Lucía Alba Ordóñez 3º GBTG

TEMA 1: BIOTECNOLOGÍA VEGETAL CLASICA

1. BIOTECNOLOGÍA VS MODERNA
La biotecnología vegetal clásica y moderna son complementarias y no excluyentes a pesar de
mostrar ciertas diferencias.

CLASICA MODERNA
Se conoce desde los albores de la humanidad. Se inicia con la aplicación de técnicas de ADN
Se inicia con el desarrollo de la agricultura recombinante. Comienza con la
(domesticación) a través de la selección manipulación del ADN.
artificial
Trabaja con genomas completos. Se cruzan Trabaja con genes aislados. Se aisla
organismos sexualmente compatibles prácticamente cualquier gen de cualquier
individuo e introducirlo en la variedad de
planta que queramos, obteniendo una nueva
variedad. Nos saltamos todas las barreras de
incompatibilidad sexual.
Generación de variabilidad genética a través Aumenta la variabilidad mediante la adición o
del cruzamiento y selección posterior. Se alteración de genes seleccionados a priori (se
seleccionan aquellos individuos que nos reduce la selección posterior). Es más fácil
interesan seleccionar.

Sigue siendo óptima para el manejo de Ofrece mejoras para caracteres que
caracteres que dependen de muchos genes dependen de uno o varios genes (Ej:
(Ej: Rendimiento, potencial). Sigue estando resistencia enfermedades, plagas…).
en uso.

Se cruzan organismos
sexualmente compatibles, donde
el nuevo individuo tendrá el 50%
de los genomas de cada parental.
En la progenie encontraremos
organismos con el gen de interés
o no.

Se aísla un gen de interés de

cualquier especie, se clona y se
introduce en el genoma de la
planta. La nueva variedad solo
contiene el gen de interés y nada
más del genoma de la otra
especie.

1.1. Percepción pública de la biotecnología moderna

Nadie cuestiona la BTV clásica: cómo se obtuvieron variedades de tulipanes, coliflores, etc. Por
otra parte la moderna es constantemente atacada y cuestionada. A pesar de todas las ventajas

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que posee la BTV moderna, la opinión pública la cuestiona completamente. El miedo a los
transgénicos por desconocimiento popular y por la presión que ejercen algunos lobbies
medioambientalistas ha llevado a la prohibición del cultivo de organismos genéticamente
modifcados en Europa. Con todo, sí es legal la compra de éstos a países cultivadores como EEUU,
Canadá o Argentina.

Entre las inquietudes que genera la biotecnología moderna se encuentran:

- La aprehensión instintiva hacia las nuevas tecnologías. Hay una inclinación natural a
tener desconfianza de las novedades.
- La desconfianza en las agencias reguladoras
- La dominancia de las corporaciones multinacionales. El negocio es un oligopolio
- La amenaza a la biodiversidad (porque no se cultivan otras variedades).
- La competencia con otros sistemas de producción agrícolas alternativos como los
huertos orgánicos.

1.2. ¿Qué es mas natural? Reflexiones

En términos históricos el hombre ha ido modificando el genoma de las plantas que se usan en la
agricultura por selección artifcial. Por ejemplo, en la naturaleza los cereales tienen espigas
dehiscentes (quebradizas) para poder esparcir mejor sus semillas. Esto es menos cómodo a la
hora de la recolección ya que hay que agacharse y rebuscar en el suelo. Sin embargo, a través de
la domesticación (cambios contra natura), las variedades cultivadas de cereales que contienen
mutaciones en los genes btr (brittle rachis) tienen espigas indehiscentes (tenaces) de modo que
la recolección del grano sea más sencilla.

En definitiva, el hombre ha alterado el genoma de las plantas a lo largo del tiempo, pero hoy en
día estas modificaciones se pueden hacer muy rápido con ingeniería genética. Lo importante es
la naturaleza de la alteración y no el método seguido para lograrla.

La modificación del gen, lo hace ser un gen no funcional, provocando así la espiga no
quebradiza 2
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2. MEJORA VEGETAL CLÁSICA

Es el conjunto de técnicas que hacen posible la modificación genética de distintas poblaciones
de plantas para obtener variedades que tengan las características deseadas.

