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Informe de Prácticas: Guía de Enteroparásitos

Informe de Prácticas: Guía de Enteroparásitos

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Prácticas desarrolladas en el curso de Parasitología Clínica sobre
enteroparásitos. Protozoarios y Helmintos.
Prácticas desarrolladas en el curso de Parasitología Clínica sobre
enteroparásitos. Protozoarios y Helmintos.

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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Informe de Prácticas: Enteroparásitos
ASIGNATURA : Parasitología Clínica DOCENTE : Mblga. M. Teresa Silva García ALUMNO : Rómulo Aycachi Inga

CICLO

: 2008 - I

Lambayeque, junio del 2008.

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PARASITOLOGÍA CLÍNICA
PRACTICA Nº 01
Introducción a la Parasitología Clínica y Técnicas de Diagnóstico de Enteroparasitosis TÉCNICAS COPROSCOPICAS: Examen Directo
1. Introducción:

Normas de Bioseguridad
• • • • • • • • • • • • • • • • • Prohibir el ingreso al laboratorio a personas que no guarden las medidas de bioseguridad. Ingresar al laboratorio obligatoriamente con guardapolvo. Utilizar mascarillas y guantes, cuando sea necesario, según el tipo de trabajo. Desarrollar el hábito de mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara, para evitar la autoinoculación. Descontaminar las superficies de trabajo por lo menos una vez antes de todo trabajo y cuando se produzca cualquier salpicadura de material infeccioso. Autoclavar todo material infeccioso antes de ser eliminado. No pipetear con la boca sustancias contaminadas con agentes infecciosos y/o químicos. No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicarse cosméticos dentro del laboratorio. Considerar todas las muestras como potencialmente infecciosas para evitar el posible contagio. Lavarse las manos antes y después de realizar cualquier trabajo, sobre todo después de haber manipulado material infeccioso. Realizar cuidadosamente todos los procedimientos para evitar la formación de aerosoles, sobre todo en el momento de efectuar siembras, aislamientos e identificaciones microbianas. Evitar molestar en el laboratorio con sonidos o conversaciones de alto volumen. Desinfectar el área de trabajo antes y después de cada actividad diaria, con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinectante, dejándolo actuar durante 30 minutos Tomar las muestras de sangre se deben utilizando jeringas y agujas descartables. No volver a tapar la aguja con el capuchón de plástico. En caso de hacerlo utilizar los métodos alternativos. Emplear los materiales en buen estado (sin rajaduras). Mientras no sea posible hacer la descontaminación de muestras en el propio laboratorio, colocar el material contaminado en cajas de metal con 2

• • • • • • • • • • • •

tapa. No acumular inadecuadamente material contaminado por más de 12 horas. Verificar que el material infeccioso por descartar sea fácilmente identificable como tal y se esterilice lo antes posible. Colocar horizontalmente el material de vidrio reusable (pipetas, láminas portaobjetos, etc.) en un depósito con mezcla sulfocrómica y esterilizarlo al final de la jornada de trabajo. Trapear los pisos diariamente, con un paño limpio y solución desinfectante. Almacenar los medios de cultivo, kits de diagnóstico y colorantes en sus envases unitarios originales y con las etiquetas firmemente adheridas al envase. Manipular cuidadosamente las láminas portaobjetos, a fin de evitar cortes o abrasiones en la piel. Limpiar con paños adecuados los lentes (oculares y objetivos), para evitar contagio con agentes infecciosos. En el transporte, utilizar recipientes primarios de vidrio con tapa rosca dentro de los cuales se coloca la muestra. Emplear un recipiente secundario que contenga material absorbente entre él y el recipiente primario, de manera que pueda absorber todo el líquido de la muestra en caso de fuga. Colocar una envoltura exterior para proteger el recipiente secundario de las influencias exteriores durante su transporte. Sellar firmemente todas las bocas de los recipientes con cinta adhesiva, para transportar el material biológico. No colocar los recipientes de transporte dentro de bolsillos de casacas, bolsos o mochilas de uso personal. Realizar el transporte del material biológico en el menor tiempo posible.

2. Objetivos: Recolección correcta de muestra. Análisis correcto de la muestra. Conocer y aplicar los diferentes métodos de examen microscópico. Diferenciar un parásito de un pseudoparásito. Conocer y diferenciar algunas estructuras parasitarias.

3. Materiales y métodos: 3.1. Materiales: - Láminas - Laminillas - Lugol parasitológico - Microscopio 3.2. Métodos: Requisitos para la toma de muestras de heces: - Muestras de heces frescas: o Sirven las heces recién emitidas y evacuadas espontáneamente. o Deben recogerse en un recipiente limpio y seco. 3

o No debe mezclarse con orina. o En los lactantes se recomienda tomar la muestra de heces directamente del pañal o estimular la evacuación mediante una sonda rectal. o Debe transcurrir el menor tiempo posible entre la toma de muestra y el examen de la misma. o Debido a la eliminación irregular de los elementos parasitarios, el examen parasicológico de una sola muestra de heces puede ser insuficiente. Muestras de heces preservadas: o Para evitar la descomposición de la materia fecal y conservar los elementos parasitarios se utilizan diversos compuestos preservadores o fijadores. o Las mas frecuentemente usadas son:  Formalina en solución acuosa al 5 ó 10% en solución acuosa.  Formosal al 5% compuesto por una solución acuosa al 2% de folmoldehído y NaCl al 0.5%.  El MiF (Merthiolate Yodo Formalina) que además colorea las muestras.  El PAF (Fenol-Alcohol-Formalina).  El SAF (Acetato de Na-Ac. Acético-Formalina).  PVA (Alcohol polivinílico).  Fijador de Shaudinn.

