada vez más utilizado, ya que su repercusión sobre el valor nutricional y organoléptico de los
alimentos es menor que la esterilización convencional.
La esterilización se emplea en leche, zumos de frutas y concentrados, nata y otros muchos
productos a los que alarga su vida útil como mínimo tres meses, sin que para ello se requiera
refrigeración, pudiéndose prolongar entre dos a cinco años en función del tipo de alimento y el
tratamiento aplicado.
D) Cocción: Su función es convertir los alimentos en productos digestibles y dotarlos de una
temperatura y sabor agradable para consumirlos eliminando los posibles microorganismos. Sin
embargo, la cocción no sirve para conservar los alimentos y puede hacerlos incluso más
sensibles al crecimiento bacteriano puesto que permite aumentar las poblaciones de bacterias
patógenas, y la alteración y la producción de toxinas. La cocción puede destruir los
microorganismos sensibles a las altas temperaturas a la vez que permite que sobrevivan las
formas termorresistentes (que incluyen las esporas bacterianas), traduciéndose en una
selección.

Lo más difícil es lograr la cocción de las partes internas de los alimentos y conseguir que el
procedimiento sea letal para los agentes patógenos. Ello depende del espesor del alimento que
está siendo cocido, la temperatura del aceite o del agua y la duración de la cocción. Los métodos
de cocción más frecuentemente empleados son:

Horneo y Asado: Son esencialmente la misma operación, ya que en ambas se hace uso de aire
caliente para modificar las características de los alimentos. Sin embargo, la aplicación de uno u
otro término depende del proceso. Tiene un objetivo secundario, que es la conservación del
alimento por destrucción de su carga microbiana y por reducción de la actividad de agua en su
superficie debido a la deshidratación (es decir, la disminución de la disponibilidad de agua,
importante para el desarrollo de los microorganismos). No obstante, la vida útil de la mayor
parte de los alimentos sometidos a esta operación es corta si no se complementase mediante la
refrigeración o el envasado.

Fritura en Aceite: La cocción lenta puede ser eficaz para destruir microorganismos por los
efectos acumulativos de la exposición al binomio tiempo-temperatura. La fritura (tratamiento
por calor en aceite a temperaturas entre 180 y 250 ºC) es una operación destinada a modificar
las características organolépticas del alimento. Un objetivo secundario es el efecto conservador
que se obtiene por destrucción térmica de los microorganismos y enzimas presentes en el
alimento, y por la reducción de la actividad de agua en la superficie del mismo (o en toda su
masa, en los alimentos cortados en rodajas finas). Cuando un alimento se sumerge en aceite
caliente, su temperatura aumenta en la superficie y empieza a deshidratarse. Se forma una
corteza y el frente de evaporación va trasladándose hacia el interior del producto. La
temperatura en la superficie del alimento alcanza la del aceite caliente y la interna aumenta
lentamente.

Horno microonda: Es una forma de emisión de energía electromagnética que se transmite en

forma de ondas penetrando en el alimento y se convierte en calor. Estas ondas producen la
activación de las moléculas de agua que se mueven rápidamente en función de sus dipolos
magnéticos transmitiendo calor a los tejidos contiguos. El tiempo de calentamiento es menor
que en los métodos convencionales y no provoca cambios relevantes en la superficie de los
alimentos.

Durante la cocción con microondas, la distribución del calor es variable en los diferentes
productos y en el interior de un mismo producto. Así, tienen una escasa profundidad de
penetración en piezas grandes de alimentos. Además, la evaporación del agua en su superficie
tiene efecto refrigerante, siendo la causa de la supervivencia de microorganismos en las
superficies y sus proximidades.

Si bien existen ya una importante cantidad de estudios para determinar la repercusión

microbiológica del calentamiento en microondas, aún no existe claridad al respecto, aunque
prevalece la impresión de que la inactivación bacteriana va simplemente en función de la
relación tiempo- temperatura, al igual que en cualquier otro tratamiento térmico.

