Universidad de Guanajuato, División de Ciencias Naturales,

Departamento de Farmacia, Lic. En QFB

Taller de Bacteriología médica Profesora: Claudia Mendoza
Macías
Equipo 1 GA1
- Acosta Olvera Dulce Bibiana
- Gutiérrez Martínez Ana Raquel
- Negrete Palacios Cynthia Donají

PRACTICA 2: DIAGNOSTICO DE INFECCIONES

DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
Fecha de entrega: 20/10/22
I Toma de muestra
Obtención de muestra de exudado nasal
Previamente a la toma de muestra, acomodar el material que se va a utilizar hisopos
estériles, portaobjetos, gradilla con los tubos de medio de transporte Stuart-Amies.
Utilizar el equipo de protección personal como careta, cubrebocas y guantes para
la obtención de la muestra. El paciente deberá estar sentado en una silla respaldada
en la pared, de manera que pueda inclinar su cabeza hacia atrás, con el dedo pulgar
elevar la punta de la nariz e introducir el hisopo en una fosa nasal, girando el hisopo
y dejarlo allí durante 10 a 15 segundos, se retira el hisopo y se introduce en otra
fosa nasal, mediante la misma técnica, al final retirar el hisopo evitando tocar piel u
otras áreas. Se realizarán dos tomas bajo el mismo procedimiento, una para el frotis
y otra para el cultivo.

Fig. 1. Imagen ilustrativa de la toma de muestra de exudado nasal.

En la siguiente tabla se muestran los datos de la paciente y características de la

muestra:
Datos del paciente Características de la muestra
Nombre Cynthia Donají Apariencia/consistencia Muestra
Negrete transparente
Palacios de
Edad 23 consistencia
mucosa.

Ocupación Estudiante Hora de recolección 11:40 AM

Residencia Guanajuato
Tratamiento Niega Método de recolección Niega
previo con
antimicrobianos

Obtención de muestra de exudado faríngeo

Primero, inspeccionar la faringe, para esto el paciente deberá estar en una posición
cómoda y con buena eliminación, de ser necesario deprimir la lengua utilizando un
abatelengua, se deberá visualizar la fosa amigdalina y faringe, buscando exudado
posterior, presencia de pseudomembranas o placas. Luego, se le indica al paciente
que abra la boca y que pronuncié un largo “ah”, introducir el hisopo y frotarlo de
manera enérgica en ambas amígdalas y la pared posterior de la faringe con
movimientos de barrido. Retirar el hisopo sin tocar otras partes como las paredes
de orofaringe, úvula, lengua, encías y dientes. Este procedimiento se repetirá 2
veces, uno para el extendido de frotis y otro para la siembra de la placa de agar
sangre.
Se realizan dos tomas bajo el mismo procedimiento, una para el frotis, otra para el
cultivo.

Fig. 2 y 3. (De izquierda a derecha). Imágenes representativas de la toma de muestra de

exudado faríngeo.

Datos del paciente Características de la muestra

Nombre Ana Raquel Apariencia/consistencia Muestra
Gutiérrez transparente
Martínez de
consistencia
Edad 22 mucosa.