Examen de heces en el Laboratorio: Examen Macroscópico: Donde se observan las características de las heces como: o o o o o Olor Color Consistencia (Líquida, Sólida, Semisólida, Pastosa). Aspecto (presencia de mucus, sangre). Presencia de nemátodos adultos (áscaris, oxyurus), anillos de tenias, larvas u otros.

Examen Microscópico: En general se emplean dos métodos: o Método directo:  Este método permite observar formas vegetativas de protozoarios (trofozoitos de amebas) y ooquistes de coccideas.  Es útil en las necropsias, para analizar el contenido intestinal. 4

Cuando al agregado se le agrega 1 gota de lugol débil, se destruyen los trofozoitos y se observa los quistes.

o Método de enriquecimiento o concentración:  Sirve para concentrar las formas parasitarias (huevos, larvas) en las heces, de manera que puedan ser diagnosticadas, aún cuando existan pequeñas cantidades de huevos.  Pueden ser: Cualitativos (métodos de flotación, métodos de sedimentación) o cuantitativos (Método de cámara de Mc Master, Método de Stoll). Elementos que se pueden observar en un análisis coprológico - Pseudoparásitos: o Residuos vegetales: gránulos de almidón y espículas, granos de polen, esporas de hongos, células vegetales. o Grasas y cristales. o Burbujas de aire. o Huevos y larvas de parásitos de vida libre. - Parásitos: o Huevos de parásitos. o Ooquistes y quistes de protozoarios. o Larvas de parásitos. 4. Resultados (Observaciones):

Huevo Trichuris trichura

Huevo Ascaris lumbricoides

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Ooquiste de Isospora

Quiste de Giardia

Huevo de Diphylobotrium sp. 5. Cuestionario: ¿Cuáles son las características de las heces en cantidad, color, olor y número de evacuaciones? o De manera normal, las heces son de color marrón, tiene un olor sui géneris (tienen la configuración del recto), tienen una consistencia blanda (aprox. 75% de agua). o La cantidad y el número de evacuaciones está dada por el estilo de vida de cada individuo, por lo general, es normal evacuar de 2 a 3 veces al día. La cantidad varía según la alimentación: con régimen cárnico, de 50 a 100 g/24 h; con régimen vegetariano, de 250 a 400 g; finalmente, en régimen mixto, de 100 a 200 g. Todo ello por día y en una sola deposición.

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¿A qué se debe el color y olor de las heces? o El color está dado por la estercobilina y la urobilina, derivadas de la bilirrubina, pigmento amarillo de la bilis. Los alimentos y los medicamentos pueden afectar el color de las heces. o El olor de las heces está dado por el escatol (3-metil-indol), que es un subproducto que se obtiene de la ruptura de la hemoglobina que entra en el intestino a través de la bilis. Aunque el olor de las heces también está dado por la dieta consumida y puede ser alterada en algunos tipos de infecciones.

6. Referencias: Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile. Manual de toma de muestras para estudio Bacteriológico, Parasicológico y Micológico. 2004. Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de Clínicas. Montevideo. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf Arévalo T., W. y otros. 2005. Manual de Prácticas de parasitología. Laboratorio de Parasitología Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. Atlas de parasitología. 2007. obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.pediatriatropical.com/imagenes%20tropicales%20full/fotos%2 0protozoarios/Protozoarios%20intestinales/Giardia%20lamblia/Giardia% 20lamblia%20quiste%20100x.JPG Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf

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PRACTICA Nº 02
Métodos de Concentración por Sedimentación
1. Introducción: El diagnóstico de laboratorio de la parasitosis intestinal requiere de profesionales y personal especializado para realizar la identificación correcta de las estructuras parasitarias que se localizan a nivel intestinal aplicando criterios morfológicos, así como las precauciones para la toma de muestras y su procesamiento en el laboratorio. Las técnicas de diagnóstico de enteroparasitosis pueden ser parasitológicas, porque recuperan e identifican directamente al parásito ó serológicas, por detectar la reacción inmune del hospedero frente al parásito. El examen parasitológico de heces conocido como examen coproparasitario, es un conjunto de técnicas diagnósticas que constituyen la indicación metodológica para la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis causadas por protozoarios o helmintos. La indicación de un examen coproparasitario, debe tener en cuenta las características del cuadro clínico que presenta el paciente, y debe atender al parásito que se sospecha, teniendo como premisa que esta metodología es útil para protozoarios y helmintos, cuyas formas evolutivas (trofozoítos, quistes, ooquistes, huevos, larvas, adultos) se emiten con las materias fecales. Para obtener resultados satisfactorios de un examen coproparasitario, debe cumplir con los siguientes requisitos: 1) Solicitud de Examen coproparasitario. 2) Preparación del paciente. 3) Muestra correctamente obtenida. 4) Muestra seriada (3 muestras mínimas de materia fecal). La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos. Se concentra bien estas formas y se elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma. La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en los métodos de flotación. 2. Objetivos: Se pretende que el estudiante conozca y aplique las diversas técnicas de sedimentación que permiten concentrar las estructuras parasitarias en una muestra. 8

3. Materiales y Procedimientos: a. Materiales: Muestras de heces Láminas portaobjeto y láminas cubreobjeto Baguetas Copas para sedimentación Pipetas Pasteur Coladeras b. Procedimientos: El método de concentración por sedimentación se fundamenta en la precipitación de huevos y quistes de parásitos, cuando estos se encuentran en soluciones de menor densidad. • Técnica de Baerman Modificada en Copa por Lumbreras: • Homogenizar la muestra de heces. Acondicionar una copa para sedimentación con una coladera, rejilla o embudo sobre la que se coloca una gasa doblada. Colocar 5 -10 g. de heces sobre la coladera con la gasa. Verter por las paredes de la copa, solución salina a 37°C, hasta cubrir las heces. Dejar en reposo a temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Retirar la coladera con las heces, eliminar el sobrenadante y extraer el sedimento utilizando una pipeta Pastear. Observar el sedimento al microscopio con los objetivos de menor aumento. Esta técnica es apropiada para la observación de larvas de Strongyloides y trofozoitos de Balantidium, entre otros. También puede emplearse utilizando como muestra esputo, en casos sospechosos de Strongyloides. Emulsionar una muestra de heces en 10 a 20 volúmenes de agua de caño. Filtrar el preparado a través de un colador, hacia una copa cónica y completar con agua el volumen de la copa. Dejar en reposo durante 10’. Eliminar el sobrenadante volver a completar el volumen con agua. Repetir el paso anterior por 3 ó 4 veces. Extraer el sedimento con una pipeta y observar al microscopio entre láminas y laminilla. 9 Gasa Lugol Solución salina fisiológica Formol 10% Éter