Consiste en la introducción consciente de diversidad genética en las poblaciones (generalmente

por cruzamiento de los progenitores con características sobresalientes y complementarias) y en
la selección de las plantas con los genes que confieren los caracteres agronómicos deseados ( se
eligen los que mejoran la variedad), hasta alcanzar niveles altos de adaptación, uniformidad
genética y estabilidad agronómica.

2.1. Premisas para un programa de mejora.

Para programar una mejora hemos de tener en cuenta las siguientes premisas:

- Debe existir variabilidad o capacidad para crearla. Debemos tener variabilidad, de no ser
así, no puedo cruzar parentales interesantes, si no existe de forma natural tengo que
usar mutagénesis artificial.
- Debemos tener capacidad para detectar dicha variabilidad. Si no podemos detectar la
variabilidad es como si no existiera.
- Debemos tener capacidad para manipular dicha variación.

2.2. Objetivos de un programa de mejora.

Generalmente, los objetivos de un programa de mejora son:

- Aumentar rendimiento.
- Mejorar la calidad nutritiva y tecnológica de la planta (variedades fácilmente
cosechables, recolección más fácil).
- Resistencia a plagas y enfermedades.
- Resistencia a factores adversos (como suelo y clima).

2.3. Comparación procesos evolutivos vs mejora

La mejora vegetal clásica trata de imitar los procesos evolutivos naturales, pero dirigiéndolos a
un fin determinado.

MECANISMO EVOLUTIVO MÉTODO DE MEJORA

Selección natural: en la naturaleza existe una Selección artificial: se selecciona aquella variedad
presión natural, donde sobreviven los que nos interese por sus características.
mejores adaptados.
Mutación: se producen mutaciones Mutagénesis artificial.
naturales, la cual si favorece a la especie,
dominará.
Hibridación espontánea: el cruzamiento Cruzamiento artificial
natural
Poliploidía natural: Se defne como el Inducción de poliploides
fenómeno por el cual se originan células,
tejidos u organismos con tres o más juegos
completos de cromosomas de la misma o
distintas especies o con dos o más genomas
de especies distintas. (tetraploide,
hexaploide,etc)

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Mantenimiento de heterocigosis (variabilidad Utilización de la heterosis o vigor híbrido:

genética) obtención de híbridos comerciales a partir de
líneas puras poco relacionadas. Es decir. Se cruzan
2 especies puras (homocigóticas para todos sus
caracteres) no emparentadas y lo que se obtiene
son híbridos que superan las características de los
parentales.

3. TECNICAS DE MEJORA VEGETAL CLÁSICA

La técnicas básicas son: selección, cruzamiento artificial, mutación inducida, alteraciones
cromosómicas y cultivos in vitro.

3.1. Selección

La selección es cualquier fuerza capaz de modificar el número de descendientes y su

contribución génica a la generación descendiente. Puede ser natural cuando es realizado por la
naturaleza (evolución) o artificial cuando es realizada por el hombre (selección masal, selección
asistida por marcadores). En cualquier caso, cualquier tipo de selección, bien natural o artificial,
conduce a la pérdida de variabilidad genética, ya que se pierden las variedades que se dejan de
cultivar.

- La selección natural, en específico, es un proceso de mejora genética que la naturaleza

realiza a lo largo del tiempo.
- La selección artificial, consiste en elegir las variedades que más nos interesan.
o Selección masal: Consiste en seleccionar aquellos individuos dentro de una
población de plantas que tienen un fenotipo deseado. Luego, se recogen estas
semillas, se mezclan y estas se usan en la siguiente generación para sembrar el
cultivo. En la siguiente generación se hace lo mismo y así sucesivamente. De esta
forma, a lo largo de las generaciones acaban prevaleciendo aquellas plantas que
nos interesen.
Presenta inconvenientes como el estar muy vinculada a caracteres fácilmente
identificables desde el punto de vista fenotípico, para caracteres más difíciles se
hace imposible. La mejora del carácter está muy limitada, se llega a un punto en
el que de esta forma no se puede mejorar más la variedad y a la hora de
seleccionar también hay que tener en cuenta que puede tener material genético
de individuos que no nos interesen, hay tener en cuenta que esa planta se ha
podido fecundar con otra planta que tenía mazorcas pequeñas, aunque
escojamos el carácter deseado puede haber un background genético de otra
variedad no deseada que no conocemos.