Tratamientos térmicos (BAJAS TEMPERATURAS)

Refrigeración.
Entendemos por refrigeración la conservación de alimentos a temperaturas entre 0 y 5 ºC. La
baja temperatura es, evidentemente, un factor limitante del crecimiento microbiano, sin
embargo, la mayoría de ellos (especialmente psicrófilos) rara vez mueren, sino que permanecen
en estado latente hasta que un alza de temperatura les permite volver a desarrollarse.
Cuando se enfría rápidamente un alimento muchas de las bacterias mesófilas que normalmente
resistirían la temperatura de refrigeración, mueren como consecuencia del «choque de frío».
Esto es más frecuente en Gramnegativas que en Grampositivas. El frío produce alteraciones
metabólicas en los microorganismos
A baja temperatura las rutas metabólicas de los microorganismos se ven alteradas, como
consecuencia de su adaptación al frío. Estos cambios metabólicos pueden dar lugar a que se
produzcan deterioros diferentes a los causados por los mismos microorganismos a diferentes
temperaturas.
En resumen, el deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos psicrófilos
porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los periodos de almacenamiento son
muy prolongados. Los microorganismos patógenos son, en su mayoría, mesófilos y no muestran
crecimiento apreciable, ni formación de toxinas, a temperaturas de refrigeración correctas.
Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede producirse un desarrollo
muy peligroso rápidamente.
Congelación.
El principio de la conservación de los alimentos por el sistema de congelación se basa en el
mismo principio que el de la refrigeración ya que cuanto más baja es la temperatura más nos
alejamos de las condiciones ideales en las que pueden multiplicarse los microorganismos, por lo
que el alimento se va a ir alterando cada vez menos.
La congelación consiste en la aplicación de temperaturas a los alimentos por debajo del punto
de congelación del agua (0º C), de forma que parte del agua del alimento se convierte en hielo.
Al mismo tiempo, como el agua se solidifica, se produce una desecación del alimento, lo que
contribuirá de forma significativa a una mejor conservación ya que existe una menor cantidad
de agua disponible para su crecimiento. Lógicamente, este efecto será más importante cuanto
más baja sea la temperatura.
Estas temperaturas pueden variar desde la que se obtiene en un congelador casero (en torno a -
2 a -18 ºC) y las conseguidas en sistemas de congelación más potentes que pueden llegar a -30 a
-80 ºC. La congelación detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores
(hongos, levaduras, helmintos) son más sensibles que las bacterias y mueren.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR:

El objetivo de la actividad, que es comparar el efecto de dos tratamientos térmicos sobre la

muestra de leche: congelación y pasteurización, y compararlas con la muestra sin tratar. Se
llevarán a cabo siembras en profundidad en placas Petri con agar nutritivo de tres diluciones
para cada una de las muestras.
a) Muestra leche sin tratar;
b) Muestra leche congelada;
c) Muestra leche hervida.

1.- Preparación de las Muestras:

Cada grupo recibirá una muestra de leche distribuida en dos recipientes:

• 1 tubo de ensayo con 10 mL de la muestra congelada
• 1 matraz Erlenmeyer con 50 mL de la misma muestra sin tratar

a) Descongelar en baño termo-regulado la muestra congelada, hacer diluciones y sembrar

b) Muestra no tratada: sólo hacer diluciones y sembrar.
c) Llevar a ebullición la muestra de leche restante, hacer diluciones y sembrar.
d) Incubar en estufa de cultivo a 37 ºC durante 48 horas.
e) Observar y contabilizar colonias de cada dilución y tipo de tratamiento aplicado a la
leche. Graficar los resultados.
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 9

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA (NMP), COLIFORMES TOTALES Y FECALES

La denominación genérica Coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen

ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de
contaminación del agua y los alimentos.

Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia
coli, descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor von Escherich en 1860, quien la bautizó
como bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego κολον, kolon, "intestino").

Hábitat del Grupo Coliforme

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en el intestino de
los humanos y de los animales de sangre caliente, pero también ampliamente distribuidas en la
naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y
animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en
el ambiente son de origen fecal.

El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:

➢ Escherichia
➢ Klebsiella
➢ Enterobacter
➢ Citrobacter
(No todos los autores incluyen al género Citrobacter dentro del grupo coLiforme).