Técnica de Sedimentación Rápida: -

Técnica de Sedimentación por Centrifugación:

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Emulsionar la muestra de heces en agua ó S.S.F. Filtrar a través de un colador. Colocar el filtrado en un tubo de centrífuga y centrifugar a 2,000 rpm durante 2 minutos. Eliminar el sobrenadante, agregar agua y volver a centrifugar. Esto puede repetirse hasta que el líquido sobrenadante sea transparente. Observar el sedimento al microscopio. Emulsionar la muestra de heces en agua corriente. Homogenizar y filtrar la muestra a través de un colador hacia una copa cónica. Agregar agua corriente hasta completar su capacidad. Dejar en reposo por 24 horas. Eliminar el sobrenadarme. Con una pipeta Pasteur, tomar una parte del sedimento y observar al microscopio Homogenizar 2.5 g de heces con 10 - 20ml de solución salina fisiológica. Verter la mezcla en un tubo cónico de centrifuga de 50 ml de capacidad filtrándola a través de gasa. Completar el volumen del tubo con más solución salina y tapar el mismo herméticamente. Agitar y dejar reposar por 45 minutos, como mínimo. Tomar con una pipeta dos alícuotas: una de la mitad del sedimento y otra del fondo del tubo, colocarlos en portaobjetos diferentes y a la alícuota del fondo agregarle gotas de lugol, luego cubrirla con laminilla. Observar al microscopio.

Técnica de Baerman Modificada: -

Técnica de Sedimentación Espontánea en Tubo (Ref. Dr. Raúl Tello): -

Técnica de Enriquecimiento por Sedimentación: Soluciones empleadas: o Solución fisiológica formolada (Solución A) → (s.s.f. 90 mL) o Formol comercial (10 mL) o Solución cítrica formolada (Solución B) → (Ácido cítrico 12 g) o Formol comercial (2 mL) o Agua destilada 2 (mL) o Éter

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Diluir una porción de heces en la solución A. Filtrar a través de un embudo con gasa (o colador) y recoger el filtrado en tubos de centrífuga. Centrifugar por 5 minutos a 2,000 rpm. 10

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Eliminar el sobrenadante y agregar al sedimento la solución B; hasta los 2/3 partes de tubo y luego 1 ó 2 ml de éter. Agitar el tubo y centrifugar un minuto. Agitar el tubo con una bagueta y volver a centrifugar por un minuto. Eliminar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio. • Técnica de Ritchie o Centrifugación con Formol – Éter: Mezclar una pequeña porción de materia fecal en unos 10 mL de formol – salina al 10% en un tubo o frasco. Filtrar la suspensión a través de un colador con gasa. Vaciar unos 6 mL del filtrado en un tubo de centrífuga. Agregar unos 3 ml de éter (el éter nunca debe usarse cerca de un mechero). Mezclar bien por inversión del tubo y centrifugar a 3,000 rpm durante un minuto. Al centrifugar el contenido del tubo se divide en cuatro capas, en la siguiente forma: o Una capa superior de éter o Una copa intermedia de partículas de materia fecal o Una capa inferior de formol o El sedimento donde se en-Mitrarán los parásitos Con una bagueta o palillo separar la capa media de las paredes del tubo y vaciarla junto con el éter y el formol. Resuspender el sedimento golpeando el fondo del tubo con el dedo y transferir con una pipeta Pasteur a una lámina y cubrir con laminilla. Observar al microscopio usando lugol.

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4. Resultados (observaciones): Técnica de Baerman Modificada por Lumbreras

Dejar en reposo 30 a 45 min

Homogenizar la muestra

En la coladera agregar la muestra y verter SSF a 37º hasta cubrirla Observar Eliminar sobrenadante

Huevo de Ascaris

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Técnica de Ritchie o Centrifugación con Formol – Éter:

De la soluc. filtrada anteriormente vaciamos a un tubo una pequeña cantidad

Luego agregamos 2/3 partes de formol y 1/3 de éter (en este caso xilol)

Mezclar por inversión

Centrifugar a 3000 rpm x 1 min.

Eter

Tubo, después de la centrifugación
Restos Líp. disueltos

Se elimina el sobrenadante y se observa el sedimento al microscopio

Formol

Se observó huevos de Hymenolepis

Sedimento Parásitos

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Técnica de sedimentación rápida:

Dejar reposar por 10 min.

