PRÁCTICA 5.

SEPARACIÓN DE MEZCLAS, TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS FOLIARES

1. INTRODUCCIÓN

En la naturaleza las sustancias puras (los compuestos y los elementos) se encuentran

mezcladas o conteniendo pequeñas impurezas que a veces es necesario eliminar. Esta es
una actividad que involucra cristalería, equipo y solventes, así como principios físicos y
químicos importantes de conocer, por lo que esta práctica se enfocará en las
características de los solventes y los distintos métodos de separación de mezclas;
específicamente en la extracción y separación de pigmentos foliares presentes en las
plantas.

Los pigmentos son compuestos químicos que absorben luz en el intervalo de longitud de
onda de la región visible. Los pigmentos foliares cumplen funciones vitales como la
fotosíntesis, un proceso Único de conversión energética así también los pigmentos pueden
fungir como sustancias de reserva o almacén de energía en forma de carbohidratos. El
termino cromatografía se define como el procedimiento de separar un extracto vegetal a
través de una columna rellena con carbonato de calcio, sin embargo, con el paso del
tiempo se han empleado otras fuentes de materiales en lugar de las tradicionales
columnas. En esta ocasion el estudiante realizara la separación mediante cromatografía
sobre papel de los pigmentos fotosintéticos en general.

2. OBJETIVOS

❖ Establecer los criterios físicos o químicos utilizados para seleccionar la técnica

más adecuada de separación de una mezcla de pigmentos foliares.

❖ Establecer el fundamento químico para seleccionar y utilizar un solvente

extractor.

❖ Identificar de acuerdo a su coloración los diferentes pigmentos foliares.

3. MARCO TEÓRICO

Separación de mezclas

Los quimicos estan interesados en la composicion de la materia la cual comprende las

sustancias, las mezclas, los elementos y los compuestos (Silberberg et al., 2000). Una
mezcla es una combinación de dos o más sustancias en la cual cada una conserva sus
propiedades características (Chang,
2022). En ciertas ocasiones es
necesario separar los componentes de
una mezcla en fracciones individuales,
las cuales pueden diferenciarse entre sí
por el tamaño de las partículas, por su
estado, por su composición química o
por cualquier otra característica que se
desprende como consecuencia de las
anteriores (densidad, solubilidad, etc)
(Pérez Morales, RA. 2011).
Figura. Estados de la materia (Agua)

Para separar las fracciones de una mezcla se han desarrollado un gran número de
métodos, por lo que es necesario aclarar que en esta práctica no se estudiarán todas estas
técnicas, sino que únicamente aquellas que estén implicadas en la obtención y separación
de pigmentos foliares. En el fundamento teórico se hará énfasis en estos procesos. (Pérez
Morales, RA. 2011)

De forma general, los métodos para separar los componentes de las mezclas
son de dos tipos:
Métodos de separación por difusión

Este grupo de técnicas se basan en la transferencia de material desde una fase

homogénea a otra, utilizan como fuerza impulsora diferencias (también llamados
gradientes) de presión de vapor o de solubilidad. Dentro de estos métodos se puede
mencionar los siguientes: Destilación, absorción de gases, deshumidificación, diferentes
tipos de extracciones y la cristalización.
La extracción

La separación de un compuesto por extracción se basa en la transferencia selectiva del

compuesto desde una mezcla sólida o líquida con otros compuestos hacia una fase líquida
(normalmente un disolvente orgánico) (Universidad Nacional de La Plata, 2020). El
objetivo de esta operación es el de separar una sustancia del material sólido o líquido que
la contiene con el uso de solventes para después purificarla. La extracción se basa en la
transferencia selectiva o libre distribución de la fracción a separar desde la mezcla (sólida
o líquida) hacia una fase líquida (solvente o conjunto de solventes), por lo que la eficiencia
de la técnica depende de la diferencia de solubilidad de cada fracción en el solvente.

La extracción puede clasificarse dependiendo del estado físico de los materiales: sólido-
líquido o líquido-líquido, o bien por la característica de
recirculación del solvente: continua (cuando el solvente
circula una y otra vez como en la extracción soxhlet) o
discontinua (cuando el solvente no circula como en la
extracción utilizando ampolla de decantación).

