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Revista Internacional de
Ciencias Moleculares

Revisar

Terapia génica para la fibrosis quística: avances y

desafíos de la edición del genoma
Julia Maule1,2 , Daniele Arosio2y Anna Cereseto1,*
1 Departamento de Biología Integrativa Computacional Celular (CIBIO), Universidad de Trento, 38123 Trento, Italia;
giulia.maule@unitn.it
2 Consejo Nacional de Investigación, CNR, 38123 Trento, Italia; daniele.arosio@cnr.it
* Correspondencia: anna.cereseto@unitn.it

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Recibido: 7 de mayo de 2020; Aceptado: 28 de mayo de 2020; Publicado: 30 de mayo de 2020 ---

Abstracto:Desde los primeros días de su conceptualización y aplicación, la transferencia de genes humanos

prometía una solución permanente a las enfermedades genéticas, incluida la fibrosis quística (FQ). Este campo
atravesó períodos alternos de entusiasmo y desconfianza. El desarrollo de tecnologías refinadas que permiten la
modificación de sitios específicos con nucleasas programables revivió en gran medida el campo de la terapia génica.
Las nucleasas CRISPR y las tecnologías derivadas facilitan enormemente la manipulación del genoma y ofrecen
estrategias diversificadas para revertir mutaciones. Aquí analizamos el avance de la terapia génica, desde los ácidos
nucleicos terapéuticos hasta las técnicas de edición del genoma, diseñadas para revertir los defectos genéticos en la
FQ. Proporcionamos una hoja de ruta a través de tecnologías y estrategias adaptadas para corregir diferentes tipos
de mutaciones en el regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR)gen y sus aplicaciones para el desarrollo
de modelos experimentales valiosos para el avance de las terapias para la FQ.

Palabras clave:nucleasas programables; CRISPR-Cas; edición del genoma

1. Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el regulador
transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) gen.CFTRcodifica un canal de cloruro regulado por AMPc ubicado en la
membrana apical de las células epiteliales que cataliza el paso de pequeños iones a través de la membrana. La desregulación
de este mecanismo causa un deterioro de la homeostasis de la sal y los líquidos que resulta en disfunciones multiorgánicas y,
en última instancia, mortalidad por insuficiencia respiratoria. Durante más de siete décadas, las terapias para la FQ se
limitaron al tratamiento de los síntomas en lugar de abordar el origen de la enfermedad, la alteraciónCFTRgene. Las
mutaciones que causan la FQ están distribuidas a lo largo del 352CFTRgen, incluidas las regiones exónicas e intrónicas [1]. Los
potenciadores y correctores son moléculas pequeñas que se dirigen a la gran mayoría (90%) de las mutaciones que causan la
FQ y actúan mejorando el tráfico y el procesamiento del CFTR mutado producido. Sin embargo, el 10% de las variantes que
causan enfermedades no responden a ninguna terapia de molécula pequeña disponible. A diferencia de los moduladores de
CFTR que actúan sobre mutaciones seleccionadas, las intervenciones genéticas podrían, en principio, apuntar a cualquier
alteración en la base de la enfermedad y, lo que es más importante, proporcionar una solución permanente a la enfermedad.
De hecho, desde la primera conceptualización de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades genéticas por
Friedman y Roblin [2], las enfermedades monogénicas recesivas como la FQ son objetivos óptimos para la terapia mediante
complementación genética.
A pesar de que la FQ es una enfermedad multiorgánica, la mejora de las manifestaciones respiratorias mediante la
intervención genética en los pulmones podría dar como resultado una mejora significativa en la calidad de vida del paciente y
una disminución de la mortalidad. Poco después de la identificación y aislamiento del gen CFTR, reportado en tres artículos
consecutivos en 1989 [3–5], se intentó un número creciente de estrategias de terapia génica y ensayos clínicos para la FQ que
sacaron a la luz los principales desafíos de estos enfoques terapéuticos [6–8]. Las barreras naturales a la terapia génica están
representadas principalmente por mocos y respuestas inmunes a vectores virales.

