UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO:

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRACTICA N°04:

“RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN
PLACA”

PRESENTADO POR: GRUPO N°2

 Acuña Herrera, Maria Isabel

 Avendaño Rivera, Jeanet Vanesa
 Chumpitaz Silva, Leonardo Enrique
 López Tucto, Elizabeth
 Minaya Choquehuanca, Andrea Paola
 Sanchez Chinchay, Yatsumi Alexandra

DOCENTE:
Ing. Edson Max Caro Degollar
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

HUACHO – 2023

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 04

1. TÍTULO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA

2. COMPETENCIAS:
 Aplica técnicas de homogenización y dilución de muestras para ser analizadas
microbiológicamente.
 Emplea técnicas de siembra de microorganismos en diferentes tipos de medios de
cultivo.
 Realiza cuantificación de microorganismos mediante las técnicas de recuento en placa.

3. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células microbianas en
un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a
la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y

cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta técnica se basa
en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se
multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia, el número de colonias que se
observarán a simple vista será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de
colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en
muestras complejas, dará una estimación aproximada del número total de microorganismos,
dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación
que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse
problemas relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las
muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y
valores elevados si las tomas de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado
por gravedad los microorganismos.

En microbiología las diluciones seriadas corresponden a un método empleado de manera rutinaria

con el fin de aislar células microbianas viables desde muestras sólidas o líquidas y cuantificar su
cantidad. Las células viables son aquellas con la capacidad de dividirse y formar descendencia y,
en la mayoría de los casos es el tipo de células que interesa. A través del método de diluciones
seriales una célula viable se puede aislar e identificar como una colonia o Unidad Formadora de
Colonia – UFC.

Las diluciones seriales se realizan cuando el tamaño de las poblaciones microbianas en una muestra
es demasiado alto, y sembrarlas en un medio sólido puede conducir a la no

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

formación de colonias o fusión de estas haciendo difícil el aislamiento y recuento. Para obtener un
número apropiado de células que puedan formar colonias aisladas en placa (entre 30 y 300
unidades formadoras de colonias UFC) se requiere de la dilución de la muestra y, como rara vez se
conoce con antelación el número de células viables, normalmente se hace más de una dilución,
siendo usual realizar diluciones decimales. Para hacer una dilución decimal de 10-1 se mezclan 1mL
en 9 mL de diluyente. Si se necesita una dilución 10-2, se pueden mezclar 0.1mL con 9.9 mL o de
modo seriado haciendo dos diluciones de tipo 10-1 así sucesivamente si se sospecha que la muestra
esta densamente poblada. Si se parte de muestras sólidas o líquidas densas (suelos, alimentos, etc),
para asegurar una muestra representativa, la primera dilución se realiza mezclando 10 g o 10 mL de
muestra en 90 mL del diluyente.

Otros factores de relevancia en el método de diluciones seriales están relacionados con la

homogenización de la muestra, el diluyente seleccionado y, la identificación de las muestras y
cultivos. Generalmente, la liberación de las células desde las muestras al fluido posiblemente
requiera de dispositivos de trituración y mezcla para lograr una buena homogenización. Como
diluyente de uso general está el agua peptonada al 0.1%, aunque se puede trabajar con solución
salina fisiológica con 0.1% de peptona. La identificación de la muestra se refiere a la forma como
se debe rotular para no confundirla o perderla, el rotulo debe incluir: nombre y tipo de producto,
fecha de recolección, cantidad, empaque, fecha de producción y de vencimiento, así como fecha de
análisis y características organolépticas (color, olor, sabor, aspecto); los cultivos por su parte deben
indicar el número de dilución, tipo de medio, nombre del analista y fecha.

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

Figura 1. Método de las diluciones seriadas.