En la extracción líquido-líquido se trata una mezcla líquida

con un solvente que disuelve preferentemente a uno o más
componentes de la mezcla. La mezcla tratada en esta forma
se llama refinado y la fase rica en disolvente recibe el
nombre de extracto.
Figura. Metodo de decantacion

El componente que se transmite desde el refinado hacia el extracto es el soluto, y el

componente que queda en el refinado es el diluyente. En la extracción sólido-líquido el
material soluble contenido en una mezcla con un sólido inerte se diluye en un disolvente

líquido.
Figura. Esquema de una etapa de extracción sólido-líquido. Fuente: (Castelló Gómez, M et al., 2020)

Se emplea también el término maceración para hacer referencia al proceso de extracción

sólido-líquido, sin embargo, se utiliza con mayor frecuencia cuando se quiere denotar
aquella extracción sólido-líquido en la cual se sumerge material vegetal en un disolvente,
que generalmente es agua, durante un lapso más o menos largo para extraer principios
activos (Pérez Morales, RA. 2011).

Tabla. solutos extraídos en función del alimento y el disolvente

Fuente: (Castelló Gómez, M et al., 2020)

En la extracción sólido-líquido se requiere

que el material sólido se reduzca a partes
pequeñas mediante la aplicación de presión
utilizando molino o mortero/pistilo. La
importancia de reducir el tamaño o
desintegrar hasta partículas, no consiste
solamente en obtener trozos pequeños a
partir de los grandes, o tener un producto
que posea determinado tamaño granular,
sino más bien el efecto que tiene tamaño de
la partícula sobre la velocidad de reacción.
Figura. Maceración de material vegetal

En la mayoría de las reacciones sobre partículas sólidas la velocidad es directamente

proporcional al área de contacto entre fases e inversamente proporcional al tamaño de las
partículas; la reducción de tamaño se lleva a cabo principalmente para aumentar el área
de contacto y con esto aumentar también la velocidad de reacción. (Pérez Morales, RA.
2011)

Métodos de separación mecánica

Estas técnicas se basan en diferencias físicas entre las partículas, tales como el tamaño, la
forma o la densidad, facilidad de mojado, propiedades eléctricas o magnéticas. Se aplican
para separar líquidos de líquidos, sólidos de gases, líquidos de gases, sólidos de sólidos y
sólidos de líquidos. Dentro de estas técnicas se encuentra el tamizado, la filtración y los
métodos de sedimentación por gravedad. (Pérez Morales, RA. 2011)

Filtración

La filtración es la separación de partículas

sólidas contenidas en un fluido, pasándolo
a través de un medio filtrante, sobre el
que se depositan los sólidos. El fluido
puede ser un líquido o un gas; las
partículas sólidas pueden ser gruesas o
finas, rígidas o flexibles, redondas o
alargadas, separadas o agregados. (Pérez
Morales, RA. 2011)
Figura. Separación de mezclas por filtración

Decantación
La decantación se utiliza para separar dos tipos de mezclas: un líquido de un sólido
insoluble o un líquido de otro líquido insoluble. En el primer caso, para separar un líquido
de un sólido insoluble, se deja reposar la mezcla, la fracción insoluble se sedimentan por
gravedad y luego el líquido (llamado
sobrenadante) se separa del sólido
(llamado sedimento) depositado en el
fondo del recipiente. Cuando la mezcla
está conformada por líquidos
inmiscibles y de diferente densidad, se
separan utilizando la ampolla de
decantación (Pérez Morales, RA. 2011).
Figura. Separación de mezclas por decantación

La ampolla de decantación recipiente de vidrio con

forma de pera invertida o cono invertido. Se utiliza
principalmente para separar líquidos inmiscibles, o
insolubles (no se mezclan) que se separan, por
diferencia de densidades y propiedades
moleculares que estos líquidos poseen. La cual
mediante un tiempo se apartan en dos o más
fracciones dependiendo de la cantidad de
productos contenidos al interior del recipiente.
(Pérez Morales, RA. 2011)
Figura. Diseños de ampollas de decantación

