PRACTICA Nº 12:

UROCULTIVO
• Contar el número de colonias presentes y multiplicarlo por 1000; si se usó el
asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utilizó un asa calibrada de
0.01ml
• Se utilizo asa calibrada de 0.01 ml
• Se utilizo asa calibrada de 0.001 ml
 Analisis de orina
• Los sedimentos urinarios se siembran en medios especiales de cultivo. Recientemente se ha
descrito otra técnica simple en que se aplica el examen microscópico directo después de teñir con
la técnica de Gram orina que no se ha centrifugado. Se debe registrar el número de células de pus
observadas, así como el aspecto y los efectos de la tinción de Gram en las bacterias encontradas.
En el cuadro siguiente se indica la manera en que se pueden interpretar los resultados.
• Este procedimiento es esencial para:
• Identificar la especie de las bacterias
• Determinar el número de bacterias presentes (si éstas provienen de la contaminación de la muestra posterior a su
recolección, serán sumamente escasas)
• Aislar microorganismos que se encuentren en escasa cantidad
• Decidir cuál será el antibiótico más efectivo en el tratamiento de la infección (ensayos de suscepti- bilidad a los
antimicrobianos).
 LACTOSA (+)
LACTOSA (-)
• E. coli
• Pseudomonas
• Enterobacter aerogenes
• Shigella
• Klebsiella sp
• Salmonella
• Edwarsilla
• Proteus
• Serratia marcenses
• Citrobacter
• Providencia
• Erwinia
 Mac Conkey Agar.
• Aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos.
• Diferencia: bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimento
(Familia Enterobacteriaceae )
• Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano
• La lactosa es el hidrato de carbono fermentable,
• La mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo
de gran parte de la flora Gram positiva.
• Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje
del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de
las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
• Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura
 Microorganismos Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes
Shigella flexneri Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas

N.Gonorrhoeae
S.Enteritidis
AGER CETRIMIDE
• El agar cetrimida se fundamenta en la capacidad que tiene el medio para favorecer el crecimiento
de P. aeruginosa, estimular la producción de sus pigmentos y a su vez inhibir el crecimiento de
otros microorganismos.
• Estas propiedades se deben a la función que cumplen cada uno de sus componentes. La peptona
de gelatina presente sirve como fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. El glicerol o glicerina
funciona como fuente de carbono.
• Por su parte, la cetrimida (bromuro de cetil trimetil amonio) es la sustancia que inhibe el
crecimiento de otras bacterias diferentes a P. aeruginosa, incluyendo otras especies
pertenecientes al mismo género.
• La inhibición se produce porque la cetramida actúa como un detergente catiónico, logrando
desestabilizar la membrana plasmática de la mayoría de las bacterias, a excepción de P.
aeruginosa y algunas otras que logran sobrevivir.
• Por otra parte, contiene cloruro de magnesio y sulfato de potasio. Estos compuestos estimulan la
expresión fenotípica relacionada con la capacidad de Pseudomonas aeruginosa de producir
diversos pigmentos, entre ellos: piocianina, pioverdina, piorrubina, piomelanina y fluoresceína.
Finalmente, contiene agar-agar, que le da la consistencia sólida.
AGAR CHROMOCULT E.coli
• El Agar Cromogénico E. coli-Coliformes (CCA) es un medio selectivo para la detección de E. coli y otros
coliformes en aguas y alimentos. La recuperación y enumeración de Escherichia coli y coliformes son
indicadores importantes de la higiene ambiental y alimentaria. La interacción de los ingredientes en el
medio, como la peptona, el sorbitol y el piruvato, permite un rápido crecimiento de las colonias, incluidos los
coliformes infecciosos, y también permite la recuperación de coliformes dañados térmicamente de manera
subletal. El Tergitol-7 inhibe las bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas sin afectar a las bacterias
coliformes. La selectividad se ve aumentada por la cefsulodina y la vancomicina, suminitradas por el
Suplemento E.coli-Coliformes (Cat. 6041), actúan contra pseudomonas y bacterias Gram negativas, oxidasas
positivas, enterococos y otras bacterias Gram positivas. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico y
las sales de fosfato actúan como un sistema tampón. El agar bacteriológico es el agente solidificante. La
detección de ß-glucuronidasa se utiliza en la diferenciación de Escherichia coli, ya que la enzima está
presente en E. coli pero no en otros miembros del grupo coliforme. La mezcla cromogénica contiene
sustratos cromogénicos: Salmon-GAL y X-glucurónido. Las enzimas coliformes producidas, como la ß-D-
galactosidasa y la ß-D-glucuronidasa, escinden estos sustratos dando como resultado la diferente coloración
de las colonias de bacterias. La ß-D-galactosidasa escinde el sustrato Salmon-GAL y da un color rojo salmón a
las colonias de coliformes. La ß-D-glucuronidasa, una enzima característica de E. coli, escinde el X-
glucurónido, dando un color azul a estas colonias. E. coli tiene las dos enzimas, y por lo tanto escinde ambas
sustancias cromogénicas dando colonias de color azul oscuro a violeta. Los coliformes totales son la suma de
colonias de E. coli más las colonias de color rojo/salmón. La adición de triptófano al medio permite realizar la
prueba del Indol para una confirmación de E. coli más fiable.
Pruebas bioquimicas
 El Agar-hierro-triple azúcar
Si fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el indicador en
el fondo del tubo, (rojo si no)
Si fermenta lactosa y/o sacarosa, acidificará el medio en su superficie volviéndolo de
color amarillo. (rojo si no)
Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se
presentará un ennegrecimiento del tubo.
La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver
la fermentación de la glucosa (fondo amarillo).
Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora
de gas.
 •Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
•Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
•Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.
•La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
•El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
A: ácido
K: alcalino