Métodos de siembra
Para la siembra de las diluciones seriales existen diferentes métodos, no obstante, los
extendidos y usados son: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa.

a) Método de extensión o siembra en superficie:

Un volumen que no suele ser superior a 0.1 mL, se extiende en la superficie de una
placa con medio sólido, utilizando un asa estéril de extensión (asa digralsky). Es
importante que la superficie del medio esté seca de modo que el líquido de la muestra se
absorba y las células queden fijas. La placa se incuba a una temperatura adecuada hasta
que aparecen las colonias.

b) Método de vertido en placa o profundidad:

Se pipetea un volumen conocido (normalmente 1mL) de muestra en una caja Petri
estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido. Se realiza una mezcla con
movimientos suaves de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar solidificar.
En este método se debe tener precaución con la temperatura del agar fundido, la cual
debe mantenerse entre 45°C - 50°C, temperaturas superiores podrían matar las células.
En la placa las colonias se forman por toda la caja y no solamente en la superficie.

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Figura 2. Métodos de siembra.

El número de colonias que se obtiene en la determinación de células microbianas viables

no solo depende del tamaño del inoculo, también de lo adecuado que sea el medio de
cultivo, de las condiciones y duración de la incubación. Si se usa un cultivo mixto, por
ejemplo, no todas las células depositadas en la placa desarrollarán colonias a la misma
velocidad, y si se emplea un corto tiempo de incubación se obtendrán menos colonias de
las posibles.

Medios de cultivo
Existen diversos grupos de microorganismos cuyo aislamiento resulta relevante para el
análisis de determinadas muestras. Así, por ejemplo, cuando se desea analizar un alimento,
los microorganismos mesófilos (microorganismos que crecen entre 15 – 45°C), mohos y
levaduras (hongos), y coliformes se convierten en los grupos más importantes a evaluar ya
que su presencia y cantidad determina la inocuidad de dicho alimento. Para la estimación
de estos microorganismos se eligen medios de cultivo específicos que favorecen su
crecimiento:
 Agar nutritivo o plate count: son medios generales usados para el cultivo de
microorganismos mesófilos.
 Agar PDA o Sabouraud: favorecen el aislamiento de mohos y levaduras.
 Agar VRB: estos medios son usados para determinar la presencia de coliformes. El
medio chromocult es además un medio diferencial en el cual se podrán identificar
diferentes tipos de coliformes.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

Preparar los medios de cultivos y todo el material, de modo que al momento de comenzar con
las diluciones todo este estéril y listo para ser usado.

4.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA

Esta práctica se desarrollará en grupo. Cada grupo deberá seleccionar una muestra
solida o líquida desde la cual desee evaluar la presencia, aislar y cuantificar
microorganismos; se puede seleccionar un alimento (líquido o sólido, preferiblemente
alimentos que se comercialicen en la calle), una muestra de suelo, muestras de agua,
etc. Si la muestra es sólida como mínimo deberá llevar 15 g o 15 mL si es líquida.

4.2. PREPARACIÓN DE HOMOGENIZADOS Y DILUCIONES

 En caso de que la muestra sea solida disminuir su tamaño con ayuda de un mortero
o, cuchillo y superficie de corte previamente desinfectados con etanol al 70%.
NOTA: si se pueden esterilizar los elementos mejor.
 Pesar 10 g de la muestra sólida o medir 10 mL de la muestra líquida (con ayuda de
una pipeta graduada o macropipeta).
 Diluir la muestra en 90 mL de solución salina peptonada, dejar en agitación por 5
minutos.
 Dejar reposar 10, 15 o 30 minutos para permitir la liberación de los
microorganismos a la solución diluyente. (Dilución 1:10 (10-1)).
 De la dilución 1:10 (10-1) tomar 1 ml (usar micropipeta y punta estéril) y
depositarlo en tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución 1:100
(10-2).
 De la dilución 1:100 (10-2) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9 ml de
diluyente para obtener la dilución 1:1000 (10-3).
 Continuar las diluciones sucesivamente si se requiere.
 Para el análisis microbiológico de alimentos se deben utilizar 3 diluciones como
mínimo.
 Luego de preparar las diluciones no deben pasar más de 20 min antes de estar
sembradas.