Emulsionar la muestra en 10 a 20 vol. de agua de caño Repetir los pasos anteriores (x 2 veces más)

Filtrar el preparado y completar el vol. con agua

Observar

Eliminar sobrenadante

Huevo de Ascaris

5. Referencias: Apuntes varios. 2008. Diagnostico de Laboratorio de las Enteroparasitosis. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en www.unav.es/bioquimica/analisisbiologicos/archivos/bactypara/para0506t ema3web.ppt Atias, A. 1996. Parasitología Mediterráneo. Santiago de Chile. Médica. Publicaciones Técnicas

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Coproparasitoscopia: Concentración por sedimentación. 2006. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.uacj.mx/icb/manuales/mparasi/P8%20Copro%20Sediment.pdf Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf

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PRACTICA Nº 03
Métodos de Concentración por Flotación
1. Introducción: Las parasitosis intestinales pueden sospecharse por la presencia de sintomatología y datos epidemiológicos, pero la única forma de confirmar el diagnóstico es la demostración del parásito en cualquiera de sus formas evolutivas: diagnóstico parasitológico. Este se fundamenta en el conocimiento de la biología del parásito: hábitat, ciclo evolutivo, lo que permite tomar la muestra biológica y la técnica de laboratorio adecuada. El examen parasitológico de las heces: coproparasitología, tiene como objetivo diagnosticar los parásitos intestinales. Se han descrito muchas técnicas de examen de heces, algunas de ellas son de utilidad general, mientras que otras sólo sirven en casos muy concretos, de modo que se elige la más adecuada para un determinado tipo de muestra o para la detección de un determinado parásito. La consistencia de una muestra de heces es de gran importancia, indicando el tipo de organismo que puede contener. A de examinarse toda la superficie de la muestra en busca de parásitos macroscópicos. Con frecuencia pueden verse los oxiuros en la superficie de la muestra de heces, del mismo modo que las proglótides. El examen inmediato de las heces completamente formes no es tan importante, pero han de mantenerse refrigeradas. La efectividad de la técnica depende de varios factores: sensibilidad, especificidad, calidad de los equipos y reactivos utilizados, adecuada ejecución y experiencia del operador. 2. Objetivos: Se espera que el estudiante conozca y aplique las diversas técnicas de flotación para concentrar parásitos.

3. Materiales y Procedimientos: a. Materiales: Muestra de heces Laminas portaobjeto y lamina cubreobjeto Baquetas Pipetas Pastear Copas Tubos Solución, saturada de sal Solución saturada de azúcar Solución salina fisiológica Lugol Sulfato de Zinc

b. Procedimientos: El método de concentración por flotación se fundamenta en la separación de las estructuras parasitarias mediante el empleo de soluciones de densidad intermedia, que permite la flotación de 14

huevos y/o quistes y la sedimentación de restos fecales. Este método no es conveniente para la obtención de trofozoitos y larvas de nemátodes cuyas estructuras se alteran por la solución que emplean. • Técnica de Willis – Molloy (Sol. Satur. Sal al 38%): Esta técnica requiere solución saturada de sal, la cual se obtiene mezclando 38g de sal de cocina en 100 ml de agua caliente o calentar la mezcla a fin de homogenizarla. Desmenuzar con la ayuda de una baqueta 1 ó 2 g de heces en un tubo de ensayo o en un frasco vacío (vial) que contenga aproximadamente 4 mL de solución saturada de sal. Adicionar la misma solución hasta formar un menisco sobre el borde del tubo o frasco. Cubrir el menisco del tubo o frasco con una laminilla evitando la formación de burbujas. Dejar en reposo durante 15 a 20 minutos para que los huevos y quistes de parásitos floten y se adhieran por viscosidad a la laminilla. Depositar una gota de lugol en una lámina portaobjetos y sobre ella colocar la laminilla. Observar al microscopio. Técnica de Flotación con Solución Azucarada (Sheather's): Emulsionar 2 – 5 g de heces en 10 mL de agua. Homogenizar y filtrar a través de un cernidor. Transferir el filtrado a un tubo de centrifuga hasta alcanzar 113 de tubo llenando las 2/3 partes restantes con agua. Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 a 5 minutos. Eliminar el sobrenadarte (estos lavados pueden repetirse). Agregar al sedimento (1/3 del tubo), 2/3 parte de solución saturada de azúcar. Centrifugar durante 5 minutos a 1,500 rpm. Con una bagueta o un asa bacteriológica tornar 2 o 3 gotas de la superficie y colocarla en una lámina portaobjeto agregarle lugol, cubrirla con una Iaminilla y observar al microscopio. Para preparar la solución saturada de azúcar hay que mezclar 38g de azúcar en 100 ni de agua. Técnica de Faust: Esta técnica utiliza sulfato de Zinc al 33% (33 g de sulfato de zinc en 100 mL de agua tibia) densidad 1:180 (verificar con 15

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densímetro) si es preciso se añadirá agua o sulfato según el caso hasta obtener este valor. Emulsionar un volumen de heces en 10 volúmenes de agua. Filtrar a través de un colador con gasa y recibir el filtrado en un tubo de centrífuga. Completar con agua y centrifugar a 1,500 rpm durante dos minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar unas cuantas gotas de agua para romper el sedimento y homogenizar. Repetir la centrifugación agregando agua hasta que el sobrenadarte este transparente. Agregar al sedimento sulfato de zinc hasta la superficie superior y centrifugar por dos minutos a 1,500 rpm. Torrar con una baqueta o asa bacteriológica la muestra de la superficie del tubo en el cual se ha formado una película clocarla en una lámina portaobjetos, agregarle lugol, una laminilla y observar al microscopio.

4. Resultados (observaciones): Técnica de Willis – Molloy:

Dejar en reposo x 15 a 20 min.

Del filtrado se adiciona una pequeña porción + la sol. sat. de sal

Adicionar hasta forma un menisco, luego cubrirlo con una laminilla

Observar al microscopio

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Técnica de Sheather’s (flotación por solución saturada):

Agua Eliminar sobrenadante Filtrado Centrifugar 2 a 5 min.