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o herramientas de administración no virales y falta de objetivos celulares claramente definidos. Además, el epitelio de las vías
respiratorias se renueva constantemente, lo que impide la durabilidad de las células corregidas. Los métodos para la
administración de CFTR, ya sean virales o no virales, que se desarrollaron y probaron en ensayos clínicos y preclínicos, han
sido ampliamente tratados en la literatura; remitimos a los lectores a revisiones recientes sobre este tema [9–12]. En 1993 se
iniciaron ensayos clínicos en pacientes con FQ para probar la administración de una copia natural delCFTRgen en el epitelio de
las vías respiratorias nasales y bronquiales [13]. Se intentaron más de 20 ensayos clínicos sin lograr una cura efectiva; Sólo se
observaron beneficios clínicos limitados, incluida la estabilización de la función pulmonar en pacientes que recibieron al
menos nueve dosis deCFTRADNc entregado por liposomas catiónicos durante un período de 12 meses [14].

El reciente avance de la ingeniería genética en células vivas con el desarrollo de herramientas biotecnológicas
más eficaces renovó en gran medida el entusiasmo por la terapia génica, como lo demuestra el fuerte aumento de
artículos en publicaciones científicas y populares que exigen una inversión continua en este campo. La manipulación
del genoma siempre ha sido un procedimiento crucial en la investigación biológica y para el desarrollo de terapias
destinadas a la corrección genética endógena. Poco después del descubrimiento del ADN y su estructura, quedó claro
que un paso clave para modificar el genoma es la generación de roturas de doble hebra (DSB) del ADN en los sitios
objetivo.15,dieciséis]. Como resultado de la DSB, las células pueden responder con dos mecanismos diferentes de
reparación del ADN para prevenir la muerte celular: unión de extremos no homólogos (NHEJ) o reparación dirigida por
homología (HDR).17]. NHEJ genera inserción y eliminación de longitudes variables (indeles) que son difícilmente
predecibles incluso con las herramientas computacionales más recientes cuando son inducidas por nucleasas de
edición del genoma.18–20]. Esta vía de reparación se utiliza principalmente para desactivar o activar sitios genómicos
preferidos. En cambio, HDR permite introducir la edición deseada en la secuencia de destino. Las plantillas de
donantes específicas de HDR se introducen mediante recombinación en sitios que tienen suficiente homología de
secuencia.17]. Sin embargo, el HDR no se aprovecha ampliamente para manipular el genoma debido a la baja
frecuencia, un proceso eficiente en las células de mamíferos, que genera en el mejor de los casos una célula
modificada entre un millón.21,22].
Un punto de inflexión en la historia de la edición del genoma está representado por las meganucleasas de corte
raro (p. ej., I-SceI) y su uso para mejorar la sustitución de genes con secuencias de donantes.dieciséis,23], lo que lleva
a un HDR dirigido y aumentado en los sitios de escisión de la enzima. Los resultados de I-SceI desencadenaron la
búsqueda de nucleasas programables que inicialmente estaba dirigida a diseñar meganucleasas naturales en enzimas
que escindieran sitios alternativos.24]. Luego, el campo pasó a las enzimas artificiales, las nucleasas con dedos de zinc
(ZFN) y las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), que facilitaron en gran medida las
escisiones de nucleasas específicas.25,26] con el desarrollo exitoso de ZFN hacia la clínica experimental [27,28]; sin
embargo, la compleja y engorrosa ingeniería de proteínas detrás de la producción de estas herramientas limitó
gravemente su adquisición generalizada para uso en investigación o terapia génica. Estas limitaciones fueron
superadas por el posterior descubrimiento y desarrollo de las nucleasas CRISPR-Cas, herramientas biotecnológicas
derivadas de nucleasas naturales que se encuentran en las defensas inmunitarias de los microbios. Esta tecnología
impulsó literalmente el campo de la terapia génica, generando un fuerte aumento de estrategias novedosas para
revertir las aberraciones genéticas. La supremacía de CRISPR-Cas en la edición del genoma deriva de su simplicidad en
el diseño del objetivo, la alta especificidad obtenida con el desarrollo de variantes de alta fidelidad, la idoneidad para
el uso de multiplexación y el bajo costo.29–34]. Gracias a la versatilidad de los módulos de proteínas y de ARN guía
(ARNg), se desarrolló una variedad de herramientas derivadas de CRISPR que ampliaron las opciones de estrategias de
modificación del genoma. La fusión de Cas con dominios desaminasa permitió el desarrollo de editores de bases para
la modificación de nucleótidos individuales.35], mientras que la fusión con una transcriptasa inversa y un ARNg
extendido particular permitió la producción de edición primaria [36], como alternativa al HDR.
La edición del genoma ha entrado en la clínica para el tratamiento de enfermedades hematológicas y cáncer
mediante administración ex vivo y para la ceguera genética mediante administración in vivo a través de vectores
virales adenoasociados.37]. Los rápidos avances de la tecnología CRISPR y los alentadores resultados preclínicos y
clínicos sugieren un uso cada vez mayor de esta tecnología para el tratamiento, in vivo o ex vivo, de numerosas
enfermedades genéticas, incluida la FQ. Varios informes que demuestran la eficacia de la edición del genoma en una
amplia cantidad de modelos de FQ prometen su traducción a un uso clínico. Aquí nosotros
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revisar las estrategias de terapia génica desarrolladas para compensar o reparar la aberración en elCFTR locus
(esquematizado y resumido en la Figura1y mesa1). Proporcionamos una hoja de ruta a través de tratamientos con
ácidos nucleicos y manipulaciones del genoma adaptadas al tipo de mutaciones de la FQ y analizamos posibles
nuevas formas de corregir lasCFTRlugar.