4.3. SIEMBRA EN PROFUNDIDAD (MESÓFILOS)

 Rotular las cajas con el nombre del equipo de trabajo, medio de cultivo fecha y
dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la base de una
de las cajas de Petri estéril previamente marcadas.
 Inmediatamente verter en cada caja de 12 a 15 ml de agar nutritivo o plate count
fundido a 45ºC y mezclar el inóculo con el agar imprimiendo movimientos de
vaivén a la placa sobre el mesón: 5 veces en sentido horizontal, 5 veces en sentido
vertical, 5 veces en el sentido de las

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manecillas del reloj, 5 veces en el sentido contrario a las manecillas del reloj y 5
veces haciendo un ángulo recto. NOTA: El medio de cultivo debe ser translúcido
debido a que las unidades formadoras de colonias quedarán en la superficie, en el
medio y en el fondo de la caja.
 Lo ideal es que por cada dilución se siembren al menos dos cajas Petri, para este
ejercicio solo se inoculará una.
 Incubar a 30°C por 72 horas.
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones donde
hayan crecido entre 30 UFC y 300 UFC. NOTA: Cuando el número de bacterias
viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la siguiente
formula:

𝐶𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅

Donde:
-
CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)
-
Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de haber
sembrado dos cajas Petri por dilución)
-
R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo realizar el
conteo (101, 102, 103, etc)
4.4. SIEMBRA EN SUPERFICIE (MOHOS Y LEVADURAS)
 Rotular las cajas con el nombre del grupo de trabajo, medio de cultivo fecha y
dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 0.1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la superficie
de una de las cajas de petri con el medio de cultivo y previamente marcadas.
 Inmediatamente extender el inóculo con asa de Dryglaski sobre toda la superficie.
 Incubar a temperatura ambiente por 3, 4 y 5 días (cada día se debe evaluar
crecimiento).
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones donde
hayan crecido entre 15 UFC y 150 UFC. NOTA: Cuando el número de hongos
viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la siguiente
formula:
𝟏
C𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅 ∗
𝟎,𝟏

Donde:
- CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

- Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de haber

sembrado dos cajas Petri por dilución)
- R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo realizar el
conteo (101, 102, 103, etc)

4.5. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

Después de los diferentes periodos de incubación, realice un conteo en cada una de las
cajas con ayuda de un contador de colonias (ver en procedimiento indicaciones sobre
número de colonias posible de ser contadas y cálculos). Observar y consignar en una
tabla los resultados encontrados en el crecimiento microbiano.

5. MATERIALES Y EQUIPOS:

a) Equipos
- 1 Autoclave de 50 L.
- 1 Horno de 25 L
- 1 Incubadora

b) Materiales
- 7 tubos de ensayo 13x100 con torunda
- 7 tubos de ensayo 18x150 con torunda
- 7 placas Petri (estéril)
- 7 Pipetas de 10 mL (estéril)
- 1 Mechero
- 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con torunda.
- 1 Aplicadores de madera.
- 1 Pinzas de disección punta roma.
- 1 asa de Dryglaski
- 1 paquete de 25 bolsas reclosables transparentes (medidas 20 x 17 cm a más)

c) Sustancias y reactivos
- Agar Plate Count (PCA)
- Agar VRB
- Agar Dextrosa Sabouraud
- Algodón
- 1 L Alcohol 96°
- 1 L agua estéril para inyección

d) Materiales de protección e higiene personal

- 1 Jabón liquido
- Guantes descartables.
- Guardapolvo
- Cofia

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA UNJFSC

UNJFSC - 20

6. RESULTADOS
6.1 RESULTADOS DE LA CARGA MICROBIANA EN QUESO

Se realizó la preparación de una solución para incubar las bacterias aerobios Mesofilos en
muestra de queso. Utilizamos 5 placas de Petri enumerados de 10- 1,10-2,10-3,10-4,10-5.