Ocupación Estudiante Hora de recolección 11:50 AM

Residencia Guanajuato
Tratamiento Niega Método de recolección Niega
previo con
antimicrobianos
II Medios para el aislamiento
Agar sangre
Este medio se recomienda para la investigación en ensayos clínicos y de alimentos.
También es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias
Gramnegativas entéricas. El digerido pancreático de gelatina y peptonas (carne y
caseína) proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esencial para
el crecimiento. La lactosa es el carbohidrato fermentable que proporciona carbono
y energía. El cloruro sódico suministra los electrolitos esenciales para el transporte
y el equilibrio osmótico. Las sales biliares y el cristal violeta son los agentes
selectivos e inhiben organismos Gram positivos. El rojo neutro es el indicador de
pH. Cuando se fermenta la lactosa, el pH del medio disminuye, cambiando el color
de rojo neutro a rosa. El agar bacteriológico es el agente solidificante.
Cuyos componentes son los siguientes:
Peptona de caseína (10 g); Peptona de carne (5 g; Extracto de levadura (3 g);
Extracto de corazón (3 g); Cloruro sódico (5 g); Almidón de maíz (1 g); Agar
bacteriológico (15 g); sangre de cordero (50 ml). Fórmula (en g/l) pH: 7.2 ± 0.2.
Fecha de caducidad: 7 de enero de 2022.
La inoculación se realiza mediante dilución por estría. Se deposita la muestra en
una orilla de la placa, con una asa esterilizada en el mechero, se jala de la parte
donde se inoculo y se estría entrando 2-3 veces en el inoculo y diluyendo, esto se
realiza 2 veces más llevando de la estría anterior.

Fig. 4. Imagen representativa de técnica de

inoculación.
 Fig. 5. Imagen representativa de Fig. 6. Imagen representativa de
crecimiento de S. aureus en agar sangre. crecimiento de S. pyogenes en agar sangre.

Exudado nasal:

Fig. 7. Resultados de inoculación

de muestra de exudado nasal en
agar sangre tras 48 horas de
incubación.

Exudado faríngeo:
 Fig. 8. Resultados de inoculación
de muestra de exudado faríngeo
en agar sangre tras 48 horas de
incubación.

Agar sal y manitol

Es un medio de cultivo sólido, selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento y
diferenciación de estafilococos a partir de diversas muestras. Su fórmula cumple
con los requerimientos de la Armonización de Farmacopeas Europea, japonesa y
de los Estados Unidos de Norteamérica (EP, JP y USP respectivamente). En este
medio de cultivo el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen
la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo
microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que
se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo
de la microbiota acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el
agente solidificante. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración
de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen
en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Su formulación
es la siguiente (g/L): 1 g extracto de carne, 5 g peptona de carne, 5g de tripteína, 10
g manitol, 75 g cloruro de sodio, 0.025 g de rojo fenol y 15 g de agar, el pH final
debe ser de 7.4 ± 0.2.
Las condiciones de almacenamiento deben ser las siguientes: Medio de cultivo
deshidratado a 10-35 ºC y/o medio de cultivo preparado a 2-8 ºC.
Inoculación se realiza sembrando un inoculo denso de la muestra por dilución por
estría. Se deposita la muestra en una orilla de la placa, con una asa esterilizada en
el mechero se jala de la parte donde se inoculo y se estría entrando 2-3 veces en el
inoculo y diluyendo, esto se realiza 2 veces más llevando de la estría anterior.
La interpretación de los resultados los microorganismos fermentadores de manitol:
colonias de color amarillo rodeadas o no de un halo amarillo. Mientras que los
microorganismos no fermentadores de manitol: colonias del color del medio, rojas
rodeadas o no de halo rojizo-púrpura.
Fecha de caducidad: sin fecha de caducidad, fue preparado el 4 de octubre 2022.

Fig. 9. Imagen representativa de

crecimiento de S. aureus en agar
sal y manitol
Exudado nasal:

Fig. 10. Resultado de inoculación

de muestra de exudado nasal en
agar sal y manitol después 48
horas de incubación. No se observa
crecimiento.

Mueller-Hinton
Medio de cultivo no selectivo que promueve el desarrollo microbiano. Por su
composición puede ser utilizado para la realización de antibiograma en medio
sólido, ya que, presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de
sensibilidad.
Fecha de caducidad: 18 noviembre 2022
Condiciones de almacenamiento: 4°C
 Fig. 11. Crecimiento S. aureus en
agar Mueller Hinton, prueba de
antibiograma.