Repetir procedimiento una vez más

Observar al microscopio

Centrifugar x 2 a 5 min. y luego eliminar sobrenadante

Después de eliminar sobrenadante, agregar la soluc. azucarada

Huevo de Taenia

5. Referencias: Apuntes varios. 2008. Diagnostico de Laboratorio de las Enteroparasitosis. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en www.unav.es/bioquimica/analisisbiologicos/archivos/bactypara/para0506t ema3web.ppt Atias, A. 1996. Parasitología Mediterráneo. Santiago de Chile. Médica. Publicaciones Técnicas

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Técnicas coproparasitológicas: Directo, Willis, Kato, Kato Cuantitativo, Faust, Coloración Rápida. Morfologia de Cestodes. 2007. Universidad de los Andes. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://usuarios.lycos.es/paraelsa/manual04/practica-6.htm Arévalo T., W. y otros. 2005. Manual de Prácticas de parasitología. Laboratorio de Parasitología Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 17

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Técnica de Faust:

Agua Eliminar sobrenadante Filtrado Centrifugar 2 a 5 min. Centrifugar x 2 a 5 min. y luego eliminar sobrenadante

Repetir procedimiento una vez más

Película superficial

Después de eliminar sobrenadante, agregar el sulfato de Zinc Observar al microscopio

Sulfato de cinz

Sedimento

Huevo de Hymenolepis

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PRACTICA Nº 04
Diagnóstico de Enterobiosis u Oxyuriosis
1. Introducción: Enterobius vermicularis es conocido como oxiuro y causa una enfermedad intestinal conocida como oxiuriasis o más específicamente enterobiasis. Los oxiuros son parásitos que se encuentran distribuidos por todo el mundo y es el helminto más común de América, infectando principalmente a niños menores de 12 años y en muchas ocasiones a hombres que tienen sexo con otros hombres o lo adquieren en la ingestión de verduras contaminadas. El ciclo vital de Enterobius vermicularis está restringido exclusivamente al humano. Este parásito vive en promedio un par de días. El macho mide 2-3 mm, la hembra es más grande, llegando a alcanzar los 15 mm . El organismo no soporta las condiciones secas de la intemperie y muere casi inmediatamente, al ser sacado de su hábitat normal. Tanto la hembra como el macho habitan en el colon o intestino grueso donde ocurre el apareamiento. En la noche la hembra emigra hacia los pliegues anales y región perianal donde deposita miles de huevecillos fertilizados. En las siguientes 6 horas los huevecillos progresan a larvas y se vuelven infestantes. La contaminación por los huevecillos ocurre cuando éstos son acarreados a alimentos u utensilios de cocina, o bien directamente a la boca (fenómeno conocido como reinfestación) después de haberse rascado la piel o cuando se practica anilingus. Los huevecillos ingeridos se incuban en el intestino delgado donde son liberados y se desarrollan a gusanos adultos desplazándose hacia el colon. Aunque puede haber alteraciones gastrointestinales por la presencia del gusano en la cavidad intestinal, el prurito anal es el síntoma más destacado. Además el rascarse frecuentemente puede provocar escoriación en el área y dar origen a una infección bacteriana secundaria. También provoca insomnio, falta de atención y bruxismo (rechinamiento de dientes). El diagnóstico en el laboratorio de la presencia de oxiuros se efectúa por la recuperación de los huevecillos de la piel anal y perianal mediante el uso de la técnica de la cinta adhesiva a través de la cual se pueden observar al microscopio. Al contrario de otros nemátodos intestinales, los huevecillos de los oxiuros no se encuentran en la heces mientras que los gusanos adultos pueden aparecer en las heces o bien aparecer en la cinta adhesiva al momento del examen si el momento coincide con la deposición de huevecillos de la hembra en la zona anal y perianal. 2. Objetivos: Se pretende que el estudiante conozca la técnica especifica de diagnóstico de Enterobius vermicularis.

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3. Materiales y Procedimientos: a. Materiales: Laminas portaobjetos Cinta engomada Microscopio

b. Procedimientos: El diagnóstico de oxyuriasis se fundamenta en el hallazgo de huevos de Enterobius en la región perianal o de nemátodes adultos en las heces, ropa interior, ropa de cama etc. El momento más adecuado para tomar la muestra durante la noche es después de 2-3 horas que el niño se haya acostado para dormir o en el caso de que la muestra se tome en el laboratorio a primeras horas de la mañana.  Técnica de Graham o Prueba del Parche: La recolección de la muestra se efectúa mediante una lámina portaobjeto a la cual se le aplica longitudinalmente un pedazo de cinta engomada a todo lo largo de la lámina, dejando un sobrante para fijar un papel en blanco, donde se anotará el nombre de la persona, edad, sexo. La técnica se realizará de la sgte. manera: 1. Despegar la cinta del porta y darle vuelta al extremo del porta, de forma que la cara adhesiva quede expuesta por ambas caras (Figuras 1 y 2). 2. Cuidadosamente separar los glúteos con una mano y con la otra presione la zona perianal con la cinta varias veces, tanto en la zona izquierda como en la derecha de los pliegues (Figuras 2 y 3). 3. Vuelver a colocar la cinta adhesiva a lo largo del portaobjetos con la cara adhesiva contra la superficie del mismo. 4. Introducir los portas en un sobre y llevarlos al laboratorio para su observación. Observar al microscopio a menor aumento, para apreciar los huevos característicos larvados o con segmentación avanzada. Después de practicada la lectura de la muestra deben depositarse las láminas usadas en solución desinfectante para su posterior empleo.