Figura 1.Estrategias de terapia génica para restaurar la función CFTR en la FQ. Los genes CFTR que contienen cualquier mutación
que cause fibrosis quística están coloreados en naranja, los genes que llevan la secuencia correcta en azul. Las barras alargadas
indican los 27 exones distribuidos en toda la longitud (188702 pb) del gen CFTR. Las flechas rayadas hacia la derecha indican el
proceso de transcripción. En el panel central se representa una condición típica de un paciente con FQ; Hay un defecto genético
presente en cada alelo que impide la transcripción de una cantidad adecuada de moléculas de ARNm con la secuencia correcta. En
el panel de complementación genética, la flecha verde indica el promotor exógeno integrado aleatoriamente en el genoma celular
(líneas grises) y capaz de producir ARNm con la secuencia correcta (azul) en cantidad suficiente para restaurar la función CFTR.
Estrategias de edición del genoma capaces de corregir al menos una copia del gen CFTR en el locus endógeno. Representación
gráfica de las estrategias HITI y superexón: la corrección genética dirigida restablece específicamente la producción de moléculas
de ARNm correctas (siempre en azul). El NHEJ dirigido también es capaz de restablecer la producción de moléculas de ARNm
correctas para ciertos defectos de empalme gracias a pequeños cambios introducidos en regiones de intrones específicas. Los
tratamientos con ARN intervienen (flecha verde) durante el proceso de transcripción para rectificar la producción correcta de
moléculas de ARNm.

Tabla 1.Técnicas de edición del genoma aplicadas en modelos de FQ y principales limitaciones reportadas.

Método Defectos CFTR Modelo experimental Principales limitaciones

promotor no endógeno,
Complementación genética todo clínica experimental
posible pérdida de expresión

HDR todo células iPS, organoides baja eficiencia

HITI todo no reportado mediada por escisión de ADN
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Tabla 1.Cont.