III Análisis microscópico de la muestra

Tinción de Gram: frotis de las muestras obtenidas
Técnica de tinción:
Se realizaron frotis de muestras de exudado nasal y otro de exudado faríngeo,
extendiendo la secreción en el centro de un portaobjetos formando un ovalo, se dejó
secar al aire libre antes de fijar pasando tres veces por el mechero.
Posteriormente se realizó tinción Gram colocando en primer lugar el colorante
violeta de genciana, verificando que se cubra por completo la muestra y dejando
actuar durante un minuto, al pasar el tiempo indicado se enjuaga con agua destilada
y se utiliza un mordiente que fijara el colorante a las células Gram positivas, en este
caso se utiliza una solución de yoduro, se deja alrededor de un minuto antes de
enjuagar nuevamente.
Posterior a este paso se realiza una decoloración con alcohol acetona, este es un
paso critico en el cual podrían decolorarse también las bacterias Gram positivas,
después de realizar la decoloración se enjuaga nuevamente antes de colocar el
colorante de contraste, se utiliza safranina el cual va a teñir las células que fueron
decoloradas, Gram negativas, se deja actuar durante un minuto y se enjuaga.
Se observaron los frotis al microscopio en campo de amplificación 100X en
búsqueda de bacterias, leucocitos, células epiteliales, u otros componentes como
eritrocitos o hifas. De esta forma se obtienen datos que pueden ayudarnos en la
identificación de un agente patógeno si es que está presente, así como la evaluación
de la microbiota del área de donde proviene la muestra.
 A continuación, se muestran las Tablas de material, reactivos, microorganismos, así
como de la preparación y composición de los reactivos utilizados en la tinción de
Gram.
Material, reactivos y microorganismos utilizados en ambas sesiones
Material Reactivos Muestras (Microorganismos)
• Portaobjetos • Cristal de violeta Cultivos de S. aureus y S. pyogenes
• Mechero • Lugol
• Asa • Alcohol-acetona
• Safranina

Preparación y composición de los reactivos utilizados en una Tinción Gram

Solución yodo-
Cristal violeta Alcohol- acetona Safranina
Lugol
2g Violeta de genciana
2g Yoduro de potasio
20 ml Alcohol etílico 50 ml de alcohol al 0.25g de safranina
1g Cristales de yodo
0.8g Oxalato de NH2 95% 100 ml de agua
100 ml de Agua
100ml de Agua 50 ml de acetona destilada
destilada
destilada

Consideraciones:
La solución yodo- Lugol y safranina deben almacenarse en un frasco ámbar para que la luz no
los afecte. La solución de tinción recién preparada debe filtrarse antes de su uso. En caso de
tinción por el procedimiento de inmersión se recomienda diluir la solución de violeta cristal con
agua destilada en relación 1+4

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Para la muestra de exudado nasal:
Campo Leucocitos Leucocitos Células Bacterias
polimorfonucleares mononucleares epiteliales BGN BGP CGN CGP

1 1 0 2 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 1 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0
5 1 0 1 0 0 0 0
6 2 0 2 0 0 0 0
7 0 0 2 0 0 0 0
8 0 0 2 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0 0
10 2 0 2 0 0 0 0
11 3 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 1 0 0 0 0
14 1 0 2 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0
17 0 0 3 0 0 0 0
18 0 0 3 0 0 0 0
19 0 0 0 0 0 0 0
20 0 0 0 0 0 0 0

Resumen:
- Leucocitos polimorfonucleares: 1-2 por campo de amplificación 100X
- Leucocitos mononucleares: 0 por campo de amplificación 100X
- Células epiteliales: escasas por campo de amplificación 100X
- Bacterias: no se observaron por campo de amplificación 100X
Para muestra de exudado faríngeo:
Campo Leucocitos Leucocitos Células Bacterias
polimorfonucleares mononucleares epiteliales BGN BGP CGN CGP
1 0 0 3 0 0 0 0
2 0 0 3 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 2 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 1 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 3 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 3 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 2 0 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0
17 0 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0
19 0 0 1 0 0 0 0
20 0 0 2 0 0 0 0