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4. Resultados (observaciones):

Huevos de Enterobius en cinta adhesiva 5. Referencias: Clinica Rotger. 2007. Test de Graham: deteccion de huevos de Enterobius vermicularis. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.clinicarotger.es/doc/atelab/doc07.htm Arévalo T., W. y otros. 2005. Manual de Prácticas de parasitología. Laboratorio de Parasitología Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria. UNPRG. Lambayeque. Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile. Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf

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PRACTICA Nº 05
Diagnóstico de Cryptosporidium y Cyclospora
1. Introducción: Cryptosporidium es un parásito protozoario perteneciente a la familia de los coccidios. Es un nuevo agente patógeno humano, asociado con enteritis severa y quizácon colitis en pacientes inmunocomprometidos y diarrea autolimitada en el hospedero inmunocompetente. Aunque la prevalencia de la enfermedad en el humano no es conocida, los recientes estudios sugieren que es una causa común de diarrea en el mundo, particularmente en la gente joven. La forma diagnóstica en material fecal de Cryptosporidium corresponde a la forma de ooquiste, que aparece como una estructura esférica o ligeramente ovoidal que mide de 4 a 6 micras de diámetro. Cuando se observa con microscopía de contraste de fases se ve que poseen una deble pared y una estructura interna formada por 4 esporozoitos vermiformes y cuerpos residuales que no son claramente visibles. Pueden observarse varios tipos de ooquistes: oosquistes no esporulados y ooquistes esporulados, en los cuales en muchos casos es posible observar los esporozoitos como líneas transversales claras y el cuerpo residual como una mancha oscura excéntrica cuando están teñidos con Zielh-Neelsen modificado. Cyclospora cayetanesis es un coccidio intestinal de reciente descripción, productor de diarreas y de procesos extraintestinales en el hombre. La primera descripción de este organismo fue realizada por Ashford quién observó, en las heces de tres pacientes de Papúa-Nueva Guinea, la existencia de unos elementos esféricos, algunos de ellos esporulados y con cuatro esporozoítos, lo que le sugirió que podría tratarse de una nueva especie del género Isospora. La asociación entre la presencia en las heces de unos organismos esféricos de unos 8-10 μm de diámetro y la aparición de unos cuadros diarreicos explosivos fue posterior, y se pensó que dichos elementos podrían ser los ooquistes de un nuevo coccidio patógeno para el hombre. La aparente forma quística de este nuevo organismo y su característica ácidoalcohol resistencia sugirieron que podría tratarse de un protozoo flagelado intestinal o de una nueva especie del género Cryptosporidium, respectivamente. Sin embargo, la observación de estructuras internas similares a los cuerpos tilacoides, típicos de las cianobacterias, determinó su denominación como “CLB” (cyanobacterium-like-body). El tamaño de los CLB, las características de su esporulación cuando se incuban en dicromato potásico, y la liberación de células ultraestructuralmente similares a los esporozoítos de los coccidios intestinales, permitieron incluir a estos organismos en el género Cyclospora y la creación de una nueva especie, Cyclospora cayetanensis, en honor a la Universidad Cayetano Heredia (Lima, Perú), lugar donde se habían realizado los estudios iniciales. 2. Objetivos: 1. Se pretende que el estudiante conozca la técnica de coloración para el diagnóstico de Cryptosporidium, Cyclospora e identifique al parásito.

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3. Materiales y Procedimientos: a. Materiales: Muestras de heces colectadas por los estudiantes. Láminas preparadas positivas a Cryptosporidium y cyclospora. Láminas portaobjeto, baquetas. Metanol NaOH 1N Carbol Fucsina Alcohol de ácido Azul de metileno Microscopio

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b. Procedimientos: Para el diagnóstico de Cryptosporidiumn y/o cyclospora se utiliza la técnica de KINYOUN o de Ziehl Neelseen modificada. Coloración de Kinyoun: Hacer un extendido de la muestra de heces en láminas previamente desengrasadas y secar a temperatura ambiente. Fijar con Metanol durante 5 minutos. Agregar NaOH 1 N durante 1,5 minutos. Colorear con carbol fucsina durante 5 - 10 minutos Decolorar con alcohol ácido. Colorear con azul de metileno Realizar las observaciones al microscopio, utilizando el objetivo de inmersión y el aceite de cedro. Los ooquistes de Cryptosporidium y Cyclospora se observan de color rojo, por ser ácido alcohol resistentes

4. Resultados (observaciones):

Ooquiste de Cyclospora 23

Ooquiste de Cryptosporidium 5. Referencias: Cryptosporidium. 2007. Aspectos generales. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lqf/hinojosa_s_le/capit ulo6.pdf García, A. y otros. 2007. Cyclospora y ciclosporosis. Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina y Hospital Clínico Universitario. Valencia. Obtenido el 01 de setiembre de 2008 en http://www.seimc.org/control/revi_para/Cyclospora.htm Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile. Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf

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PRACTICA Nº 06
Reacción Inflamatoria y Diferenciación Celular
1) Introducción: Los procesos inflamatorios se caracterizan por el reclutamiento y activación de “células inflamatorias”, constituidas por leucocitos, macrófagos y linfocitos que se desplazan atraídas por citoquinas pro-inflamatorias y se concentran en sitios donde existe injuria tisular. Diversos agentes de naturaleza física, química o biológica pueden provocar alteraciones en algunas de las estructuras hepáticas desencadenando señales de peligro que son captadas por el sistema inmunológico y hematológico. Las citoquinas pro-inflamatorias son sintetizadas y secretadas por casi todos los tipos de células. La cascada de citoquinas a nivel del hígado determina de primera intención la expresión de moléculas de adhesión en las células endoteliales de los sinusoides. Las moléculas de adhesión permiten que leucocitos, linfocitos y macrófagos, se adosen al endotelio y se active la diapédesis, lo que les permite la migración transvascular y su desplazamiento hacia el foco inflamatorio. Las células inflamatorias constituyen un verdadero ejército organizado, dotado de poderoso armamento, con capacidad para identificar al agente causal, capturar y destruir virus, bacterias, parásitos y células hepáticas infectadas o lesionadas. La comunicación entre estas células se realiza mediante citoquinas provenientes sobre todo de los linfocitos T CD4 ayudadores que comandan el proceso. Una vez desencadenado, el proceso inflamatorio provoca daño tisular, que por lo general afecta no solo a las células blanco, si no que puede también lesionar a células adyacentes inocentes. Los procesos inflamatorios hepáticos traen como consecuencia dos fenómenos fundamentales en la patogenia hepática: la muerte de los hepatocitos y la fibrogénesis. En la práctica, las enfermedades parasitarias son muy útiles por permitir la observación, de manera muy gráfica, de todas las variantes del proceso inflamatorio y aun de sus secuelas. Hay algunos hechos curiosos en patología parasicológica. Usualmente en la inflamación se busca la presencia de exudado, con determinado tipo de células predominantes; sin embargo, en la hepatitis o encefalitis palúdica, se sabe que no hay reacción leucocitaria en el tejido: solo se observa al componente alternativo y algunos trastornos circulatorios, como el edema. Es muy fácil demostrar en muchos casos, como en la amebiasis hepática o en la toxoplasmosis encefálica, que es el parásito, como ente extraño, el que desencadena el proceso inflamatorio; pero hay situaciones, como sucede a veces en la miocarditis chagásica y en la toxoplásmica, especialmente en las formas crónicas, en que cerca de una colonia de parásitos no se aprecia reacción inflamatorio; en cambio, ésta puede ser importante lejos del sitio en que el parásito está, lo que hace suponer que está, lo que hace suponer que hay sustancias antigénicas, producidas por el parásito, que provocan reacción a distancia. Los tipos de exudado también suelen variar: puede ser purulento, como en las colangitis por ascaris, por esquistosoma o pro fasciola y en la meningitis producida por larva de Dermatobia hominis. Puede haber exudado 25