Desplazamos la campana de Gauss hacia donde nos interesa. Queremos

desplazar la campana de forma que el numero de individuos con un tamaño
grande de frutos aumente.

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o La selección asistida por marcadores moleculares consiste en una

potente herramienta biotecnológica que permite a los mejoradores
seleccionar plantas con determinadas características de interés en
cualquier etapa de su desarrollo. Es una técnica más moderna y fina.

3.2. Cruzamiento artificial

Consiste en el apareamiento controlado entre dos organismos concretos. Solo se puede producir
entre individuos sexualmente compatibles, variedades de una misma especie o de especies
diferentes pero muy emparentadas.

Normalmente se toma la flor de un individuo (teniendo en cuenta que la mayoría de flores son
hermafroditas). La que se usa como femenina se le elimina las anteras para evitar la
autofecundación (a esto se le llama emascular).De otro individuo, que va a actuar como
equivalente masculino, vamos a coger polen con un pincel en orden de fecundar nuestra primera
flor. Habrá 50% de un genoma parental, y 50% del otro. No todos los individuos van a tener el
mismo 50%, habrá una mezcla.

Este proceso seguramente transfiere aquella característica deseada (resistencia a plagas), pero
también puede transferir rasgos no deseados (sabor amargo). Por eso cuando sólo queremos
introducir uno (o muy pocos) genes en una variedad determinada desde cualquier tipo de
material vegetal se habla de retrocruzamiento. Mediante esta técnica se eliminan los caracteres
residuales de nuestro cultivo.

Tenemos una variedad receptora o

recurrente ( R azul) y una donadora
( D rojo). Queremos pasar un
carácter de la donadora a la
receptora, pero ninguno más
porque la donadora tiene
características que no nos
interesan, solo nos interesa un gen
que es resistente a plagas, por
ejemplo.

Los individuos de la F1 van a tener un 50% del material genético del donador y un 50% del
material genético del receptor. Seleccionamos aquellos individuos que tengan el fenotipo de
resistencia a plagas y los cruzamos nuevamente (retrocruzamiento) con nuestra variedad
recurrente pura.

A los individuos obtenidos se les llama retrocruce 1 (RC1). Estos van a tener un 25% del material
genético del donador y un 75% del material genético del receptor. Hemos conseguido disminuir
la cantidad genética proveniente del donador al 25%. Ahora nos quedamos con los que

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presentan el carácter interesante y los volvemos a cruzar con el parental recurrente con la idea
de seguir disminuyendo el background genético del donador.

De los individuos de RC2 nos quedamos con los que presenten el carácter interesante y así de
nuevo. A lo largo de repetir esto vamos a conseguir una planta genéticamente muy parecida a la
variedad de partida recurrente, pero con el carácter del dador incorporado.

Nos podemos encontrar con dos situaciones diferentes:

Cuando el carácter del donador es dominante, la

selección de los individuos después de cada cruce
es fácil. Cuando hacemos el primer retrocruce
obtenemos plantas heterocigóticas, pero también
homocigóticas recesiva, solo nos interesarían los
Rr, heterocigóticos. ¿Qué se hace a partir del
último retrocruce? Siempre vamos a obtener
heterocigóticos y homocigóticos recesivo que no
nos interesan. No queremos hacer más
retrocruce, por lo tanto, autofecundamos Rr que
da lugar a RR, rr y Rr. y nos quedamos con RR
como nuestro individuo resultado. Nos quedamos
con RR, que no debe ser confundido con el
donador, solo contiene los dos alelos resistentes
de la donadora pero el resto del genoma es de la
recurrente.

Cuando el carácter del donador es recesivo la

selección de los individuos después de cada cruce
varía. Hemos de cruzar un parental recurrente RR
con un parental donador rr (contiene el gen). La
generación F1 va a ser Rr (no expresa el gen
recesivo pero lo posee).Debemos autofecundar
los Rr y seleccionamos los rr (sí expresa el gen
recesivo) para cruzarlo nuevamente con RR.
Repetimos el proceso varias veces hasta
conseguir nuestro individuo resultado: rr

3.3. Mutación inducida

La mutación inducida es una fuente de variabilidad que puede ser génica con alteración
permanente de la secuencia de ADN (espontáneas o inducidas, como consecuencia de la
exposición a agentes mutagénicos químicos o físicos (radiaciones X o UV) ) o cromosómicas
donde la mutación que afecta a un segmento cromosómico (poliploidías).