Resumen:
- Leucocitos polimorfonucleares: 0 por campo de amplificación 100X
- Leucocitos mononucleares: 0 por campo de amplificación 100X
- Células epiteliales: escasas por campo de amplificación 100X
- Bacterias: no se observaron por campo de amplificación 100X
IV Diagrama dicotómico para la identificación
El proceso de identificación para las muestras de un exudado nasal:

Proceso de identificación de muestras de exudado faríngeo

V Protocolo para pruebas bioquímicas

 Catalasa:
Utilizada para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima
catalasa, la cual facilita la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno,
siendo de utilidad para evitar la formación de radicales tóxicos por el sistema de la
mieloperoxidasa en las células fagocíticas. La prueba es positiva cuando la bacteria
reacciona produciendo la liberación de burbuja, que es la característica dada por la
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno tal y como se muestra
en la fig. 12.
Material: cultivo bacteriano (S. aureus), portaobjetos, agua oxigenada.
A continuación, se describe el procedimiento: en un portaobjetos se depositan de 1-
2 gotas de agua oxigenada, con un asa bacteriológica se toma una colonia
bacteriana aislada pura, y se pone en contacto con las gotas de agua oxigenada.
La formación inmediata de una efervescencia rápida con desprendimiento de
burbujas es un resultado positivo. Al termino de la prueba, desechar el portaobjetos
en un recipiente con desinfectante (ej. Agua con cloro). La formación inmediata de
una efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas (resultado positivo) ver
fig. 12.
NOTA: Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Si se utilizan para esta prueba
cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo
de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen
catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.
Fecha de caducidad de agua oxigenada:
febrero del 2024.
Conservación: conservar en un lugar
fresco y seco.
Resultados:
Prueba positiva para S. aureus, imagen de
la derecha, se observa la formación de
Fig. 12. Resultados de prueba de catalasa para burbujas.
una cepa de S. pyogenes (imagen de la izquierda) Prueba negativa para S. pygenes, imagen
y S. aureus (Imagen de la derecha).
de la izquierda, no se observa reacción al
agregar el peróxido de hidrogeno.

Coagulasa:
Prueba empleada para determinar y diferenciar especies dentro del género
Staphylococcus, así como para probar la existencia de Staphylococcus aureus.
Dicho microorganismo tiene la capacidad de coagular dicha enzima. La coagulasa
es un factor de agregación y constituye una prueba muy sensible y específica para
esta bacteria. Esta proteína representa un importante factor de virulencia. La
coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende
a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse. La prueba se realiza
de la siguiente manera: previamente a la realización de la prueba se extrae sangre
de humano por flebotomía y centrifugada para separar y extraer el plasma
sanguíneo.
Se requieren los siguientes materiales:
Portaobjetos, solución salina, plasma humano, cultivo bacteriano (S. aureus) y asa
bacteriológica.
El procedimiento es el siguiente: colocar una gota de solución salina en un
portaobjetos; con una asa bacteriológica estéril y fría se toma una colonia pura
aislada de la placa y se coloca en la gota de agua solución salina. Después a lado
de esta se coloca una gota de plasma a 0.5 a 1 cm de esta, posteriormente se
mezclan ambas gotas utilizando un palillo de madera. La prueba será positiva si hay
formación de coágulos como se muestra en la Fig. 13.

Fig. 13. Prueba de coagulasa

positiva de Staphylococcus
aureus. Se observan
pequeños coágulos.

Bacitracina
La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y
a la concentración que se encuentra en los discos (0,04 U) inhibe el crecimiento de
los estreptococos betahemolíticos del grupo A de Lancefield, pero no inhibe el
desarrollo de otros estreptococos betahemolíticos. Los micrococcus y los
estomatococcus también son inhibidos por la bacitracina, mientras que los
estafilococos coagulasa negativa son resistentes. Un resultado sensible a la
bacitracina 0,04 U es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo A, y se
puede incrementar además el valor diagnóstico y facilitar la identificación de la cepa
bacteriana en cuestión mediante la utilización de los discos de PYR-A Enterococos.
Fecha de caducidad: 02 junio 201
Prueba para S. aureus
El resultado obtenido fue resistente a bacitracina
dado que no se observó el halo de inhibición.