Método Defectos CFTR Modelo experimental Principales limitaciones

mutaciones localizadas
superexón células epiteliales entrega del sistema
después de la integración

minigén, células epiteliales

Dirigido NHEJ empalme Fuera de objetivos
y organoides
Entrega in vivo y
editores básicos mutaciones puntuales organoides
baja eficiencia
Edición principal todo no reportado Entrega en vivo
Transcripción requiere continuo
empalme ratones
reguladores ASO administración
requiere continuo
Elegante todo modelos celulares
administración
requiere continuo
tratamientos de ARN todo ratones
administración

2. Complementación genética

La naturaleza monogénica y recesiva de la FQ hace de esta enfermedad un objetivo óptimo para las estrategias de
complementación genética.2]. La entrega de una copia salvaje delCFTREl ADNc representa un enfoque terapéutico atractivo
adecuado para cualquier tipo de mutaciones de la FQ.38]. Se han realizado varios estudios preclínicos y ensayos clínicos para
probar una variedad de herramientas de administración para restaurarCFTRexpresión en células diana [9–12]. Sin embargo, la
complementación genética no es necesariamente la mejor opción terapéutica. Primero, la expresión no fisiológica deCFTR
impulsado por un promotor no endógeno, más frecuentemente de origen viral. En segundo lugar, la pérdida de laCFTR
transgén generado por la naturaleza episomal de vectores virales o no virales comúnmente utilizados (adenovirus/virus
asociados a adenovirus o complejos lipídicos) o por el recambio del epitelio de las vías respiratorias. Una integración estable
de laCFTREl transgén se puede obtener a través de vectores retrovirales y potencialmente puede producir una expresión
continua dirigiéndose a las células estaminales en el epitelio de las vías respiratorias. Sin embargo, más allá de las dificultades
para alcanzar las células diana adecuadas en el epitelio, el uso de vectores retrovirales se ha visto limitado por la preocupación
suscitada por la mutagénesis por inserción ocasionalmente reportada en ensayos clínicos de terapia génica.39].

3. Integración dirigida

Con el reciente desarrollo de poderosas herramientas para manipular el genoma, se abren nuevas perspectivas
en la terapia génica para restaurar la expresión correcta de CFTR mediante la ingeniería delCFTRlocus que permite así
la expresión fisiológica del canal iónico. Las nucleasas programables ofrecen la oportunidad de apuntar con precisión
a la integración de secuencias de ADN en sus sitios de escisión.40,41]. Esto representa un verdadero avance en
relación con la integración convencional mediada por vectores retrovirales asociados con mutagénesis de inserción
ocasional, silenciamiento epigenético y niveles de expresión alterados impulsados por un promotor exógeno.39,42,
43]. La integración dirigida independiente de la homología (HITI) utiliza escisiones mediadas por CRISPR-Cas, tanto en
el ADN objetivo como en el entrante, para catalizar la integración de secuencias de ADN en sitios genómicos
específicos y en la orientación correcta.41]. La integración HITI no depende de la homología de secuencia, por lo que
es más eficiente que HDR aunque no produce sustitución del gen mutado. HITI se modeló como un enfoque potencial
para insertar una copia correcta deCFTRADNc dentro del locus endógeno a pesar de que aún no ha sido validado
experimentalmente.44]. Se logró un enfoque alternativo de integración selectiva mediante la inserción de unCFTR
superexón (exones 11-23) dirigido a través de ZFN el 5′final del exón 11 en elCFTRlocus en líneas celulares epiteliales.
Si bien esta estrategia podría potencialmente corregir todas las mutaciones localizadas después del exón 10, incluido
el F508del, la reversión fenotípica completa se obtuvo sólo después de la selección de antibióticos y en un pequeño
porcentaje de clones.45].
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4. Corrección genética mediante reparación dirigida por homología