Microorganismo Pico/Fondo Producción de gas Producción deácido

sulfhídrico
E. coli ATCC 25922 A/A + -
K. pneumoniae ATCC A/A + -
700603
P. mirabilis ATCC 43071 K/A + +
S. typhimurium ATCC K/A - +
14028
S. enteritidis ATCC 13076 K/A + +
S. flexneri ATCC 12022 K/A - -
P. aeruginosa ATCC 27853 K/K - -
 Agar Lisina Hierro.
• Diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la
producción de ácido sulfhídrico.
• La peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.
• La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa.
• El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico.
• El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH
igual o mayor a 6.8.
• Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al
color violeta.
• La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
• Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la
totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo
de las peptonas, y el fondo amarillo.
• La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de
hierro.
• Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-
ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
 1- Decarboxilación de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de
Morganella spp.
3-Producción de ácido sulfhídrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina.
Color en el pico de
flauta
Color en la Ennegrecimiento
Microorganismos
base del tubo del medio

oteus mirabilis ATCC 43071 Rojo Amarillo Negativo

monella typhimurium ATCC
Púrpura Púrpura Positivo
14028
almonella enteritidis ATCC
Púrpura Púrpura Positivo
13076
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo
Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo
ebsiella pneumoniae ATCC
Púrpura Púrpura Negativo
 SIM Medio
• Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de
sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
• Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
• El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente
de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol.
• Por enzimas llamadas triptofanasa.
• El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo.
• Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la punción de siembra
• Y las cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado
negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a
un pH mayor a 7.2.
• Resultados
Cepas móviles: Producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra.
Cepas inmóviles: El crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: Ennegrecimiento
Cepas SH2 negativas: Sin cambio de color.
Cepas indol positivas: Color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Cepas indol negativas: Sin cambio de color.

Microorganismo Movilidad Indol H2S

E. coli + + -

K. pneumoniae - - -

P. mirabilis + - +

S. typhimurium + - +

S. enteritidis + - +

S. flexneri - - -
 Pruebas IMViC
I: Producción de Indol (Tubo AP) I: Añadir unas gotas de xilol (Indol I), agitar y dejar reposar.
M: Rojo de Metilo (Tubo CG) Añadir unas gotas de reactivo de Erlich (Indol II).
M: Añadir unas gotas del indicador Rojo de Metilo
Vi: Voges Proskauer: Producción Vi: Añadir unas gotas de α-naftol (VP I) y unas gotas de KOH
al 40% (VP II) y agitar.
de acetil metil carbinol (Tubo CL)
C: Ver color del tubo.
C: Utilización de Citrato (Tubo C)

Medio Agua Peptonada Medio Caldo Glucosado Medio Clark y Lubs Medio Citrato (C)
(AP) (CG) (CL)

Indol + Indol - RM + RM - VP + VP - Citrato + Citrato -

 Prueba de Indol
• Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa).
• La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina.
• El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs).
• El triptófano forma parte de las peptonas del medio.
• Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado un complejo coloreado
entre el indol y el p-dimetilamino benzaldehído.
• El alcohol amílico concentra el complejo coloreado en la superficie
 Rojo de metilo (M)
• Detecta la fermentación ácido-mixta.
• Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del
medio hasta 4-5.
• Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo
 Voges-Proskauer
• Detecta la fermentación butanodiólica.
• En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en
la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol.
• Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la
presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o
acetoína).
• La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo.
• El diacetilo oriigina una coloración roja al reaccionar con los restos
guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej.
Arginina).
• La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo.
• El alfa naftol incrementa la sensibilidad de la reacción. El diacetilo
origina un compuesto de color rosado.
 Simmons Citrato Agar
• Diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y
energía.
• En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la
única fuente de carbono.
• Las sales de fosfato forman un sistema buffer,
• El magnesio es cofactor enzimático.
• El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico,
• El azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.
• Los microorganismos (poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico )capaces de
utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno,
dando producción de alcalinidad..
• El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un
medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de
citrato permeasa.
 Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae Positivo Azul

S. typhimurium Positivo Azul

E. coli Negativo Verde
S. flexneri Negativo Verde
Antibiograma
Mueller Hinton
• Medio de cultivo nutritivo no selectivo que promueve el desarrollo
microbiano. Por su composición, ha sido recomendado por el Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) antiguamente llamado National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), para ser utilizado en
forma rutinaria en la realización del antibiograma en medio sólido, debido
a que presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de
sensibilidad, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y
tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos microbianos crece
satisfactoriamente y una gran cantidad de datos adicionales que han sido
evaluados y avalados usando este medio de cultivo. Cuando se suplementa
con sangre de carnero al 5%, permite realizar las pruebas de sensibilidad a
los antimicrobianos en especies de estreptococos. También, con el
agregado de sangre puede utilizarse para el cultivo y aislamiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes.
• https://books.google.com.pe/books?id=ONKWVHU5SNMC&pg=PA25
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