Fig. 14. Resultado de

prueba de
susceptibilidad para
cepa de S. aureus.

Prueba para S. pyogenes

Resultado: Resistente a
trimetoprima/sulfametoxazol, en el caso de
bacitracina se observa la formación de un
pequeño halo lo cual puede interpretarse
como sensible, la formación de un halo tan
pequeño puede deberse a que el reactivo
esta caducado.
De acuerdo con esta interpretación
Fig. 15. Resultado de prueba de
susceptibilidad para cepa de S. corresponde a estreptococos
pyogenes. betahemoliticos del grupo A.

Bacitracina Trimetoprima/ Identificación presuntiva

sulfametoxazol
Sensible Resistente Estreptococos betahemoliticos del grupo A
Resistente Resistente Estreptococos betahemoliticos del grupo B
Resistente Sensible Estreptococos betahemoliticos no
pertenecientes al grupo A y B
Sensible Sensible Descartar grupo A o B con pruebas
serológicas

Prueba de aglutinación para el agrupamiento de estreptococos

pertenecientes a grupos B, B, C, D, F, G
Preparación
1. Antes de utilizar, espere 10 minutos a que el cuentagotas de los reactivos
adquiera la temperatura ambiente (18-30 °C).
2. No tocar la superficie de reacción de las placas de aglutinación.
3. La solución de la enzima de extracción debe ser reconstituida con agua estéril
destilada evitando cualquier tipo de contaminación.
- Se recomienda identificar los círculos de la placa con el / los grupos(s) de látex
antes de iniciar el procedimiento de agrupamiento.
-Use las varillas de mezclado de plástico suministradas en el kit para mezclar los
reactivos con las colonias de bacterias.
-No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
Procedimiento de la prueba
-Realice una prueba a temperatura ambiente (entre 18-30 °C) y evite colocarse
debajo de una corriente de aire acondicionado.
-Agite con cuidado los reactivos antes de cada uso. A continuación, compruebe que
la suspensión de látex permanece homogénea antes de usar.
-Para asegurar que las gotas se dosifiquen correctamente, mantenga siempre los
cuentagotas en posición vertical.
-Limpie la punta del frasco del cuentagotas de reactivo para conseguir gotas bien
calibradas.
-Cambie la varilla de mezcla para cada reacción.
-Elimine de todo el material desechable usado utilizando un contenedor de
desechos por autoclave o un baño desinfectante.
Procedimiento del ensayo
-Preparación del extracto:
-Nota: Un estudio interno demuestra que el látex de Pastorex™ Strep B (61721)
proporciona los resultados de sensibilidad y especificidad adecuados cuando se usa
para analizar colonias que se sospecha pertenecen al grupo B en el medio
StrepBSelect™ sin extracción enzimática previa.
-Ponga 300 μl de suspensión de enzima de extracción en un tubo de hemólisis para
cada cepa aislada que se vaya a analizar.
-Mediante un asa, emulsione con cuidado de 5 a 10 colonias de un cultivo de
estreptococos reciente en la solución enzimática de modo que se obtenga una
suspensión homogénea. Si el diámetro de las colonias es inferior a 0,5 mm,
aumente el tamaño del inóculo hasta que el enturbiamiento sea visible a simple
vista.
-Incube de 15 a 45 minutos a temperatura ambiente (18-30 °C), o bien de 10 a 30
minutos a 37 °C.
Procedimiento de agrupación de agar sangre Columbia o agar Columbia CNA:
-Ponga 40 μl de la suspensión del extracto en cada círculo de la placa de
aglutinación.
-Agite cuidadosamente los reactivos. Sosteniendo los cuentagotas en posición
vertical, eche una gota de cada reactivo A, B, C, D, F y G en la periferia de la
suspensión del extracto en la placa de aglutinación.
-Mezcle la gota de látex y la suspensión del extracto usando una varilla en toda la
superficie del círculo, cambiando la varilla entre cada reactivo de látex.
-Haga rotar la placa con cuidado, horizontalmente, durante 1 minuto como máximo.
-Observe si se ve a simple vista alguna aglutinación en un periodo máximo de 1
minuto. El tamaño y la velocidad del desarrollo de los grumos varía en función de la
concentración de antígeno en la solución del extracto.
Interpretación de los resultados
-Una reacción positiva se indica mediante grumos rojos sobre un fondo verde
visibles a simple vista. La intensidad de la aglutinación y el tiempo de aparición
dependen de la cepa analizada. Únicamente una aglutinación rápida marcada con
solo una de las seis suspensiones de látex establece de forma convincente el grupo
de la cepa sometida a prueba.
- Una reacción negativa se indica mediante una suspensión marrón homogénea, sin
grumos, tras 1 minuto de agitación. No se debe llegar a la conclusión de un resultado
negativo antes de que transcurra 1 minuto.