Esta siembra se desarrolló para obtener diferentes resultados de colonias de las que posiblemente se
encuentren en el queso

En la placa N°1 se puede ver

que la dilución sembrada:
10^-1 con cantidad (incontable) de
agentes microbianos

En la placa N°2 se puede ver que la

dilución sembrada:
10^-2 con cantidad de (95) agentes
microbianos
95×10= 950 UFC/ mL en la dilución 5
950× 10^-5= 9.50 ×10^-6 UFC de la
suspensión original.

En la placa N°3 se puede ver la

dilución sembrada:
10 -3 con cantidad de (62)
agentes microbianos
(62) x 10 = 620 UFC/ ML en la
dilución 4
(620) x 10-4 =6.20 x 10-5 UFC
de la suspensión original.
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA UNJFSC

En la placa N°4 se puede ver la dilución

sembrada:
10-4 con cantidad de (56) agentes
microbianos
56x10= 560 UFC/ML en la dilución 5
560x 10-5=5.60 x 10-6 UFC de la
suspensión original

En la placa N°5 se puede ver que la

dilución sembrada:
10^-5 con cantidad de (28)
agentes microbianos 28×10=
280 UFC/ mL en la
dilución 5
280× 10^-5= 2.80 ×10^-6 UFC de
la suspensión original.

6.1 RESULTADOS DE LA CARGA MICROBIANA EN MANDARINA

Se realizó la preparación de una solución para incubar Hongos y levaduras en muestra de

queso. Utilizamos 5 placas de Petri enumerados de 10- 1,10-2,10-3,10-4,10-5.

Esta siembra se desarrolló para obtener diferentes resultados de colonias de las que posiblemente se
encuentren en la mandarina
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA UNJFSC

En la placa N°1 se puede observar que la

dilución sembrada:
10^-1 con una colonia de moho y hongo, y
cantidades incontables de levaduras.

En la placa N°2 podemos observar que la

dilución sembrada:
10^-2 con cantidad (incontables) de levaduras
y una colonia de moho.

En la placa N°3 se puede ver que la dilución

sembrada:
10^-3 con una colonia de moho
En la placa N°4 se puede ver que
la dilución sembrada:
10^-4 con cantidad (incontable) de
agentes microbianos
 CONCLUSIONES:

En conclusión, nos pareció excelente determinar el nivel de contaminación presente en una muestra de
queso. Identificamos Cuanto mayor sea el número de colonias microbianas encontradas, mayor será la
contaminación. También que la disminución en el número de colonias en cada placa sugiere que se
minimiza la contaminación durante la manipulación en las muestras y la siembra en las placas de Petri.

Si se observa una disminución significativa en el número de colonias en cada placa de Petri nos indica
que puede haber presencia de propiedades antimicrobianas en la muestra. Esto puede ayudar en la
identificación de patógenos específicos presentes en la muestra y evaluar la calidad microbiológica de
la muestra.

7. DISCUSIONES:

(Bacterias aerobias mesófilas)

.
 Según (Delgado, 2003). El queso es un alimento fermentado que durante su elaboración alcanza
normalmente recuentos de bacterias fermentadoras necesarias para la transformación de la leche en
queso. los recuentos de bacterias aerobias mesófilas encontrados en algunas muestras podrían indicar
que durante la manipulación de la materia prima o su procesamiento no se han observado las medidas
sanitarias de rigor. Una carga microbiana elevada puede afectar a la calidad del producto, ya que la
presencia de estos microorganismos se asocia con el deterioro precoz de los quesos o con
fermentaciones anormales. De hecho, se observó una disminución en el número de colonias en cada
una de las placas, se indica que se ha logrado un buen control de la contaminación durante el análisis
microbiológico. Esto connota que se han seguido correctamente las técnicas asépticas adecuadas,
como la esterilización uso de herramientas y fuego, minusvalorando la exposición de microorganismos
durante el procesamiento y cultivo de muestras en las placas de Petri. Estos resultados respaldan la
confiabilidad de los datos alcanzados.
 Según (Vásquez, 2018) es importante determinar la carga microbiana en el queso fresco industrial,
siempre y cuando se utilice lo establecido por las normas sanitarias que establece los criterios
microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad. para ello uso un total de 30 muestras de 0.5kg de 6
empresas productoras de queso industrial donde se analizaron mesófilos viables, coliformes
escherichia coli, salmonella spp. y Staphylococcus aureus. Concluyendo que una sola muestra estaba
en mejores condiciones.