Caracteres bioquímicos
El grupo coliforme agrupa a todas las bacterias entéricas, que se caracterizan por tener las
siguientes propiedades bioquímicas:

a. ser aerobias o anaerobias facultativas;

b. ser bacilos Gram negativos;
c. ser oxidasa negativos;
d. no ser esporogénos;
e. fermentar la lactosa a 35 ºC en 48 horas, produciendo ácido láctico y gas.

Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido dividido en dos grupos: Coliformes Totales
y Coliformes Fecales.

Como no todos los coliformes son de origen fecal, se hizo necesario desarrollar pruebas para
diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo
tanto, los coliformes totales—que comprende la totalidad del grupo— y los coliformes fecales —
aquellos de origen intestinal.
Desde el punto de vista de la salud pública esta diferenciación es importante puesto que
permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el agua es de
origen fecal.

Los Coliformes como Indicadores

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control
de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los
coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es
principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura.
Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más
coliformes se aíslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

Coliformes Fecales
Se define a aquellos que fermentan la lactosa a 44,5 – 45,5 °C, análisis que permite descartar a
Enterobacter, puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en
el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%) y algunas bacterias de los géneros
Klebsiella y Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad
de que el coliforme aislado sea E. coli. Los niveles recomendados de bacterias coliformes fecales
son:

• Agua Potable: menos de 0 colonias por 100 mL de la muestra de agua.

• Natación: menos de 200 colonias por 100 mL de la muestra de agua.
• Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 mL de la muestra de agua. (Norma Chilena
Oficial NCh 1333.Of. 78, mod. 1987. Instituto de Normalización INN – Chile).

Escherichia coli: El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de

contaminación de origen fecal, alrededor del 99%. No es absoluta porque se han aislado cepas
de Escherichia coli que no tienen origen fecal, pero es un grado de certeza es más que razonable
para certificar contaminación con ese origen.

Sin embargo, el aislamiento de este microorganismo no permite distinguir si la contaminación

proviene de excretas humanas o animales, (la Escherichia coli de origen animal y la de origen
humano son idénticas); lo cual puede ser importante, puesto que la contaminación que se desea
habitualmente controlar es la de origen humano. Esto no significa menospreciar la de origen
animal, especialmente dada la existencia de zoonosis enfermedades que son comunes al
hombre y animales, que también se pueden transmitir por el agua.

Coliformes e Higiene de Alimentos

En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminación fecal
sino solamente indicadores de calidad.

Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo,
helados, pastas frescas, fórmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno. Los
coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos.

Por último, la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales para el
desayuno, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.
Coliformes y Aguas Servidas
La prueba de coliformes totales y fecales también se utiliza para determinar la calidad
bacteriológica de los efluentes de los sistemas de tratamiento de aguas servidas.

La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro

de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición.
Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa
superficial del agua o en los sedimentos del fondo.

Método Número más Probable (NMP)

Principio:
Este método consiste en evaluar la capacidad que tienen los coliformes en producir gas. Al ser
incubados durante 48 hrs a 36 ºC a través de un ensayo de “Presunción” en Caldo Lauril Sulfato
Triptosa (LST), seguido por el de “Confirmación” en Caldo Bilis Verde Brillante Lactosa al 2%
(BVB) para coliformes totales y caldo EC incubado a 44,5 ºC para fecales.

Ensayo Presuntivo: consiste en preparar diluciones de la muestra 1/10, 1/100, 1/1000 (mínimo
3) en agua peptonada al 0,1%. Agregar 1 mL de cada dilución de la muestra a tubos con caldo
LST (que contiene campanas Durham invertidas,) utilizando 3 tubos por dilución. Incubar a 37 ºC
durante 24 a 48 hrs y observar formación de gas.

Ensayo Confirmativo para Coliformes Totales: confirmar todos los tubos LST que dieron
positivos, transfiriendo un inoculo con asa a otro tubo de fermentación, que contenga caldo
Verde Bilis Brillante al 2% (BVB). Incubar a 36 ºC por 48 hrs y observar si hay producción de gas.
La formación de gas confirma presencia de coliformes totales.