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Tiene la ventaja de que pueden ser generadas en todas las especies, pero las desventajas son la
pérdida de control, muchas son recesivas y no pueden detectarse en la F1, otras muchas son
indeseables y poseen una difícil selección.

• Etil Metano Sulfonato (EMS)

Es el agente mutagénico químico más usado en la

biotecnología vegetal, e induce la alquilación de la guanina
(introduce un grupo etilo en 6'-O) que ya no se aparea con la
citosina (ahora hace dos puentes de hidrógeno en vez de tres
y aparea con la timina) provocando una transición GC-AT. Esto
puede provocar la aparición de codones stop o cambio de
aminoácidos que afecten a la actividad de proteínas. Hay que
tener en cuenta que no es una mutación dirigida, si no que se
produce de forma aleatoria.

Pasos en la mutación con EMS:

1. Para trabajar con EMS mutagenizamos

semillas, en cuyo interior
encontraremos un embrión con su
respectivo meristemo apical del tallo y
de la raiz. Las células meristemáticas
que hayan mutado darán lugar a
estructuras mutantes.
2. Como todas las células meristemáticas
no han mutado de la misma manera o
no han mutado, nos vamos a encontrar
ante una generación M1 con plantas
quiméricas. Esta plantas cuentan con
estructuras mutagenizadas y otras no
mutagenizadas, por lo que son inviables
para realizar experimentos.
3. Lo que se hace es que se provoca la autofecundación y estas semillas obtenidas se
siembran y se obtiene una M2 donde las plantas pueden ser mutantes o no mutantes,
pero ya no son quimeras. En la M2 podemos por tanto estudiar la función de los genes
mutados y buscar fenotipos interesantes, mediante TILLING

• TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes)

El TILLING es una aplicación de la biología molecular que permite la detección directa de una
mutación en un gen especifico. En general, se emplean mutágenos químicos sobre un grupo
de individuos y posteriormente se buscan mutantes en genes de interés previamente
seleccionados con objeto de crear ventajas fenotípicas.

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Previamente hemos
mutagenizado semillas con
EMS, obtenido una
población M1 quimérica,
4 autofecundado y obtenido
1 2 3
una población no quimérica
M2. ( pasos 1,2,3).

Buscamos los individuos que

presenten una mutación en
un gen específico de su
genoma. Debido a la gran
6 5 cantidad de plantas,
extraemos ADN genómico de
todas los individuos y los
agrupamos en una matriz
(pooling) según grupos . Es
decir, en un pocillo hay ADN de muchos individuos diferentes. Luego diseñamos unos
primers (marcados con fluorocromos distintos) que amplifiquen de forma específica ese
fragmento de ADN en el que estamos interesados, y realizamos una PCR con una polimerasa
fiable. (paso 4)

Si en uno de los pocillos hay una planta mutada va a haber producto de PCR (amplicones)
silvestre (GC) y mutante (AT). En cualquier caso, están apareados entre ellos formando
homoduplex, todos los pares de bases están emparejados. (paso 5). Nosotros vamos a
buscar que se produzcan heterodúplex donde hay desapareamiento, porque si se producen
significará que en la población que estudiamos al menos uno es mutante.

Cogemos ese vial, desnaturalizamos con calor y los reanillamos con una bajada progresiva
de temperatura para que se unan las cadenas, de tal forma que obtendremos se van a formar
homodúplex AT/GC y heterodúplex AC/GT. Esto es indicativo de mutación en el gen de
interés. (paso 6)

El truco está en detectar la presencia de heterodúplex, si lo hacemos significará que en

nuestra población, dentro del pool al menos hay un individuo mutante. Por ello, finalmente
necesitamos aplicar métodos para la detección de estos híbridos (heteroduplex) mediante
una cromatografía por columna (D-HPLC) o mediante digestión con Cel-I, donde usamos
endonucleasas específicas de sitios desapareados.

Estudio de heteroduplex con Cel-I/gel

CelI es una endonucleasa específica que corta en sitios desapareados, en una sola cadena.

Si CelI corta en un sitio desapareado se forman fragmentos con florescencia azul y otro rojo,
debido a lo primers marcados con extremos 5’ fluorescentes. Si luego desnaturalizamos y
hacemos una electroforesis corriendo los fragmentos en un gel y visualizamos con los dos
fluorocromos, veremos fragmentos que se corresponden al tamaño total de la amplificación
y otro correspondiente a este sitio de corte. Elegimos fragmentos cuya suma en tamaño se
complementen y den lugar al tamaño total de fragmento.