(hongos y levaduras)

 Según(León, 2017) su investigación evaluó la eficiencia de dos marcas de benzoato de sodio de

diferente procedencia en zumo de naranja sobre pruebas microbiológicas. Se comparó la eficacia
del benzoato de sodio americano y chino en la inhibición del crecimiento microbiano en muestras
con inóculo puro de levadura y bacteria. Los resultados mostraron que no hubo diferencias
significativas entre el benzoato de sodio de ambas procedencias en la inhibición del crecimiento
microbiano.

 Según (Méndez, 2015). Se realiza para determinar la carga microbiana general presente en la muestra de
mandarinas. Esto implica tomar muestras y cultivar los microorganismos presentes en medios de cultivo
 adecuados para contar y caracterizar los distintos tipos de hongos y levaduras presentes. Determinamos si
los hongos y levaduras presentes son patógenos para los seres humanos. Esto se logra mediante pruebas
específicas para evaluar la capacidad de los microorganismos
 Según (Dennis, 2019). Algunos hongos pueden producir toxinas peligrosas para la salud humana, como
micotoxinas. Es por eso que realizamos esta siembra para detectar la presencia de hongos o levaduras y
evaluar su nivel de contaminación en las mandarinas

8. INTERROGANTES ADICIONALES

a. Mediante un esquema indique como obtener una placa o caja de Petri con una dilución
10-7 mediante:
- Siembra en profundidad
- Siembra en superficie
Disoluciones en cada tubo de ensayo: La
dilución en el tubo # 1 es 1/10 o 10-1 La
dilución en el tubo # 2 es 1/100 o 10-2 La
dilución en el tubo # 3 es 1/1000 o 10-3
La dilución en el tubo # 4 es 1/10000 o 10-4
La dilución en el tubo # 5 es 1/100000 o 10-5
La dilución en el tubo # 6 es 1/1000000 o 10-
6
La dilución en el tubo # 7 es 1/10000000 o 10-7

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
 Siembra En Profundidad

Proceso de realización de un
cultivo:

Luego se coloca en el fondo El medio de cultivo debe ser

Una vez hechas las
de una placa Petri estéril.
disoluciones, tenemos que
después se añade 13 ml de
llegar a la dilución 10−7
agar fundido y enfriado a
Con una pipeta estéril, se 45°C sobre la placa Petri
toma 1 ml de cada que contiene una cantidad
diluyente de 1 ml de la muestra
diluida.
translúcido debido a que las Después de la incubación contar
unidades formadoras de el número de colonias en las
diluciones donde hayan crecido
colonias que quedarán en la
superficie, en el medio y en el entre 30 UFC y 300 UFC.
fondo de la caja. Incubar a
30°C por 72 horas.
 9. BIBLIOGRAFÍA.
Delgado, R. (2003). Evaluación bacteriológica de quesos frescos artesanales comercializados en Lima,

Perú, y la supuesta acción bactericida de Lactobacillus spp. Rev Panam Salud Publica.

Vásquez, V. (2018). Evaluación de la calidad bacteriológica de quesos frescos en Cajamarca.

Ecología Aplicada, 17(1), 45-51. https://doi.org/10.21704/rea.v17i1.1172

León, M. (2017). Evaluación de eficiencia de dos marcas diferentes de benzoato de sodio en zumo de naranja sobre

pruebas microbiológicas. Universidad Ricardo Palma. https://repositorio.urp.edu.pe/handle/20.500.14138/908

 10. ANEXOS

10.1 Bacterias aerobias

1. Pasamos la dilución a la placa 2.

3.

4. Echamos el Agar a la placa

 5. Movemos en 8 las placas

6. Luego de terminar lo
almacenamos para después
hacer el conteo

10.2 Hongos y levaduras