hemorrágico, como en la colitis balantidiana, pleuropulmonar y en la estrongiloidosis. 2) Objetivos: -

en

la

paragonimosis

El propósito de la práctica es que el estudiante establezca la diferencia en el laboratorio entre la infección intestinal que ocasiona diarrea infamatoria y la no inflamatoria. Esta diferencia puede establecerse determinando la presencia de Leucocitos en materia fecal. Los Leucocitos se encuentran asociados a moco y su presencia indica una diarrea tipo inflamatoria lo cual sugiere infección por Shiguella, Salmonella, E. histolytica (generalmente destruidos). Las diarreas no inflamatorias (sin leucocitos) son características de Vibrio cholerae, rotavirus, Giardia, entre otros. En cuanto a la diferenciación celular los polimorfonucleares predominan en shiguellosis, colitis invasiva y ulcerativa. Los mononucleares se encuentran en mayor proporción en fiebre tifoidea.

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3) Materiales y Procedimientos: a) Materiales: Muestra fecal Laminas portaobjetos y cubreobjetos Colorante azul de metileno Colorante Wright Aceite de Cedro Microscopio

b) Procedimientos: Colocar una pequeña porción de materia fecal sobre una lámina portaobjeto, agregarle una gata de azul de metileno, cubrirla con una laminilla y observar al microscopio en busca de leucocitos. Hacer una extensión de materia fecal sobre una lámina portaobjeto dejar secar y colorear con wrigth. Observar al microscopio polimorfonucleares. y diferenciar entre mononucleares y

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Para un estudio cuantitativo contar 200 células con objetivo de 40x. La interpretación es la siguiente: o Positivo + : menos de 10 leucocitos /campo. o Positivo ++ : de 10 a 30 leucocitos/campo. o Positiva +++: más de 30 leucocitos/campo

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La diarrea inflamatoria podría estar causada por especies como Shigella, Salmonella, Entamoeba hystolitica; y las diarreas no inflamatorias podrían estar causadas por especies como Vibrio, Giardia, Rotavirus. En la diferenciación celular hay que observar si hay prevalencia de Polimorfonuclares (shigelosis, colitis invasiva) o de Mononucleares (salmonelosis).

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1. Resultados (observaciones):

2. Referencias: Atias, A. 1996. Parasitología Mediterráneo. Santiago de Chile. Médica. Publicaciones Técnicas

Garassinni, M. 2008. Inflamación. Obtenido el 1 de setiembre de 2008 en http://blog.360.yahoo.com/blogm8EReUk8cqFoz9UqYomxTFNFosf9QPC3mg--?cq=1 K. Abbas, A. y otros. 2002. Inmunología Celular y Molecular. Mc Graw Hill. Madrid. Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 27

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PRACTICA Nº 07
Métodos Cuantitativos para el Diagnóstico de Enteroparasitosis
1. Introducción: El diagnóstico de la mayoría de las infecciones por parásitos intestinales se fundamenta sobre todo en el examen microcópico de la materia fecal y ha experimentado pocos cambios en los últimos 50 años. Sin embargo se pudieran citar algunas excepciones como son la técnica de Harada – Mori para cocprocultivos de larvas y el frotis grueso en celofán de Kato. La técnica de Kato, fue introducida en 1954 por KATO & MIURA y fue ampliamente empleada en programas de control, que se realizaron el la década del 50 en Japón. Sin embargo no se difundió su conocimiento en el mundo, hasta el año 1966, donde aparece una publicación en inglés de KOMIYA & KOBAYASHI con una evaluación de las ventajas y limitaciones del método. En 1968, aparece una publicación de MARTIN & BEAVER, donde se realiza una evaluación de la técnica y se le introducen 3 importantes modificaciones, que consistían en remover las fibras de la muestra fecal mediante un fino tamiz, la diseminación uniforme del frotis, y la prevención del sobreaclaramiento de la preparación al determinar el tiempo óptimo para la lectura. En 1972, KATZ introduce una nueva modificación, convirtiendo la técnica de gravimétrica a volumétrica y haciendo posible su empleo para trabajos de campo. Es esta forma se difunde el método por la OMS para el diagnóstico cuali-cuantitativo de las infecciones intestinales humanas por geohelmintos. Los métodos cuantitativos han sido adaptados, principalmente para determinar la intensidad de la infección por helmintos y se basan en la cuantificación del número de huevos por gramo o mg de materia fecal, estas técnicas son útiles en estudios clínicos y epidemiológicos para determinar el grado de infección y evaluar la eficacia de los tratamientos. 2. Objetivos: o Se pretende que el estudiante conozca y aplique las técnicas de recuento de estructuras parasitarias en el diagnóstico de enteroparasitosis. 3. Materiales y Procedimiento: o Materiales:     Matraz con marca a 56 ml y 60 ml Perlas de vidrio Pipeta de 1 ml graduada en centésimas (can bulbo ce caucho) Solución de NaOH 0.1 N (4g de NaOH en 1,000 ml de agua) Lámina portaobjeto. 28