La sustitución de genes es un procedimiento muy atractivo en terapia génica para reemplazar una secuencia
mutada con una copia correcta aprovechando la vía de reparación del ADN celular HDR. El HDR es muy poco frecuente
(1 de cada 106eventos [22]) y, por lo tanto, es difícilmente explotable en entornos experimentales y terapia génica.
Experimentos clave demostraron que una secuencia de ADN ectópica, el donante, que porta brazos de homología con
el sitio objetivo puede sustituir la secuencia endógena después de la rotura de la doble cadena del ADN en el sitio
objetivo.dieciséis,23]. El reemplazo de secuencia ocurre con una frecuencia significativamente mayor en sitios
específicos mediante el uso de nucleasas que inducen DSB.dieciséis,23]. Estas observaciones impulsaron la búsqueda
de nucleasas programables para escindir sitios específicos del genoma donde debería ocurrir la sustitución de
reparación. El avance tecnológico de la edición del genoma mejoró el HDR también en células que normalmente son
refractarias a las técnicas de reemplazo de genes [46]. Aunque esta estrategia de edición sigue siendo bastante
ineficiente, hasta ahora es la opción preferida para reparar mutaciones. La primera herramienta de edición diseñada
para apuntarCFTRera un ZFN [47] aplicado por el grupo de Harrison en 2012 en células derivadas de∆Pacientes F508
como prueba de concepto para la corrección del gen HDR [48]. Este enfoque se exploró más a fondo en células iPS
derivadas de pacientes que usaban ZFN [49], TALEN [50,51] o CRISPR-Cas9 [52].
CRISPR-Cas9 demostró ser válido para corregir∆F508 en modelos celulares avanzados, como organoides intestinales
derivados de pacientes, donde se podría restaurar la función del canal CFTR.53]. Para compensar la baja eficiencia de HDR en
estos estudios, se aplicaron marcadores de selección en la plantilla del donante, como la puromicina, para enriquecer y aislar
los clones corregidos. Para evitar la selección clonal para la detección y medición de las secuencias sustituidas mediante HDR,
se desarrolló una técnica de secuenciación sensible.54]. Sin embargo, el enriquecimiento celular in vitro no es compatible con
aplicaciones clínicas. Para mejorar la corrección genética, el grupo de Porteus explotó las propiedades intrínsecas del AAV que
favorecen el HDR cuando se utiliza para administrar la plantilla del donante.55]. Sin selección, del 30% al 40% de los alelos
mutados se repararon en células madre primarias de las vías respiratorias que mostraron una recuperación funcional del
canal CFTR. En este estudio, las células editadas se incluyeron en una membrana submucosa del intestino delgado porcino
(pSIS) epitelial porcina aprobada por la FDA, obteniendo una gran cantidad de células que expresan CFTR, potencialmente
utilizables para trasplantes en las vías respiratorias superiores de pacientes con FQ.56]. Estos son datos alentadores sobre la
naturaleza preservada de las células madre después de la edición del genoma, a pesar de la activación de p53 que se informa
que ocurre en las células madre hematopoyéticas después de DSB generadas por nucleasas programables.57]. La
electroporación es el método preferido para la administración ex vivo de CRISPR-Cas9, que permite la expresión transitoria de
la nucleasa y una actividad limitada fuera del objetivo.58]. Sin embargo, la electroporación no es compatible para su uso in
vivo, donde las herramientas virales o no virales siguen siendo un requisito indispensable, lo que insta al desarrollo de
sistemas de administración específicos para la FQ.59]. A pesar de los numerosos intentos de corregir los muy frecuentes∆
Eliminación de F508, la baja eficiencia de HDR impide su uso amplio y su traducción a cualquier uso clínico. El desarrollo de
estrategias moleculares que mejoren la HDR puede proporcionar en el futuro niveles suficientes de sustitución genética para
su avance hacia un uso terapéutico.60].

