UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
PRACTICA N° 4

CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA UREA

OBJETIVOS

1. Calcular la constante de Michaelis-Menten para la hidrólisis de la urea catalizada

por la ureasa.
2. Determinar la concentración sustrato por encima de la cual comienza la inhibición
irreversible de la ureasa.
3. Ilustrar el envenenamiento irreversible de la ureasa por iones plata mediante
medidas de conductividad.

TEORIA RELACIONADA

En la hidrólisis enzimática de disoluciones acuosas de urea se produce dióxido de carbono

y amoniaco. La presencia de estas especies genera un aumento de conductividad, lo cual
permite estudiar la cinética de hidrólisis de la urea mediante medidas de conductividad a
diferentes concentraciones de sustrato.

De acuerdo a Michelis-Menton, el mecanismo de la reacción catalizada considera la

formación de un intermedio enzima-sustrato ES, el cual es formado por la enzima E y el
sustrato S en una reacción de equilibrio preintermedio y su posterior descomposición en el
producto P, sin que sea alterada la enzima E. La velocidad de reacción según Michelis-
Menton para la formación de producto de concentración (C p) en el tiempo (t) se puede
expresar como:

V = dCp/dt = (K1K2CE0Cs)/(K´1 + K2 + K1Cs) (1)

Donde: KM = (K´1 + K2)/K1 es la constante de Michelis-Menton.

CE0 = concentración de la enzima libre + concentración del complejo enzima-sustrato.
Cs es la concentración del sustrato.

Diversos tratamientos han sido usados para la determinación de la constante de Michelis-

Menton de una enzima. Lineweaver-burk expresa la ecuación (1) de la forma:
1/V = 1/K2 + (KM/K2) .1/Cs (2)

De acuerdo a la ecuación (2) un gráfico de 1/V contra 1/C s permite calcular K2 a partir de la
ordenada en el origen y KM/K2 como la pendiente de línea recta, con la consecuente
determinación de KM.

Mediante la adición de un exceso de sustrato, la enzima puede ser inhibida, mientras que
por adición de un inhibidor apropiado, la enzima puede ser envenenada, cesando
irreversiblemente la conversión del sustrato.

MATERIALES

9 matraces aforados de 100 mL

Matraz aforado de 10 mL
Vaso de precipitados de 50 mL
Vaso de precipitados de 100 mL
Agitador magnético
Conductímetro
Pipeta de 50 µL
Soporte universal
Pinza para soporte
Espátula
Agua destilada
Ureasa al 0.2% en glicerina
Urea

PROCEDIMIENTO

1. Determinación de la constante de Michelis-Menton.

Preparar 100 mL de soluciones de urea: 0.4%, 0.2 %, 0.1%, 0.05%, 0.025, 0.0125%.

Agregar 40 mL de la solución de urea respectiva en un vaso de 100 mL, introducir la

pastilla magnética y comenzar la agitación. Introducir el electrodo de conductividad y luego
agregar 50 µL de solución de ureasa, a partir de este momento realizar las lecturas de
conductividad a los 100 y 200 segundos. Proceder del mismo modo para cada una de las 6
soluciones; la diferencia entre los valores de conductividad a los 100 y 200 segundos
dividido entre 100 segundos, representa la velocidad de reacción y tiene unidades de
µS/cm.s. Grafique dCp/dt (µS/cm.s) contra Cs(mmol/L), al igual que la representación de
Lineweaver-burk (ecuación 2). Cual es el valor de la constante de Michelis-Menton para la
ureasa?
2. Determinación de la inhibición de sustrato.

Preparar 100 mL de soluciones de urea: 1.6 %, 0.8%, 0.4%, 0.2 %, 0.1%, 0.05%, 0.025,
0.0125%.

Agregar 40 mL de la solución de urea respectiva en un vaso de 100 mL, introducir la

pastilla magnética y comenzar la agitación. Introducir el electrodo de conductividad y luego
agregar 50 µL de solución de ureasa, a partir de este momento realizar las lecturas de
conductividad a los 100 y 200 segundos. Proceder del mismo modo para cada una de las 8
soluciones. Grafique dCp/dt (µS/cm.s) contra Cs(mmol/L), cual es la concentración sustrato
por encima de la cual comienza la inhibición irreversible de la ureasa?

3. Envenenamiento de la enzima.

Colocar inicialmente 40 ml de solución de urea al 1.6 % en un vaso de 100 mL, introducir

la pastilla magnética y comenzar la agitación. Introducir el electrodo de conductividad y
luego agregar 50 µL de solución de ureasa. Realizar las mediciones de conductividad cada
100 segundos. Después de haber pasado 5 minutos, agregar 1 mL de solución al 1% de
nitrato de plata, a partir de este momento, seguir realizando las mediciones cada 100
segundos hasta haber transcurrido 600 segundos. Grafique dCp/dt (µS/cm.s) contra t.
analice el comportamiento del gráfico.

Bibliografía

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2005.

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Anzola, Cecilia y López, E. Guías de laboratorio de Bioquímica. Universidad Nacional

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Chechetkin, A.V. et al. Practicas de bioquímica del ganado y aves de corral. Editorial
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