UNIVERSIDAD LIBRE, FACULTAD DE SALUD, PROGRMA DE

MEDICINA
CURSO DE BIOLOGIA MOLECULAR
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7. Por PCR se amplificó un segmento del gen de la -globina de 800 kpb. El mismo contiene una secuencia de
corte por SmaI a 400 kpb del extremo 5´, y otra secuencia de corte por Eco RI a 700 kpb desde el extremo 5´.
a) Dibuje en el esquema cuál sería la distribución de bandas en un gel teñido con bromuro de etidio, donde en
cada calle se corrió el fragmento sin cortar o los productos obtenidos luego de cortar el mismo con Sma I, Eco
RI y con las dos enzimas: SmaI + Eco RI.
• carril 1: SmaI
• carril 2: Eco RI
• carril 3: SmaI + Eco RI
• carril 4: Fragmento sin cortar
calle 1

-
1000

-800

-600

-400

-200

-100

DESARROLLO

1. A. EcoRI es una enzima de restricción producida por el microorganismo Escherichia

coli que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de
una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad
catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

La enzima de restricción EcoRI reconoce los sitios G^AATTC y corta mejor a una
temperatura de 37 °C en su propio tampón exclusivo.
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Origen bacteriano:

E: Escherichia
Co: Coli
R: Cepa RV 13
I: Primera endonucleasa
aislada de esta cepa

Sitio de reconocimiento:
5´ GAATTC 3´
3´ CTTAAG 5´

B. BamHI es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo

Bacillus amyloliquefaciens que posee una diana de restricción en el ADN de
cadena doble dependiente de una secuencia no metilada, palindrómica y
asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos
cohesivos.

Origen bacteriano:

B: Bacillus
Am: Amyloloquefaciens
H: Cepa H
I: Primer Enzima

Sitio de reconocimiento:

5´ GGATCC 3´
3´ CCTAGG 5

C. HindIII es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo

Haemophilus influenzae que posee una diana de restricción en el ADN de cadena
doble dependiente de una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre
la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

ORIGEN BACTERIANO:
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H: Haemophilus
in: influenzae
d: Cepa DSM 1121
III: Tercera endonucleasa en
este organismo
SITIO DE RECONOCIMIENTO:

5´ AAGCTT 3´
3´ TTCGAA 5´

D. PstI es una enzima de restricción producida por el microorganismo Providencia

stuartii que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble
dependiente de una secuencia no metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la
cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

ORIGEN BACTERIANO:

P: Providencia
st: stuartii
I: Primera enzima

SITIO DE RECONOCIMIENTO:
5´ CTGCAG 3´
3´ GACGTC 5´

E. La enzima de restricción PvuII reconoce los sitios CAG^CTG y corta mejor a

37 °C utilizando el tampón G.

ORIGEN BACTERIANO:

P: Proteus
vu: Vulgaris
I: Primera enzima

SITIO DE RECONOCIMIENTO:
5´ CGATCG 3´
3´ GCTAGC 5´
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F. BglII es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo

Bacillus globiggi que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble
dependiente de una secuencia no metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la
cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

ORIGEN BACTERIANO:

B: Genero Bacillus
b: Especie Globiggi
III: Tercera enzima

SITIO DE RECONOCIMIENTO:
5´ AGATCT 3´
3´ TCTAGA 5´

G. SmaI es una enzima de restricción de tipo II (EC 3.1.21.4) producida por el

microorganismo Serratia marcescens que posee una diana de restricción en el
ADN de cadena doble dependiente de una secuencia no metilada, palindrómica
y no escalonada, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos
romos.

ORIGEN BACTERIANO:

S: Serratia
sa: marceescens
I: Primera enzima

SITIO DE RECONOCIMIENTO:
5´ CCCGGG 3´
3´ GGGCCC 5

2. ecoRI
BamHI

5´ TAGAATTCGACGGATCCGGGGCATGCAGATCA 3´
3´ ATCTTAAGCTGCCTAGGCCCCGTACGTCTAGT 5

3. El tamaño del plasmido es de 6kb

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b. Se van a generar dos fragmentos nuevos a partir de la enzima X

- 1200 kb
- 5300 kb
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4.

Pozo Enzimas utilizadas por cada pozo

1 BamHI + HindIII
2 Pst 1 + HindIII
3 Pst 1 + HiandIII
4 Pst 1 + BamHI
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5 Pst 1 + BamHI + HindIII

6 HindIII

5.Las enzimas de restricción son endonucleasas que cortan el ADN en ambas cadenas
en
secuencias específicas, el fragmento de ADN más pequeño generado en una
reacción
representa la distancia más corta entre dos sitios de corte. Las enzimas de restricción
pueden
reconocer una secuencia que presente cuatro bases, las cuales cortaran con mayor
frecuencia
que las que tiene la posibilidad de reconocer una secuencia de más bases.

- La ECORI: Es una enzima de restricción tipo II, por lo que reconocen

secuencias
palindrómicas → Frecuencia de corte: 6 Bases, con la probabilidad de ocurrir cada 4.096pb

- La HAEIII: Es una enzima de restricción tipo II → Frecuencia de corte: 4 Bases con la

probabilidad de ocurrir cada 256pb

Por lo tanto, una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de presentarse en un genoma

cada 256 pb [44=256]; en cambio una secuencia de 6 bases posee la probabilidad de darse
en un genoma cada 4096 pb [4 =4096].

6.El error del investigador fue mezclar las dos enzimas, ya que tienen diferentes sitios de
corte y una de ellas puede afectar los sitios de la otra, en este caso al utilizar primero BamHI
cortara parte de la secuencia que es leida por PuvI, en consecuencia, se verán afectados
los puntos de corte de esta última enzima lo que conlleva a que la secuencia no se fragmente
de la manera correcta y por esto ocurre el error inicial. Posterior al utilizar primero la enzima
PuvI esta no toma ningún fragmento de la enzima BamHI evitando que se forme un error de
correspondencia de bases.

Secuencia Incorrecta
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Secuencia correcta

7.