5. Corrección genética mediante unión de extremos no homólogos

Trabajos clínicos y preclínicos están probando nucleasas programables como herramientas de escisión de ADN para
inactivar genes implicados en enfermedades infecciosas.27,28] o en patologías genéticas negativas dominantes [61]. Además
de alterar el marco de lectura abierto, la escisión genómica CRISPR-Cas también se aplicó para restaurar funciones genéticas
como restablecer el marco de lectura abierto en el gen de la distrofina, mutado en la distrofia muscular de Duchenne.62–64],
o alteración de las regiones reguladoras de empalme para inducir la expresión del gen SMN2 en células mutadas de atrofia
muscular espinal (AME) [sesenta y cinco].
La escisión de secuencia mediada por CRISPR-Cas se utilizó con éxito en la FQ para reparar mutaciones de empalme, lo
que representa aproximadamente el 10% de los casos de FQ.66] donde la producción de transcripciones de ARNm aberrantes
altera la expresión de CFTR. Modelos valiosos para establecer estrategias de corrección genética para este tipo de mutaciones
son los modelos de minigenes que simulan los defectos de empalme.67–69]. Se utilizaron minigenes para demostrar que las
mutaciones 1811+1,6kbA>G, 3272-26A>G y 3849+10kbC>T ubicadas en los intrones después de su escisión con SpCas9 con
pares de gRNA revirtieron eficientemente el empalme alterado.68]. este experimento
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El diseño se mejoró aún más con AsCas12a para reparar la aberración de empalme 3272-26A>G y 3849+10kbC>T con
un solo ARNg, facilitando así la eficiencia y limitando el potencial de escisiones no específicas (fuera del objetivo) [69].
Tanto las células epiteliales primarias derivadas de pacientes como los organoides intestinales se repararon en las
mutaciones 3272-26A>G y 3849+10kbC>T con hasta un 90% de eficiencia y una recuperación de la función CFTR
cercana a niveles de tipo salvaje para ambas mutaciones [69].

6. Corrección de mutación puntual con editores base

La edición dependiente de DSB mediante nucleasas programables activa la vía de señalización de daños en el
ADN y puede provocar reordenamientos y translocaciones impredecibles.70,71]. Para evitar los posibles peligros de
DSB, se desarrolló una nueva clase de tecnologías derivadas de Cas. Los editores de bases CRISPR son herramientas
de edición del genoma que insertan una modificación de una sola base en la secuencia de ADN objetivo evitando la
formación de un DSB y sin el requisito de una plantilla donante.72]. Los editores de bases están compuestos por una
Cas nickasa fusionada a una enzima desaminasa, ya sea adenina o citosina desaminasas, que realizan la conversión de
bases de A a G o de C a T, respectivamente, permitiendo cuatro tipos de transición (A a G y C a T o G a A y T a C cuando
se dirigen a la hebra complementaria) [72–76]. Basados en los datos de que casi el 60% de las enfermedades
conocidas son causadas por una mutación puntual, los editores base CRISPR representan una poderosa herramienta
para estudiar y corregir estas variantes patogénicas.35]. La aplicación de los editores de bases está, en principio,
limitada exclusivamente por la presencia de un PAM compatible (la secuencia donde se une Cas antes de la
hibridación del ARN guía complejado) y un método de administración eficiente que es particularmente exigente
debido al gran tamaño de estas herramientas. . Si bien el método de entrega sigue siendo una preocupación, en
particular para aplicaciones in vivo, es muy probable que el límite de PAM sea superado por el avance continuo de
nuevas variantes diseñadas por Cas con muy pocos requisitos de PAM [77].
Esta tecnología fue aplicada en la FQ por el grupo Clevers para corregir mutaciones sin sentido en organoides derivados
de pacientes que portan las mutaciones R785X, W1282X o R553X. Los organoides seleccionados mostraron conversión de A a
G en las posiciones esperadas con una eficiencia notablemente mínima (no más del 8% para cualquiera de las tres mutaciones
probadas) [78]. Los editores de bases entregados como ARNm modificado químicamente se probaron in vitro para corregir la
mutación sin sentido CFTR más común, W1282X. Este estudio obtuvo una reversión eficiente de esta mutación puntual y
sugiere un nuevo método para ofrecer editores base [79].