Centrifugación
Es una decantación selectiva de los componentes insolubles de una mezcla bajo
condiciones de aceleración centrífuga en lugar de la aceleración debida a la gravedad. La
fuerza centrífuga es provista por una máquina llamada centrifugadora o centrífuga, la cual
proporciona a la mezcla un
movimiento de rotación que origina
una fuerza que produce la
sedimentación de los sólidos o de las
partículas de mayor densidad. (Pérez
Morales, RA. 2011)

Figura. Separación de mezclas por centrifugación

Para eso se coloca la mezcla dentro de un aparato

llamado centrífuga que tiene un movimiento de
rotación constante y rápido, lo cual hace que las
partículas de mayor densidad vayan al fondo y las
más livianas queden en la parte superior (Universidad
Nacional Autónoma de México, 2020).
Fig 1. Fases para la obtención del
sobrenadante y el precipitado.

Características de los solventes

Cómo se mencionó anteriormente la eficiencia de la extracción depende de la diferencia de

solubilidad de cada fracción en el solvente extractor. Esta capacidad de solubilidad es
afectada por varios factores como por ejemplo la temperatura (en la mayoría de los casos
las sustancias son más solubles en un solvente caliente que en el mismo solvente, pero
frío).

Otro factor importante lo constituyen las interacciones entre el solvente y el soluto (el
soluto es la fracción que se va a disolver) que van desde los puentes de hidrógeno, las
fuerzas de dispersión, los procesos de solvatación hasta el efecto de iones comunes. Sin
embargo, existe una propiedad que también es importante y que afecta la solubilidad,
esta característica hace referencia a las polaridades tanto del solvente como de la fracción
que se desea separar. (Pérez Morales, RA. 2011)

En ciertas moléculas, debido al continuo movimiento de los electrones (cargas negativas)

dentro éstas, como también debido a la geometría de la molécula y a la electronegatividad
de los átomos componentes, se puede provocar en un momento dado, la generación de
regiones con exceso de electrones (carga parcial negativa) y regiones con deficiencia de
electrones (carga parcial positiva). Se dice que una molécula que presenta cargas
parciales positivas y
negativas es una molécula
polar. Mientras que a las
sustancias que, por su
homogénea distribución de
cargas, es decir, carecen
de cargas parciales se les
llama apolares.
Figura. Capa de solvatación para los iones Cl- y Na+

La polaridad es muy importante cuando se analizan aspectos de solubilidad debido a que

se tiene como principio básico en las extracciones que “lo similar disuelve lo similar”,
por lo que solventes fuertemente polares disolverán fracciones polares o iónicas mientras
que solventes apolares disolverán sustancias poco polares. Un ejemplo de un solvente
polar es el agua mientras que dentro de los solventes
apolares se tiene el hexano, el tetracloruro de carbono, el
éter de petróleo. Existen solventes que pueden estar entre
los rangos de fuertemente apolar y fuertemente polar
como por ejemplo el etanol. (Pérez Morales, RA. 2011)

Figura. Polaridad de la molecula de agua

Pigmentos vegetales y su extracción

La biosfera recibe radiación solar comprendida entre los 290 nm y los 3000 nm de longitud
de onda, pero básicamente la mayor proporción de la energía (45%) está concentrada
entre los 380 nm y los 710 nm, que constituye el rango de absorción de las clorofilas y los
pigmentos accesorios (Larcher, 1995). La fotosíntesis es el proceso bioquímico mediante el
cual las plantas absorber luz, toman dióxido de carbono y agua, para formar g LÚCidos
(azÚCares) así como compuestos de reducción como NADPH (nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato reducido) y compuestos de fósforo altamente energéticos como el
ATP (trifosfato de adenosina). Esta absorción depende de varios pigmentos, como las
clorofilas, carotenos y otros que se encuentran principalmente en los cloroplastos de las
hojas. Los pigmentos se encuentran
contenidos en unos compartimientos
celulares conocidos como plastidios y
son visibles en el citoplasma celular.
(Pérez Morales, RA. 2011)