Fig. 16. Resultado de la prueba de aglutinación para cepa de S. pyogenes.

Tinción de Gram de S. aureus y S. pyogenes.

A continuación, se muestran las Tablas de material, reactivos, microorganismos, así
como de la preparación y composición de los reactivos utilizados en la tinción de
Gram.
Material, reactivos y microorganismos utilizados en ambas sesiones
Material Reactivos Muestras (Microorganismos)
 • Portaobjetos • Cristal de violeta Cultivos de S. aureus y S. pyogenes
• Mechero • Lugol
• Asa • Alcohol-acetona
• Safranina

Preparación y composición de los reactivos utilizados en una Tinción Gram

Solución yodo-
Cristal violeta Alcohol- acetona Safranina
Lugol
2g Violeta de genciana
2g Yoduro de potasio
20 ml Alcohol etílico 50 ml de alcohol al 0.25g de safranina
1g Cristales de yodo
0.8g Oxalato de NH2 95% 100 ml de agua
100 ml de Agua
100ml de Agua 50 ml de acetona destilada
destilada
destilada

Consideraciones:
La solución yodo- Lugol y safranina deben almacenarse en un frasco ámbar para que la luz no
los afecte. La solución de tinción recién preparada debe filtrarse antes de su uso. En caso de
tinción por el procedimiento de inmersión se recomienda diluir la solución de violeta cristal con
agua destilada en relación 1+4

Procedimiento:
A partir de un cultivo de 18-24 hrs de incubación, preparar un frotis delgado de la
muestra de 1cm x 1 cm. Luego fijar la muestra al portaobjetos, pausándola por la
llama del mechero hasta que se seque, una vez seco voltear el portaobjetos y
pasarlo por la flama 3 veces. La tinción deber ser realizada en un puente y bandeja
de coloración, cubrir el frotis con cristal violeta y dejar actuar el colorante durante 1
minuto. Escurrir el colorante y lavar con agua. Colocar unas gotas de solución yodo-
Lugol y dejar actuar por 1 minuto, terminado el tiempo de actuación, escurrir el
reactivo y lavarlo con un chorro de agua suave. Posteriormente, colocar el frotis en
forma vertical y, usando un fondo blanco, decolorar añadiendo gota a gota la
solución de alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos. El momento exacto para
terminar la decoloración es cuando dejan de fluir “hilos de colorante” por el frotis
(este es el paso critico de la tinción) y lavar inmediatamente con un chorro suave de
agua. Al final, cubrir el frotis con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto, escurrir
el colorante y lavarlo con un chorro suave de agua. Dejar secar al aire. Por último,
observar al microscopio las preparaciones con el objetivo de inmersión.
Interpretación de resultados
Las bacterias Gram positivos se teñirán de morado, mientras que las bacterias Gram
negativas se teñirán de un color rojizo. Streptococcus aureus es un bacilo gram
negativo mientras Streptococcus pyogenes es un coco gram positivo.
Fig. 17. Tinción Gram de S. aureus vista en Fig. 18. Tinción Gram de S. pyogenes vista
microscopio bajo el objetivo de inmersión. La en microscopio bajo el objetivo de inmersión.
coloración purpura indica que es un coco La coloración purpura indica que es un coco
gram positivo gram positivo