7. Corrección genética presente y futura mediante edición principal

La edición principal es una tecnología basada en CRISPR compuesta por una nickasa Cas9 fusionada a una
transcriptasa inversa (RT) diseñada y complejada con un ARN guía de edición principal (pegRNA).36]. El pegRNA se
diferencia del gRNA normal porque lleva una secuencia que el módulo RT transcribe de forma inversa para producir
una plantilla de ADN donante. Según el diseño de pegRNA, el resultado de la edición primaria es una inserción, una
eliminación o una sustitución con un alto nivel de precisión. Por lo tanto, esta nueva tecnología potencialmente amplía
en gran medida la cantidad de mutaciones que causan enfermedades que pueden corregirse, incluida la FQ. Como se
sugiere en el artículo original, la edición principal se puede aplicar potencialmente para reparar la causa más común
de FQ, insertando tres nucleótidos en el gen mutado.∆Lugar F508 [36]. El complejo diseño de los ARN guía de edición
principal se simplificó recientemente mediante una herramienta computacional ad hoc [80].

8. Modulación del ARN en la FQ

Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se han explorado ampliamente para modular terapéuticamente la expresión génica
mediante la degradación del ARNm diana o mediante la modulación de elementos de empalme para la retención o la omisión de
exones.81]. Los ASO se aplicaron en modelos de FQ para apuntar a sitios de empalme donantes y aceptores aberrantes para la
restauración de eventos de empalme correctos y la producción de ARN maduro y proteína funcional.82–84].
Un uso alternativo de los ASO consistió en insertar las bases faltantes en 508 CFTR a nivel de transcritos
de ARN en un∆Modelo celular F508. Incluso si se midiera una reversión fenotípica, la corrección del ARNm no
representa una modificación estable y el mecanismo de corrección no se comprende completamente.85].
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En lugar de apuntarCFTR, se utilizaron ASO para bloquear el canal de sodio epitelial, ENaC, en modelos de ratones con
síntomas similares a los de la FQ [86]. El fundamento detrás de esta estrategia se deriva de la evidencia de que ENaC
contribuye a la alteración de la acumulación de moco de hidratación en la superficie de las vías respiratorias a través del
aumento de Na.+absorción [87]. De hecho, se informó que ENaC estaba hiperactivado en células que portaban una función
CFTR alterada.87]. El aerosol que administró ASO mejoró los síntomas similares a los de la FQ al restaurar el aclaramiento
mucociliar y la hidratación del líquido de la superficie de las vías respiratorias. Estos resultados sugieren que este es un
enfoque atractivo que puede usarse como monoterapia o en combinación con otras terapias para mejorar las condiciones de
la FQ.86].
La terapia ASO está limitada por la dependencia de por vida de tratamientos repetitivos y los efectos
adversos que aún deben abordarse.81].
Otro enfoque basado en ARN para restaurar las cantidades adecuadas de transcripciones de CFTR se probó con la
administración de una nanopartícula basada en lípidos de ARNm químicamente modificado en células epiteliales bronquiales
derivadas de pacientes, mostrando un aumento de CFTR localizado en la membrana.59]. La aplicación nasal del ARNm de CFTR en
ratones knockout para CFTR mostró una secreción adecuada de cloruro en los epitelios conductores de las vías respiratorias hasta dos
semanas después del tratamiento.59].
La técnica de trans-empalme mediada por Spliceosoma (SMaRT) se desarrolló para reparar el ARNm naciente
reemplazando parte del transcrito alterado con un ARNm exógeno correcto.88]. Se demostró que este enfoque es válido en
modelos celulares para restablecer las transcripciones correctas de las células mutadas.∆Lugar F508 [89–92].
La reversión fenotípica utilizando métodos que modulan el ARNm de CFTR mediante entrega o modificación utilizando
ASO o SMaRT ofrece la ventaja de prevenir la genotoxicidad potencial generada por la manipulación del genoma. Sin
embargo, las terapias basadas en ARN restauran transitoriamente la función de CFTR, pero están limitadas por requerir
tratamientos continuos de por vida.