 

Papel celofán transparente. Solución de kato: • • • Solución acuosa de verde de malaquita al 3% (1 ml) Glicerina (100 ml) Agua destilada (100ml)

 

Balanza Microscopio

o Procedimientos: • Técnica de Stoll Hausheer: Este método se basa en el estudio de una cantidad conocida de heces, que se diluye en un volumen determinado. Colocar en el frasco de stoll (frasco de vidrio al que se le marca a 56 ml y 60 ml) 10 perlas de vidrio. Verter una solución de hidróxido de sodio (0.1 N) hasta la marca que indica 56 mL. Luego llenar las heces hasta la marca de 60 mL. Tapar el frasco y agitar vigorosamente durante 1 minuto. Es preferible dejar en reposo por 12 a 24 horas y mezclar ocasionalmente. En el momento de hacer el recuento, se mezcla muy bien y rápidamente se quita el tapón y con la pipeta se toma 0.15 mL del centro del líquido. Colocar esta cantidad sobre una lámina en dos gotas separadas, colocarles a cada una un cubreobjeto. Contar el número de huevos existentes en las dos preparaciones. El número de huevos encontrados multiplicados por 100 da el total por gramo de heces, esto se debe a que la materia fecal esta diluida al 1:15 y el volumen estudiado es 0.15 ml. El resultado debe multiplicarse por un factor de acuerdo a la consistencia de las heces: 1: Para muestras sólidas 2: Para muestras semisólidas 3: Para muestras liquidas • Técnica de Kato – Miura: Tamizar la muestra de heces. Pesar 50 mg de heces sobre una lámina portaobjetos. 29

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Cubrir la muestra con un cuadrado de celofán transparente (22 x 22 mm) el cual previamente fue sumergido, por lo menos 24 horas en solución de Kato. Presionar para que las heces se extiendan (en una extensión circular de 10 - 20 mm de diámetro). Se da la vuelta al preparado y se presiona sobre una superficie plana en la que se ha colocado papel de filtro. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 30-45 minutos en estufa a 40°C durante 20-30 minutos, para que se aclare la muestra. El recuento se debe hacer inmediatamente pues la hiperaclaración dificulta la lectura. El número de huevos por gramos se calcula multiplicando el Nº de huevos contados por 20 y además multiplicarlo por un factor de acuerdo a consistencia de las heces.

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Técnica de Mac. Master Modificado: Homogenizar 3g de heces en 42 ml de agua. Tamizar y colocar 15 ml del filtrado en un tubo de prueba. Dejar sedimentar por 30 minutos o centrifugar a 1,000 r.p.m. durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con la solución saturada de cloruro de sodio. Homogenizar y con el gotero tomar una muestra y llenar la cámara de Mac. Master. Esperar 2 minutos. Observar y contar los huevos ubicados dentro del recuadro de lectura

Recuento En Cámara De Malassez: Esta cámara de recuento se utiliza entre otras para recuento de células en líquido lumbar o para recuento de nemátodes.

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4. Resultados (observaciones): Técnica de Stoll – Hausheer:

Sol. NaOH (0.1 N)

Pipeta de Stoll Para el conteo, llenar con la pipeta de Stoll hasta la marca 0.15

Perlas de vidrio

Agregar la sol. de NaOH hasta la marca 56 y luego completar con la muestra de heces hasta la marca 60.

Colocar en una lámina dos gotas separadas, cada una con su laminilla.

Tapar el frasco y agitar x 1 min. Luego dejar en reposo por 12 a 24 h.

Contar el número de huevos existentes en las dos preparaciones.

Realizar los cálculos

Huevos de Hymenolepis: 9

Huevos de Ascaris: 148

Nº huevos/gr = Nº huevos x 100 x factor Hymenolepis = 9 x 100 x 1 → 900 huevos/gr Ascaris = 148 x 100 x 1 → 14 800 huevos/gr

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Técnica de Kato – Miura:
Celofán 22 x 22 mm

Solución de Kato

Dejar remojar en la sol. de Kato cuadraditos de celofán x 24 h.

Pesar 50 mg de heces, luego ponerlas sobre la lámina porta objeto y apretar con los celofanes impregnados con la sol. de Kato

Observar al microscopio, realizar conteo y realizar los cálculos Dejar reposar x 30 a 45 min

Nº huevos/gr = Nº huevos x 20 x factor Ascaris = 19 x 20 x 1 → 380 huevos/gr

Huevos de Ascaris: 19

5. Referencias: Atias, A. 1996. Parasitología Mediterráneo. Santiago de Chile. Médica. Publicaciones Técnicas

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Parasitología. Métodos de diágnostico.2006. Obtenido el 1 de setiembre del 2008 en http://pdf.rincondelvago.com/parasitologia_9.html Beltrán F. de E, M; R., Tello y Náquira, C. 2003. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas Nº 37. Ministerio de Salud. Lima. Obtenido el 02 de setiembre de 2008 en http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf NUNEZ-FERNANDEZ, Fidel Ángel, SANJURJO GONZALEZ, Esperanza and VILLALVILLA, Carlos M. Finlay. Comparación de varias técnicas coproparasitológicas para el diagnóstico de geohelmintiasis intestinales. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo [online]. 1991, vol. 33, no. 5 [cited 200809-04], pp. 403-406. Available from: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003646651991000500011&lng=en&nrm=iso>. ISSN 0036-4665. doi: 10.1590/S0036-46651991000500011 32

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