VI Protocolo para antibiograma

Antibiograma para la bacteria S. aureus
A partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas tomar varias colonias con un asa
y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al 0.5 de la escala de MacFarland 0.5
en suero fisiológico. Agitar en un agitador "vortex" durante 15-20 segundos. Se
inocula la placa de Muller-Hinton completamente utilizando un hisopo, sin dejar
ninguna zona libre, esto se logra deslizando el hisopo por la superficie del agar,
rotando la placa 90° cada vez y pasándola al final por la periferia del agar para
conseguir una inoculación uniforme. Dejar secar 3 a 5 minutos antes de depositar
los discos. Colocar los discos con pinzas estériles (para esto el diseño del
antibiograma debe estar listo, no deben situarse a menos de 20 mm del borde de la
placa, y distribuidos de manera que no haya superposición de los halos de
inhibición), se debe asegurar que los discos toquen perfectamente con la superficie
del agar, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar.
Incubar de 18-24 horas, transcurrido el tiempo leer el diámetro de las zonas de
inhibición midiéndolo con una regla o vernier. La interpretación de los resultados
deber estar basada en las normas de NCLSI.
Categorías con halos de
Lectura de los
Antibiótico inhibición, valores de Interpretación
halos en mm
referencia en mm
Sensible: ≥ 21
Clindamicina (CC) 30 Sensible
Intermedio: 15-20
 Resistente: ≤ 14
Sensible: ≥ 22
Cefoxitina (FOX) Intermedio: - - Resistente
Resistente: ≤21
Sensible: ≥ 29
Penicilina (P) Intermedio – - Resistente
Resistente: ≤28
Sensible: ≥16
Trimetoprima/
Intermedio: 11-15 30 Sensible
sulfametoxazol (SXT)
Resistente: ≤ 10

Diseño del antibiograma:

Fig. 19. Diseño para colocación de Fig. 20. Resultado de antibiograma

antibióticos para S. aureus. para S. aureus.

De acuerdo con la información reportada en bibliografía el resultado concuerda

con lo esperado para Staphylococcus aureus.
A continuación, se muestra una tabla con la información de los antibióticos
empleados en el antibiograma para Staphylococcus aureus:
Antibiótico Información Evidencia
Clindamicina Lote: 4042284
(CC) Fecha de
caducidad:
28/02/2017

Cefoxitina Lote: 2151022

(FOX) Fecha de
caducidad:
31/12/2014

Penicilina (P) Lote: 2074322

Fecha de
caducidad:
31/03/2014
 Trimetoprima/ Lote: 6295911
sulfametoxazol Fecha de
(SXT) caducidad:
30/11/2019