9. Edición del genoma para el desarrollo de modelos de FQ

Los modelos experimentales que se asemejan al fenotipo, la patogénesis y los síntomas de la FQ son cruciales para la
configuración y evaluación de estrategias terapéuticas. Las herramientas de manipulación del genoma y los avances de la
tecnología CRISPR-Cas dieron un gran impulso al avance de las soluciones de terapia génica. Estas herramientas también son
fundamentales para avanzar en la terapia génica y el desarrollo de fármacos en general, al simplificar la producción de nuevos
modelos de FQ celulares y animales.93,94]. Las células derivadas de pacientes se utilizan a menudo para probar la eficacia de
un tratamiento para una mutación determinada. Sin embargo, considerando el elevado número deCFTRvariantes asociadas
con la FQ, es muy difícil cubrir todo el repertorio de mutaciones en modelos celulares homocigotos. Para superar esta
limitación, se crearon modelos isogénicos para diferentes mutaciones utilizando HDR mediado por CRISPR-Cas9 en células
epiteliales bronquiales inmortalizadas, proporcionando valiosas herramientas experimentales para el ensayo funcional CFTR.
95].
La tecnología CRISPR-Cas también se ha aplicado para generar nuevos modelos animales de FQ. Una
oveja noqueada fue generada por la interrupción delCFTRgen con NHEJ mediado por CRISPR-Cas9. CFTR-/-
Las ovejas desarrollaron una enfermedad grave similar a la FQ que incluye fibrosis pancreática, obstrucción
intestinal y ausencia de conductos deferentes.96]. Estudiar específicamente la patología provocada por las más
comunes. ∆Mutación F508, se generaron modelos de rata explotando la vía HDR activada por la escisión
CRISPR-Cas9 en correspondencia con la fenilalanina 508 del gen. La recombinación con el ADN del donante,
que contenía la deleción de tres nucleótidos, produjo un modelo de rata homocigótica para el∆F508. En
comparación con las ratas knockout, mostraron una actividad CFTR residual y, en consecuencia, un fenotipo de
FQ más leve.97].
Un ratón portador de la mutación sin sentido G542X en elCFTREl locus fue generado por nucleasas CRISPR
que muestran manifestaciones comunes de la FQ determinadas por la ausencia del canal iónico CFTR, como
obstrucción intestinal y crecimiento reducido.98].
En conclusión, la edición del genoma CRISPR es una tecnología muy prometedora para generar nuevas estrategias terapéuticas,
así como nuevas herramientas experimentales valiosas para probar terapias para una amplia variedad de mutaciones que causan FQ.
93].
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10. Conclusiones y direcciones futuras

Hemos presentado aquí tecnologías emergentes y estrategias derivadas como un camino a seguir desde la terapia
génica convencional basada en la administración de ácidos nucleicos terapéuticos hacia la corrección genética de CFTR
mutaciones. La edición del genoma está a la vanguardia no sólo por ofrecer novedosas soluciones terapéuticas sino también
por el desarrollo de modelos experimentales, celulares y animales, esenciales en la medicina traslacional. Aunque queda
mucho por hacer, en particular en términos de herramientas para la entrega in vivo de ácidos nucleicos y moléculas de
edición del genoma, los obstáculos y limitaciones parecen bien definidos y manejables.

Fondos:Este trabajo fue apoyado por la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (subvención FFC#3/2019) adoptada por las
fundaciones locales Associazione Trentina en Ricordo di Marco Menegus, Delegazioni Vercelli, Verona di Val d'Alpone, Olbia y
por Horizon 2020 UPGRADE (subvención # 825825) proyecto. La investigación de Daniele Arosio cuenta con el apoyo de la
Fondazione Cassa Rurale Trento Rovereto (ref. 2018.256).

Expresiones de gratitud:Los autores agradecen a Davide Aiello, Irene Carrozzo y Antonio Casini por la lectura crítica
del manuscrito.

Conflictos de interés:A.C. y G.M figuran como inventores en una solicitud de patente relacionada con este trabajo. A.C. es
cofundador y asesor científico de Alia Therapeutics. DA no declara intereses en competencia.

Referencias

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