Ensayo Confirmativo para Coliformes Fecales: confirmar todos los tubos LST que dieron
positivos, transfiriendo un inoculo con asa a otro tubo de fermentación, que contenga caldo EC
previamente temperado a 44,5 ºC por un tiempo mínimo de 30 minutos. Incubar por 24 horas
en baño termo-regulado a 44,5 ºC y observar si hay formación de gas. Producción de gas indica
presencia de coliformes fecales.

Expresión de resultados:

Se debe anotar el número de tubos positivos por dilución, lo que permite obtener una cifra
compuesta por 3 dígitos. Se debe buscar esta combinación en la Tabla NMP y ver a qué valor
corresponde.

El resultado se expresa como: Número de coliformes totales / gr o mL de muestra o

Número de coliformes fecales / gr o mL de muestra

Si se consideran las diluciones 10, 1 y 0,1 mL, el resultado de la tabla se expresa como nº de
coliformes / 100 mL de muestra. En el caso de utilizar alícuotas más pequeñas, se debe
multiplicar por un factor de dilución.
EJEMPLO para coliformes totales y fecales
Diluciones 1/ 10 1/100 1/1000 NMP
(Presuntivo) + (1) - (0) + +- +- (3) 15
(Confirmativo + + - (2) + - - (1) - - - (0) 15
en BVB )
(Confirmativo en + - - (1) - - - (0) - - - (0) 4
EC)

Según Tabla NMP para combinación:

2 1 0 => 15 => NMP = 15 coliformes totales por 100 mL de muestra

1 0 0 => 4 => NMP = 4 coliformes fecales por 100 mL de muestra

ACTIVIDAD A DESARROLLAR:

I.- Prueba Presuntiva

• A cada grupo le será entregada una muestra de agua.

• Sembrar las muestras en tubos con LST con Campana de Durham, según la siguiente
distribución:
o 3 tubos con 10 mL de la muestra
o 3 tubos con 1 mL de la muestra
o 3 tubos con 0,1 mL de la muestra

• Agitar suavemente la gradilla.

• Incubar a 35º C por 24 a 48 horas.
• Observar la formación de gas en los tubos de fermentación a las 24 horas.
• Observar a las 48 horas y registrar el número de tubos positivos de cada dilución.

II.- Prueba Confirmativa para Coliformes Totales y Fecales

• Cada grupo recibirá tres tubos positivos (uno de cada dilución), de los cuales se harán
transferencias a tubos de fermentación que contienen caldo Bilis Verde Brillante (BVB) para
confirmar coliformes totales y otro a caldo EC para confirmar coliformes fecales.

o Coliformes Totales

• Mezcla por agitación suave cada tubo positivo de la prueba presuntiva y transferir un
inoculo con asa de argolla a tubos de fermentación con caldo BVB.
• Incubar lo tubos a 35º C durante 24 a 48 horas.
• Observar la formación de gas en los tubos de fermentación del caldo BVB: la presencia de
gas en los tubos de fermentación de caldo BVB significa un test confirmativo positivo para
coliformes totales, por el contrario, la ausencia de gas constituye un test negativo.
 o Coliformes Fecales

• Mezclar por agitación suave el tubo positivo de la prueba presuntiva y transferir con asas al
caldo EC temperatura a 44, 5º C por 30 minutos como mínimo.
• Incubar los tubos de caldo EC en baño termo-regulado a 44, 5º C por 24 horas.
• Observación de formación de gas en los tubos EC: la presencia de gas en los tubos de
fermentación de caldo EC significa una prueba positiva, la ausencia de gas constituye una
prueba negativa.

o Cálculo de Resultados

• Anotar para cada set la combinación de 3 dígitos que resulta al contar los tubos positivos
• Calcular según la tabla adjunta, el NMP que corresponde a coliformes totales y coliformes
fecal

TABLA DE NMP

No de tubos (+) por dilución NMP por gr o mL No de tubos (+) por dilución NMP por gr o mL
1/10 1/100 1/1000 1/10 1/100 1/1000

0 0 0 <3 2 0 0 9
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 > 1100