VII Discusión de resultados

Durante el desarrollo de esta práctica nos enfrentamos con la realización de
técnicas nuevas, exudado faríngeo y nasal, y con ello a cómo tratar al paciente
debido a que estas técnicas llegan a ser algo incómodas, por lo que se debe tener
mayor cuidado con no incomodarlo aún más y sobre todo evitando tocar otras áreas
con la muestra para no contaminar, ya sea la muestra, al paciente y/o uno mismo
debido a que la salud e integridad personal es importante, es suma importancia
utilizar el equipo de protección personal (bata, cubrebocas, guantes y careta) debido
a que a manera de reflejo el paciente puede estornudar o toser y si esta infectado
de algo puede infectarnos a nosotros como los analistas de las muestras. En el frotis
de la muestra de exudado nasal no se encontraron elementos de importancia clínica
de 1-2 leucocitos mononucleares y de 2-4 células epiteliales por campo de
amplificación a 100x, mientras que el frotis de la muestras de exudado faríngeo se
encontraron alrededor de 3-5 células epiteliales, lo que indica que probablemente la
muestra no fue tomada de la mejor manera, es decir, que el hisopo no estuvo en
contacto por el suficiente tiempo para tomar la muestra, es decir, se pasó de manera
muy sutil. Es por esto, que la toma de muestra es fundamental para llegar a un
resultado certero.
Por otra parte, la muestra de exudado nasal fue inoculada en una placa de agar
sangre mediante dilución por estría después de 48 horas de incubación se observó
el crecimiento de 5 colonias sin hemólisis lo que indica que provienen de la
microbiota de la nariz o de los microorganismos que se quedan atrapados en la
mucosa de esta debido a que es una barrera natural de protección de nuestro
cuerpo, lo mismo para las placas de agar sangre y agar sangre y manitol en las que
fueron inoculadas las muestras del exudado faríngeo. Por lo anterior, las pruebas
bioquímicas no se realizaron con estas muestras, si no con las muestras de cepas
otorgadas por la profesora y técnica de laboratorio, Staphylococcus aureus (para
exudado nasal) y Streptococcus pyogenes (para exudado faríngeo). Con ambas
pruebas se realizó una tinción de Gram y prueba de Bacitracina para cual S. aureus
dio resistente y S. pyogenes resultó ser sensible, de forma particular a S. aureus se
sometió a pruebas de coagulasa y catalasa (dando un resultado positivo para ambas
pruebas) y a S. pyogenes se sometió a la prueba de Lacefield para la cual dio
positivo para la identificación de Estreptococos betahemolíticos del grupo A,
también se sometió al antibiótico sulfametoxazol dando como resultado resistente.
S. aureus fue sometida a prueba de susceptibilidad a antibióticos mediante el
método de Kirby-Bauer, se puso a prueba a 4 antibióticos los cuales fueron:
Clindamicina (CC), Cefoxitina (FOX), Penicilina (P) y Trimetoprima/ sulfametoxazol
(SXT), siendo sensible para el primero y último antibiótico, mientras que resultó ser
resistente para el segundo y tercer antibiótico.
Cabe mencionar que se utilizaron reactivos con fecha de caducidad ya vencida, sin
embargo, no se presentaron anomalías reportadas comparadas con la bibliografía
en los resultados obtenidos.
VIII Referencias consultadas
 Gil, Marielsa. (1 de febrero de 2019). Agar sal y manitol: qué es, fundamento,
preparación, usos. Lifeder. Recuperado de https://www.lifeder.com/agar-sal-
y-manitol/.
 Britania. (2009). Discos de Bacitracina. 12/10/21, de Britania Sitio web:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/196_h
oja_tecnica_es.pdf.
 Hato Sano. (2010). Prueba de la Catalasa. 17/09/21, de vivo.colostate.edu
Sitio web: http://www.vivo.colostate.edu/hatosano/topics/catalase.html
 Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. (2010).
Procedimientos Básicos en la Toma de Muestras Biológicas para
Diagnóstico. 04/04/2022, de Instituto de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos Reacción positiva se indica mediante grumos rojos sobre un
fondo verde, visibles a simple vista. La intensidad de la aglutinación y el
tiempo de aparición dependen de la cepa analizada., arrojando resultado
positivo para S. pyogenes grupo A. P á g i n a | 27 Sitio web:
http://www.cenaprece.salud.gob.mx/programas/interior/emergen cias/descar
gas/pdf/procedimientos_basicos_toma_muestras_finales.pdf
XIX Datos del equipo que presenta

Dulce Bibiana Acosta Ana Raquel Gutiérrez Cynthia Donají Negrete

Olvera Martínez Palacios