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Sabemos que en el pull al menos hay un individuo que presenta una mutación en el
fragmento que estudiamos. Ahora hay que identificar cual de esas plantas es. Estudiamos
individuo a individuo, siguiendo el mismo procedimiento, pero en lugar de pull usar muestras
de plantas individuales. Aislando sus genomas y detectando heterodúplex de la misma
forma, con primers fluorescentes. Si es WT por mucho que desnaturalicemos y
renaturalicemos, solo habrá homodúplex: WT. Si es mutante tendremos también un
homodúplex ahora, solo que mutante. Cojo el genómico, le hago la PCR y el producto de la
PCR va a ser la amplificación mutante, con AT, pero esto no deja de ser un homodúplex. Por
mucho que desnaturalicemos y realineemos van a seguir saliendo homodúplex. Por ello es
importante el uso de un genoma control de una planta WT mezclada en el mismo tubo, para
hacer el estudio individual genoma de cada planta lo tengo que mezclar con genoma WT
porque sino no se pueden producir los heterodúplex luego.

Puede ocurrire un fallo: a veces corta en sitios no desapareados, induciendo a error con
falsos positivos. Si corta inespecíficamente en un sitio obtendríamos un fragmento pero no
veríamos el complementario en porque ya sería mala suerte que la CelI cortara
inespecíficamente ahí y en otra en el mismo sitio en la cadena de abajo. Si ha cortado por
error, solo corta en una cadena y no en la complementaria (es poco probable que corte por
error en el mismo sito)

EcoTILLING: es un método que utiliza técnicas de TILLING para buscar mutaciones naturales
en individuos, generalmente para análisis de genética de poblaciones.

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3.4. Alteraciones cromosómicas

Se trata de una fuete de variabilidad consistente en cambios en el número de cromosomas

(monoploides, autopoliploides (misma epescie) y alopoliploides(distinta especie), o cambios en
la estructura cromosómica (supresión, inversión y duplicación).

Obtención de monoploides a partir del cultivo de polen o anteras

Los granos de polen pueden usarse para crear embriones haploides y plantas monoploides
infértiles. Partiendo de una planta diploide (2n), cultivando las anteras o los granos de polen
directamente (productos meióticos), es posible inducir el crecimiento para obtener una planta
entera sin necesidad de pasar por la fecundación, obteniéndose plantas haploides (n).

Ahora con los monopolides podemos hacer mutagénesis, seleccionar el fenotipo deseado (da
igual que sea recesivo) y duplicar artifcialmente el número de cromosomas para obtener líneas
diploides puras del fenotipo deseado.

Obtención de poliploides utilizando colchicina

La colchicina es un agente químico que se añade a las yemas terminales meristemáticas de la

planta e inhibe la formación del huso mitótico, provoca el aumento en el número de ploidías
debido a que es un inhibidor del huso mitótico: no se produce la citocinesis, pero hay duplicación
del material genético.

Cuando la célula se va a dividir duplica el material genético y posteriormente se produce la

división celular. Si esto ocurre en presencia de colchicina, la célula entra en división, duplica su
material genético pero no se produce la división, de forma que obtenemos una célula que ha
duplicado su material genético. Se usa aplicándola a yemas terminales de plantas y ahí
aumentaran el número de haploidía, de forma que las ramas que salgan de ahí tendrán hojas y
frutos mas grandes y a partir de estas ramas se pueden producir plantas completas con la
poliploidía.

3.4. Cultivos in vitro (tema 2)

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4. ESTADO ACTUAL Y PERSPECTIVAS DE LA MEJORA VEGETAL CLÁSICA

Se han alcanzado importantes logros como incrementos de la productividad, resistencia o
tolerancia a plagas, enfermedades y ambientes adversos, adaptación a la mecanización…
Ejemplos son el arroz, maíz, trigo, hortalizas…

No obstante aún tenemos grandes retos: mejorar el valor nutritivo de las plantas, incrementar
partes de la planta que se utilizan, aprovechar mejor la capacidad fisiológica, incrementar la
resistencia a estreses bióticos y abióticos.

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