Fig 2. Estructura de la célula vegetal

Dentro de estos se encuentran un tipo de

plastidios denominados cloroplastos,
que contienen: clorofila a (verde-azulado)
y clorofila b (verde claro). Mientras que
los carotenoides tipo carotenos (amarillo
claro) y xantofilas (amarillo- naranja) se
encuentran en los cromoplastos. Todos
estos pigmentos fotosintéticos se
encuentran en distintas proporciones en los vegetales, lo que le otorga su coloración
característica. (Pérez Morales, RA. 2011)
 Fig 3. Diversidad de plastidios

Los pigmentos foliares que se estudiarán en esa práctica son los siguientes:
Clorofilas

Son pigmentos fotosintéticos cuya

estructura está constituida por un
tetrapirrol cerrado con varios
sustituyentes laterales. El anillo
tetrapirrólico contiene un ión Mg2+ en el
centro formando un complejo con los
nitrógenos de dicho nÚCleo y un sistema
de dobles enlaces conjugados, Ninguna
de las clorofilas absorbe las longitudes
de onda correspondientes al color verde,
lo que les da su color característico.
Fig. Estructura de la clorofila, diferencia entre clorofila a
y b (UNAM, 2015).

Existen dos tipos básicos de clorofila: la clorofila a y la clorofila b. Químicamente son muy
similares variando en un sustituyente, lo cual ocasiona que la clorofila a produzca una
pigmentación un tanto más verde azul que el tipo b. Además, la clorofila a se encuentra
en todos los organismos fotoautótrofos mientras que la clorofila b es exclusiva de las
plantas superiores. Las clorofilas se encuentran en los cloroplastos de células foliares.
(Pérez Morales, RA. 2011).

Carotenoides

Son moléculas hidrocarbonadas (formadas por hidrógeno y carbono) de 40 átomos de

carbono, las cuales poseen sistemas conjugados de dobles enlaces. Los carotenoides que
participan en la fotosíntesis son de dos tipos: tipo caroteno y tipo xantofila.

Los carotenoides tipo caroteno constan exclusivamente de carbono e hidrógeno y

proporcionan generalmente una
pigmentación naranja. Los carotenoides
tipo xantofila contienen oxígeno además de
carbono e hidrógeno y proporcionan una
coloración amarilla. Los carotenoides son
pigmentos accesorios en la fotosíntesis que
se encuentran en los cloroplastos de células
foliares. (Pérez Morales, RA. 2011)
Fig. : Estructura de carotenoides, diferencia entre
Xantófilas y carotenos.

Antocianinas

Químicamente las antocianinas son glucósidos libres de nitrógeno disueltos en las vacuolas
de las células de flores, hojas o frutos y que les proporcionan una pigmentación roja,
púrpura o azul a estos órganos.

La extracción de los pigmentos de hojas resulta mejor cuando se les tritura en solventes
como acetona o etanol. Después de la filtración, se obtiene una solución de color verde.

Al tomar en cuenta las distintas polaridades entre los pigmentos foliares que se
encuentran disueltos en el extracto, se puede hacer uso de una serie de solventes que
también presenten polaridades diferentes para lograr la separación de cada fracción
(clorofilas, carotenoides y antocianinas). (Pérez Morales, RA. 2011),
 Fig 4. Pigmentos foliares en papel
filtro utilizado durante el proceso de filtración

Cristalería a utilizar para la separación de los pigmentos

Erlenmeyer
Se utiliza para contener líquido y para realizar
reacciones químicas. Su forma geométrica reduce las
posibles proyecciones de material al exterior, la posible
pérdida de material por evaporación y la posibilidad de
colocarle un tapón de vidrio esmerilado, por lo que se
utiliza bastante en el laboratorio. Suele tener marcas
para saber aproximadamente el volumen de líquido.
Se puede calentar (Pérez Morales, RA. 2011).
Figura. Matraces de erlenmeyer con
capacidad de 50, 125 y 250 mL.